武 睿，陳 垣，郭鳳霞，周 洋，焦旭升

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅省中藥材規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省藥用植物栽培育種工程研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)定西校區(qū)，甘肅 定西 743000)

甘肅貝母(FritillariaprzewalskiiMaxim.)屬百合科多年生草本植物，是中藥川貝母(FritillariaeCirrhosaeBulbs)的基源植物之一，干燥鱗莖入藥，俗稱“岷貝”，具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳、散結(jié)消癰等多種功效[1]。野生資源分布區(qū)域極其狹窄，主要分布在青藏高原2 400～4 300 m的高山草叢中，生態(tài)環(huán)境脆弱，海拔高，氣候寒冷，晝夜溫差大、紫外輻射強(qiáng)、無霜期短，導(dǎo)致甘肅貝母野生種群自然更新速度緩慢[2]，加之需求量不斷增加、過量的采集和生境惡化等原因的影響，其野生資源蘊(yùn)藏量急劇下降，瀕臨滅絕，被《中國(guó)珍稀瀕危植物名錄》列為國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物[3]，人工馴化栽培成為保護(hù)甘肅貝母野生資源和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要手段。然而，在栽培過程中，隨著貝母生長(zhǎng)年限的增加，加之田間管理不善，藥材質(zhì)量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，品質(zhì)退化較為嚴(yán)重[4]。此外，我們團(tuán)隊(duì)在2016—2019年的連續(xù)4年的大田觀察中還發(fā)現(xiàn)，由于各種原因?qū)е碌母拭C貝母返青率也隨生長(zhǎng)年限的增加而加重，個(gè)別地塊返青率不到20%，嚴(yán)重影響甘肅貝母的生產(chǎn)，表現(xiàn)出明顯的連作障礙(continuous monoculture problem)。研究者們同樣發(fā)現(xiàn)約有70%以上的藥用植物[5]，尤其是根及根莖類藥材，如人參[6]、當(dāng)歸[7]、地黃[8]及山藥[9]等連續(xù)在同一塊田地上種植后均會(huì)出現(xiàn)土壤微生態(tài)環(huán)境惡化、自身生長(zhǎng)發(fā)育不良、產(chǎn)量與藥用品質(zhì)下降等現(xiàn)象。近年來研究還發(fā)現(xiàn)根際微生態(tài)失調(diào)、微生物種群結(jié)構(gòu)的失衡可能是連作障礙發(fā)生的主要影響因子[10-12]。因此，探究甘肅貝母連作障礙發(fā)生機(jī)理與控制技術(shù)是一項(xiàng)亟待解決的問題。

根際土壤微生物被稱為植物的第二個(gè)基因組[11]，在維持土壤功能和生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)性中起著至關(guān)重要的作用，參與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)、有機(jī)質(zhì)分解、土壤腐殖質(zhì)形成、土壤結(jié)構(gòu)維持、溫室氣體產(chǎn)生和環(huán)境污染物凈化[12-16]，通常被認(rèn)為是土壤健康的敏感生物學(xué)指標(biāo)[17-18]。同時(shí)，土壤養(yǎng)分也為土壤微生物提供了生長(zhǎng)環(huán)境及能量，使得土壤質(zhì)量可通過微生物數(shù)量的變化而體現(xiàn)[19]。根際微生物群落的多樣性和組成的變化被認(rèn)為與生物和非生物因素的變化有關(guān)，例如種植系統(tǒng)、植物種類和土壤特性[20]。細(xì)菌是土壤微生物中分布最廣、數(shù)量最多的部分[21]，占土壤微生物總數(shù)的70%～90%，是土壤養(yǎng)分變化的敏感指標(biāo)之一[22]。研究微生物群落組成及多樣性一直是揭示植物-微生物互作關(guān)系機(jī)制的熱點(diǎn)問題。目前高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，提高了研究者對(duì)環(huán)境中微生物群落組成和功能的認(rèn)知。因此，研究不同生長(zhǎng)年限土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律，對(duì)選擇合理種植措施和改善土壤生態(tài)功能具有重要意義。

