朱麗明 那學(xué)武 李海洲

喉癌是一種常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，好發(fā)于40歲以上男性，以聲門(mén)上型和聲門(mén)型多見(jiàn)，又以鱗癌為常見(jiàn)組織學(xué)類型[1]。目前喉癌的主要治療手段仍為手術(shù)切除，早期喉癌術(shù)后患者預(yù)后通常較好，5年生存率遠(yuǎn)高于晚期患者[2]，且早期喉癌可行喉顯微激光手術(shù)切除，與傳統(tǒng)開(kāi)放手術(shù)相比具有創(chuàng)傷小、恢復(fù)快、并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，患者無(wú)病生存率顯著上升[3]。而晚期患者通常只能行開(kāi)放手術(shù)或無(wú)法手術(shù)，患者生存質(zhì)量明顯下降。若能在喉癌早期對(duì)其進(jìn)行診斷和治療，可以大大提升患者生存質(zhì)量。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Hippo通路在腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。Hippo通路最早發(fā)現(xiàn)于果蠅體內(nèi)，具有高度保守的特點(diǎn)，在調(diào)控細(xì)胞增殖、促進(jìn)組織再生等生命活動(dòng)中發(fā)揮作用[4]。YAP蛋白是Hippo通路的重要效應(yīng)器，和其旁系同源TAZ蛋白共同構(gòu)成Hippo通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄共刺激分子[5]。YAP、TAZ在腫瘤中過(guò)表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)，被認(rèn)為是多種腫瘤的促癌基因[6]。研究表明多種腫瘤疾病中存在Hippo通路失活及YAP、TAZ高表達(dá)[7]，但其在喉癌中作用尚不明確。本研究旨在探討喉癌中YAP、TAZ的表達(dá)水平及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2012年3月至2015年3月于我院耳鼻咽喉頭頸外科就診的77例喉癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織和正常癌旁組織。患者中男性66例、女性11例；年齡33歲～76歲，其中≥60歲43例，<60歲34例；聲門(mén)型57例，聲門(mén)上型20例；高分化13例，中分化38例，低分化26例；腫瘤直徑<2 cm者21例，≥2 cm者56例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者53例；根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)合會(huì)UICCTNM分期標(biāo)準(zhǔn)(2002)進(jìn)行分期，Ⅰ、Ⅱ期41例，Ⅲ、Ⅳ期36例。所有腫瘤組織經(jīng)病理科驗(yàn)證均為鱗癌，患者均為首次發(fā)病，未接受化療、放療、靶向治療和生物免疫治療。本研究所有研究對(duì)象均簽署對(duì)研究的知情同意書(shū)并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 免疫組化法檢測(cè)組織中蛋白表達(dá)

組織蠟塊脫蠟水化，修復(fù)抗原，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后滴加H2O2浸泡15 min，PBS沖洗后滴加山羊血清封閉，滴加一抗(YAP、TAZ一抗均購(gòu)自美國(guó)BD生物公司，1∶200稀釋)，置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜。次日PBS沖洗3次，室溫下滴加二抗孵育1 h，PBS沖洗后DAB顯色后蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判定

采用雙盲法評(píng)估結(jié)果，細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核染為黃色、棕色或褐色記為陽(yáng)性，每張切片選擇5個(gè)高倍鏡下視野(×200)，實(shí)用半量免疫評(píng)分法評(píng)價(jià)結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞占比：≤10%，記0分；>10%～25%，記1分；>25%～50%，記2分；>50%～75%，記3分；>75%，記4分。染色強(qiáng)度：黃色記1分、棕色記2分、褐色記3分。陽(yáng)性細(xì)胞占比和染色強(qiáng)度相加，0～3分記為低表達(dá)，>3分記為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析，比較蛋白表達(dá)差異采用χ2檢驗(yàn)，蛋白表達(dá)與喉癌臨床病理因素的關(guān)系采用Fisher’s檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman法，采用Kaplan-Meier生存曲線對(duì)患者生存情況進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YAP、TAZ蛋白在喉組織中的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示喉癌組織中YAP蛋白高表達(dá)率為85.7%，高于正常癌旁組織的23.4%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；TAZ蛋白高表達(dá)率為81.8%，高于正常癌旁組織的27.3%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 YAP、TAZ蛋白在不同組織的表達(dá)情況(例，%)

2.2 YAP、TAZ蛋白表達(dá)與喉癌臨床因素的關(guān)系

患者組織中YAP、TAZ蛋白表達(dá)水平與患者年齡、性別和腫瘤解剖位置無(wú)關(guān)(P>0.05)，與患者腫瘤分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、分化程度相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 YAP、TAZ蛋白表達(dá)與臨床因素的關(guān)系/例

2.3 喉癌組織中YAP、TAZ蛋白的相關(guān)性

YAP高表達(dá)的66例喉癌患者組織中，有41例同時(shí)存在TAZ高表達(dá)。Spearman相關(guān)分析顯示YAP表達(dá)與TAZ呈正相關(guān)(γ=0.244，P=0.025)。