目前，甘肅貝母人工栽培所面臨的技術(shù)難題如種子灌漿特性[23]、種子發(fā)芽條件[24]、間作效果[25]及生殖分配規(guī)律[2]已有報(bào)道，但甘肅貝母生長(zhǎng)年限與根際微生物群落結(jié)構(gòu)的變化研究未見報(bào)道。為此，本研究采用Illumina Misqe高通量測(cè)序?qū)Ω拭C漳縣撂荒(CK)、1 a生、3 a生和5 a生的甘肅貝母根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性分布特征進(jìn)行研究，并闡明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子，旨在揭示不同種植年限下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性的異同關(guān)系，為克服甘肅貝母連作障礙和保持高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于甘肅省漳縣石川鎮(zhèn)(34°35′N，104°19′E)，屬高寒冷涼氣候，海拔2 700 m，年均氣溫4.2℃，年均降水量500～612 mm，且主要集中在7—9月，≥0℃日照時(shí)數(shù)1 629 h，≥10℃日照時(shí)數(shù)1 048 h，無霜期120～130 d。試驗(yàn)地為多年撂荒地，為典型高山草甸土，土壤類型為黑土。坡度15°，占地面積2 500 m2，是甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)陳垣教授建立的野生甘肅貝母撫育基地。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 種子采集 甘肅貝母采用種子直播，于2012—2017年每年7月中旬采集野生甘肅貝母蒴果，帶回試驗(yàn)地低溫4℃保濕保存?zhèn)溆?，種子千粒重為(1.610±0.194)g(n=10)。

1.2.2 種子播種 播種試驗(yàn)采用單因子隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。播前先整地，首先沿坡度將田地分成長(zhǎng)畦(畦面長(zhǎng)10 m，寬1 m，高5 cm)，畦間距0.3 m。種子條播，播深3 cm，行距為10 cm，播種量為8.0 g·m-2，每年播種3 畦，逐年同一時(shí)間連續(xù)播種。播后蓋遮陽網(wǎng)，供試樣地長(zhǎng)期未施肥，除草等田間管理方式均一致。

1.3 土樣采集

1.3.1 根際土樣采集 本研究于甘肅貝母生長(zhǎng)旺盛期(2018年6月25日)在撂荒地(CK)、甘肅貝母生長(zhǎng)1 a(BM-1Y)、3 a(BM-3Y)和5 a(BM-5Y)的試驗(yàn)小區(qū)采挖完整帶土甘肅貝母植株，參照蔡子平等[26]的方法現(xiàn)場(chǎng)收集根際土壤樣品。即在各處理隨機(jī)選取3個(gè)樣點(diǎn)，用滅菌鏟取15 cm×15 cm的土壤樣方，深度15 cm，將樣方土壤取出后置于滅菌的白瓷盤(20 cm×30 cm)中，貝母鱗莖及根系周圍松散土為非根際土，附著在甘肅貝母鱗莖及根系表面的土壤為根際土，迅速將甘肅貝母苗連同根際土壤裝入已滅菌并編號(hào)的20 mL離心管中，蓋緊離心管后用PM-966封口膜封口，然后將離心管放入干冰盒，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行根際土壤分離、根際土壤DNA提取和高通量測(cè)序，分析不同生長(zhǎng)年際間根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性。

1.3.2 非根際土樣采集 取出的土壤樣品中抖落與甘肅貝母鱗莖及根系松散結(jié)合的土壤作為非根際土壤，將非根際土壤剔除甘肅貝母枯葉、根系和石塊等雜物后混合均勻，用無菌自封袋包好，置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干，風(fēng)干過篩后進(jìn)行土壤pH值、有機(jī)質(zhì)(OM)、水解氮(HN)、速效磷(AP)、速效鉀(AK)、全氮(TN)、全磷(TP)和全鉀(TK)等土壤理化因子的測(cè)定。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 土壤理化因子 測(cè)定風(fēng)干土先過篩(篩孔1 mm)。土壤pH值采用pH計(jì)測(cè)定。OM采用K2Cr2O7-H2SO4稀釋熱法測(cè)定，TK和AK利用火焰光度計(jì)(M410，Sherwood，Britain)進(jìn)行測(cè)定，TP和AP利用紫外分光光度計(jì)(TU-1901)進(jìn)行測(cè)定，TN用凱氏定氮儀測(cè)定，利用堿性水解擴(kuò)散法測(cè)定土壤HN[27]。

1.4.2 DNA抽提和PCR擴(kuò)增 根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA kit(Omega Bio-tek, Norcross，GA，US)說明書進(jìn)行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop 2000測(cè)定DNA濃度和純度；使用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對(duì)16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)(95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s)，然后72℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4℃進(jìn)行保存(PCR儀：ABI Gene Amp?9700型)。PCR反應(yīng)體系為：5×Trans Start Fast Pfu緩沖液4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，上游引物(5 μM)0.8 μL，下游引物(5 μM)0.8μL，Trans Start Fast Pfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。DNA抽提和PCR擴(kuò)增均在上海美吉生物公司(上海，中國(guó))利用Illumina-MiSeq平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序分析。

1.4.3 高通量序列分析 獲得原始序列數(shù)據(jù)后，首先對(duì)有效序列進(jìn)行去雜、修剪、去除嵌合體序列等過濾處理，得到優(yōu)化序列，通過聚類分析形成操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，然后對(duì)在97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。利用土壤細(xì)菌種類數(shù)(OTUs)和16S rDNA序列數(shù)(Reads)計(jì)算土壤細(xì)菌的Alpha多樣性，菌群豐度指數(shù)Chao I指數(shù)，菌群多樣性指數(shù)Shannon，覆蓋度指數(shù)Coverage以及譜系多樣性Phylogenetic diversity(PD)。

其中,SChao I為估計(jì)的OUT數(shù)目，Sobs為實(shí)際觀測(cè)到的OUT數(shù)目，n1為只含一條序列的OUT數(shù)目，n2為只含兩條序列的OUT數(shù)目。

Shannon的計(jì)算公式為：

其中,Sobs為實(shí)際觀測(cè)到的OUT數(shù)目，ni為第i個(gè)OUT所含的序列，N為所有序列數(shù)。

其中,n1為只含一條序列的OUT數(shù)目，N為抽樣中出現(xiàn)的總序列數(shù)目。

RDA/CCA分析反映菌群與環(huán)境因子之間的關(guān)系，其選擇原則是先用species-sample數(shù)據(jù)(97%相似性的樣本OTU表)做DCA分析，看分析結(jié)果中Lengths of gradient第一軸的大小，如果大于等于3.5，就采用CCA;如果小于3.5，RDA的結(jié)果要好于CCA，所有計(jì)算均采用上海美吉云平臺(tái)(https://www.i-sanger.com/)進(jìn)行指數(shù)分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Microsoft Excel 2013軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖。用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，One-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，采用最小顯著差異法(LSD)比較數(shù)據(jù)組間的差異，用Person相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)不同因子間的相關(guān)性，用R語言進(jìn)行RDA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)年限對(duì)甘肅貝母土壤理化因子的影響

由表1可見，除TN、TK和TP外，其他理化因子與甘肅貝母生長(zhǎng)年限均有顯著影響(P<0.05)。與CK處理相比，土壤pH、OM、HN、AP和AK均隨甘肅貝母生長(zhǎng)年限的增加呈先增加后降低趨勢(shì)，其中BM-1Y處理顯著提高了土壤OM、HN、AP及AK的含量，較CK處理分別提高了27.10%(P<0.05)、2.96%(P<0.05)、1.08%(P>0.05)及11.99%(P>0.05)；而BM-5Y處理達(dá)最低，OM、HN和AP較CK處理分別降低了22.76%、9.28%、和51.25%，且各處理間差異顯著(P<0.05)。TN、TP和TK含量均與生長(zhǎng)年限無關(guān)，各處理間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 不同生長(zhǎng)年限對(duì)甘肅貝母根際土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性的影響