2.4 YAP、TAZ蛋白與喉癌患者預(yù)后的關(guān)系

本研究中77例喉癌患者5年隨訪存活61例，死亡13例，失訪3例，5年存活率79.2%。本研究使用總生存時(shí)間作為患者的預(yù)后指標(biāo)，所有死亡患者均死于喉癌及并發(fā)癥，無(wú)其他原因?qū)е碌幕颊咚劳觥?6例YAP高表達(dá)喉癌患者中存活51例，死亡12例，失訪3例；11例YAP低表達(dá)喉癌患者中存活10例，死亡1例，無(wú)失訪。63例TAZ高表達(dá)喉癌患者中存活49例，死亡12例，失訪2例；14例TAZ低表達(dá)喉癌患者中存活12例，死亡1例，失訪1例。使用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示YAP、TAZ高表達(dá)患者5年生存率明顯低于低表達(dá)患者(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 YAP、TAZ蛋白與喉癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

喉癌是一種常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，以鱗癌多發(fā)，占所有患者的95%以上。喉癌的發(fā)生與多種因素相關(guān)，吸煙、飲酒、遺傳因素和HPV感染均能導(dǎo)致喉癌的發(fā)生[8]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，腫瘤精準(zhǔn)治療能夠大大提升早期喉癌患者的生存率[9]，但對(duì)晚期患者治療效果仍不明顯，且晚期喉癌易復(fù)發(fā)，常需要再行喉全切術(shù)，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量[10]，而目前還沒(méi)有監(jiān)測(cè)晚期喉癌患者預(yù)后的特異性指標(biāo)。近年來(lái)腫瘤分子標(biāo)志物的研究受到廣泛關(guān)注，若發(fā)現(xiàn)與喉癌發(fā)病及預(yù)后相關(guān)的分子指標(biāo)，就能夠?qū)戆┻M(jìn)行早期診斷或有效監(jiān)測(cè)患者預(yù)后，有利于喉癌的診治。

Hippo通路自發(fā)現(xiàn)以來(lái)被證實(shí)存在于多種哺乳動(dòng)物體內(nèi)，有研究表明其在調(diào)節(jié)器官大小、免疫穩(wěn)態(tài)和組織修復(fù)等多種生命活動(dòng)中發(fā)揮作用[11]。在腫瘤中Hippo通路常作為抑癌基因調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，通過(guò)磷酸化途徑抑制組織生長(zhǎng)速度，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期[12]。Hippo通路調(diào)控生命活動(dòng)十分依賴其核心效應(yīng)器YAP/TAZ的轉(zhuǎn)錄活性，通常情況下Hippo通路相關(guān)激酶抑制了YAP/TAZ的活性，但這種抑制關(guān)系在多種腫瘤中被解除[13]。研究表明許多腫瘤疾病中均存在Hippo通路相關(guān)基因缺失或表達(dá)異常，導(dǎo)致YAP、TAZ的高表達(dá)[14]，而YAP/TAZ具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡作用，并在調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞發(fā)育的過(guò)程中扮演重要角色[15]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，YAP/TAZ還通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，結(jié)腸癌中YAP能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞像M2表型極化，抑制機(jī)體抗腫瘤免疫[16]，而在前列腺癌中YAP/TAZ能夠耗竭體內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞完成免疫逃逸[17]。還有研究表明在乳腺癌中YAP/TAZ能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲能力[18]，而在肝癌、肺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中YAP/TAZ的高表達(dá)常被視作疾病預(yù)后不良的指標(biāo)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)喉癌患者腫瘤組織中YAP/TAZ表達(dá)水平顯著高于正常癌旁組織(P<0.001)，可能與喉癌的發(fā)病相關(guān)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]。腫瘤組織中YAP/TAZ表達(dá)與患者疾病預(yù)后相關(guān)(P<0.05)，可能作為監(jiān)測(cè)喉癌預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)發(fā)揮作用。

相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)喉癌組織中YAP表達(dá)與TAZ呈正相關(guān)(γ=0.244，P=0.025)，提示YAP/TAZ可能通過(guò)聯(lián)合途徑參與喉癌的發(fā)生發(fā)展。喉癌患者組織中YAP、TAZ蛋白表達(dá)水平與患者年齡、性別和腫瘤解剖位置無(wú)關(guān)(P>0.05)，與患者腫瘤分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、分化程度相關(guān)(P<0.05)，提示YAP、TAZ參與了喉癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究通過(guò)檢測(cè)喉癌患者組織及癌旁正常組織中YAP、TAZ的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)YAP、TAZ與喉癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，提示YAP、TAZ的表達(dá)能夠在監(jiān)測(cè)患者預(yù)后中發(fā)揮作用。YAP和TAZ在喉癌組織中表達(dá)強(qiáng)度具有相關(guān)性，但二者在喉癌中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。