單樣本的多樣性分析可以反映樣品內(nèi)的細(xì)菌群落的豐富度和多樣性。不同生長(zhǎng)年限對(duì)甘肅貝母土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性指數(shù)影響如表2所示。不同生長(zhǎng)年限甘肅貝母根際土的測(cè)序深度指數(shù)(Coverage 指數(shù))都在0.97以上，說明測(cè)序結(jié)果能夠展示樣品中絕大部分信息。OUT數(shù)、PD值、Chao I指數(shù)及Shannon指數(shù)在BM-1Y、BM-3Y和BM-5Y處理中的大小為BM-1Y>BM-3Y>BM-5Y，說明甘肅貝母生長(zhǎng)年限越長(zhǎng)，土壤細(xì)菌的物種總數(shù)、菌群豐富度以及復(fù)雜程度越低。

表2 不同生長(zhǎng)年限甘肅貝母根際土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性比較

2.3 不同生長(zhǎng)年限對(duì)甘肅貝母土壤細(xì)菌組成的影響

從12個(gè)根際土壤樣品中共獲得細(xì)菌序列583687條(41837～52310)，以97%的相似水平進(jìn)行OTU聚類，共獲得4980個(gè)OUT，對(duì)OTU的代表序列進(jìn)行物種注釋后，繪制各個(gè)樣品在門水平上相對(duì)豐度大于1%的物種圖(圖1，見 頁)。測(cè)序后共獲得40門99綱190目369科655屬的土壤細(xì)菌，其中放線菌門(Actinobacteria)(23.58%～32.08%)豐度最高，其次是變形菌門(Proteobacteria)(22.00%～28.80%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(13.82%～20.86%)和綠彎菌門(Chloroflexi)(8.43%～15.08%)，均為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度均大于5%，占獲得總細(xì)菌序列量的82.96%。

對(duì)比不同生長(zhǎng)年限間細(xì)菌門水平相對(duì)豐度關(guān)系發(fā)現(xiàn)，上述4種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌中的變形菌門和酸桿菌門在各生長(zhǎng)年限間差異不顯著，但酸桿菌門在BM-1Y、BM-3Y和BM-5Y處理的相對(duì)豐度均低于CK處理，較CK處理分別降低了26.06%、33.76%和22.30%。放線菌門在BM-1Y，BM-3Y和BM-5Y處理中相對(duì)豐度均高于CK處理，較CK處理分別提高了33.80%(P<0.05)、20.10%(P>0.05)和36.04%(P<0.05)。綠彎菌門在BM-1Y、BM-3Y和BM-5處理中相對(duì)豐度均低于CK處理，較CK處理分別降低了44.08%(P<0.05)、19.23%(P>0.05)和20.40%(P>0.05)。

在不同生長(zhǎng)年限中檢測(cè)到相對(duì)豐度較低(1%～5%)的細(xì)菌門有：硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。其中硝化螺旋菌門相對(duì)豐度在不同生長(zhǎng)年限間較穩(wěn)定，處理間無顯著差異；疣微菌門相對(duì)豐度在BM-1Y、BM-3Y和BM-5Y處理中均隨生長(zhǎng)年限的增加而增大，但均低于CK處理；厚壁菌門相對(duì)豐度在BM-1Y、BM-3Y和BM-5Y處理中同樣隨生長(zhǎng)年限的增加而增大，且均高于CK處理；擬桿菌門和芽單胞菌門相對(duì)豐度雖在不同處理中無一定的規(guī)律，但擬桿菌門在BM-5Y處理含量最低，較CK、BM-1Y和BM-3Y處理分別降低了55.56%(P<0.05)、55.09%(P<0.05)和60.63%(P<0.05)，而芽單胞菌門在BM-5Y處理含量最高，較CK、BM-1Y和BM-3Y處理分別提高了46.86%(P<0.05)、2.93%(P>0.05)和38.19%(P>0.05)。此外，本研究還檢測(cè)到包括藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)在內(nèi)的31個(gè)豐度很低的痕量菌門以及未分類的細(xì)菌門。

在屬水平，除未被分類的細(xì)菌屬9.66%外，不同生長(zhǎng)年限甘肅貝母土壤細(xì)菌相對(duì)豐度排序前13的細(xì)菌菌屬分布見圖2。不同生長(zhǎng)年限細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬基本相同，其中norank_c_ _Acidobacteria的相對(duì)豐度最高，達(dá)7.36%～12.73%，其次是屬norank_c_ _KD4-96、norank_o_ _Gaiellales和Gaiella，相對(duì)豐度分別為3.16%～6.65%、3.86%～5.24%和3.22%～4.11%。研究還發(fā)現(xiàn)隨著甘肅貝母生長(zhǎng)年限的增加，norank_c_ _Acidobacteria和norank_f_ _Anaerolineaceae的相對(duì)豐度顯著降低。此外，根際土特有的細(xì)菌屬因生長(zhǎng)年限不同而異(圖3)，其中CK處理獨(dú)有12個(gè)細(xì)菌屬，BM-1Y處理獨(dú)有13個(gè)細(xì)菌屬，BM-3Y獨(dú)處理有13個(gè)細(xì)菌屬，BM-5Y處理獨(dú)有16個(gè)細(xì)菌屬。

2.4 不同生長(zhǎng)年限對(duì)甘肅貝母土壤理化因子與根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群的影響

由表3可知，不同年限甘肅貝母土壤理化因子與根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群的相關(guān)性不同，pH、OM、HN、AP和AK是驅(qū)動(dòng)不同生長(zhǎng)年限甘肅貝母根際土壤細(xì)菌群落的主要因子。變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)與根際土壤各理化因子間沒有顯著的相關(guān)性(P>0.05)。放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，浮霉菌門(Planctomycetes)與pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)與AK呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。擬桿菌門(Bacteroidetes)與HN呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。厚壁菌門(Firmicutes)與OM、HN、AP呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。此外，土壤理化因子與細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)的相關(guān)性也不同，OM、HN和AP均與Chao I指數(shù)和Shannon指數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其他土壤理化因子與Chao I指數(shù)和Shannon指數(shù)無相關(guān)性(P>0.05)。

為了進(jìn)一步探明不同年限甘肅貝母根際土壤細(xì)菌群落發(fā)生變化的主要環(huán)境因子。本研究對(duì)不同生長(zhǎng)年限下甘肅貝母根際土壤相對(duì)豐度前10的細(xì)菌群落(門水平)與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行RDA/CCA分析(圖4)，第一軸可以解釋所有信息的53.33%，第二軸可以解釋所有信息的14.13%，DCA分析結(jié)果Axis_lengths=0.6282<3.5，表明該分析采用RDA分析。從表3還可以看出，pH、AK、HN、AP、OM、TK、TN和TP對(duì)不同年限甘肅貝母根際土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門均有一定程度的驅(qū)動(dòng)作用，其程度大小為：pH>AK>HN>AP>OM>TK>TN>TP，其中pH、AK、HN、AP、OM是最主要的驅(qū)動(dòng)因子。受此5種環(huán)境因子影響較大的細(xì)菌為：厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)及擬桿菌門(Bacteroidetes)。除AK外其余均對(duì)擬桿菌門(Bacteroidetes)具有正向作用，對(duì)放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)具有負(fù)向作用。

表3 不同生長(zhǎng)年限甘肅貝母根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群(門)與土壤理化因子的相關(guān)性

3 討 論

3.1 生長(zhǎng)年限對(duì)甘肅貝母根際土壤細(xì)菌多樣性的影響

甘肅貝母是多年生草本植物，從種子播種到開花結(jié)果至少需要5 a，商品藥材也至少需要3 a左右的時(shí)間。目前，大量研究已證實(shí)同一植物在同一土壤中生長(zhǎng)多年(連作)，會(huì)出現(xiàn)明顯的連作障礙，可導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)改變、土壤微生物群落多樣性降低等，存在潛在的土壤肥力衰退趨勢(shì)[28-29]。土壤細(xì)菌作為土壤微生物中最重要的活性組分，其多樣性水平被認(rèn)為是評(píng)價(jià)土壤生態(tài)功能的重要指標(biāo)[30]。母茂君等[31]研究發(fā)現(xiàn)，隨著太白貝母生長(zhǎng)年限的增加，根際土壤細(xì)菌多樣性整體上呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，土壤微生物區(qū)系由高肥力的“細(xì)菌型”向低肥力的“真菌型”過渡。Dong L L等[32]研究發(fā)現(xiàn)，三七在連作中土壤細(xì)菌Chao I指數(shù)和Shannon指數(shù)均隨連作年限的延長(zhǎng)整體呈先增加后降低趨勢(shì)，說明適當(dāng)短期連作能增加土壤細(xì)菌多樣性，而長(zhǎng)期連作能降低土壤細(xì)菌多樣性。肖龍敏等[33]在不同種植年限寧夏枸杞根際微生物的群落多樣性研究中發(fā)現(xiàn)根際細(xì)菌的Shannon指數(shù)在種植5 a時(shí)達(dá)最高，隨著生長(zhǎng)年限的延長(zhǎng)而逐漸降低，在種植15 a時(shí)顯著降低，種植24 a達(dá)最低。本研究以撂荒地為對(duì)照(CK)，對(duì)生長(zhǎng)1 a(BM-1Y)、3 a(BM-3Y)、5 a(BM-5Y)的甘肅貝母根際土的細(xì)菌群落Alpha多樣性同樣得出，OUT數(shù)、PD值、Chao I指數(shù)及Shannon指數(shù)均在BM-5Y中最低，說明甘肅貝母生長(zhǎng)年限越長(zhǎng)，土壤細(xì)菌的物種總數(shù)、菌群豐富度以及復(fù)雜程度越低，也就是土壤細(xì)菌的多樣性降低。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)與土壤有機(jī)質(zhì)、水解氮和速效磷均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，說明土壤養(yǎng)分的降低導(dǎo)致土壤細(xì)菌多樣性降低。同樣，劉株秀等[29]研究得出，大豆長(zhǎng)期連作提高了土壤養(yǎng)分含量和細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，Zak等[34]研究證實(shí)，輪作下細(xì)菌多樣性指數(shù)的增加不僅是由于作為微生物外源植物殘?bào)w種類數(shù)量的增加，而土壤養(yǎng)分尤其是速效養(yǎng)分的升高是微生物多樣性增加的另一主要因素。還有研究揭示，低養(yǎng)分堿性土壤條件不利于根際土壤微生物的生長(zhǎng)和繁殖，同時(shí)也抑制了細(xì)菌的多樣性[35]，這均與本研究結(jié)果一致。所以在甘肅貝母栽培的田間管理中，隨著甘肅貝母生長(zhǎng)年限的延長(zhǎng)，可根據(jù)其生長(zhǎng)情況適量增施氮肥和磷肥，并配合使用農(nóng)家肥，可保證其土壤微生物和土壤養(yǎng)分的平衡。

3.2 生長(zhǎng)年限對(duì)甘肅貝母根際土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群的影響

細(xì)菌群落是土壤微生物中最主要的一類微生物，也是土壤微生物多樣性的重要指標(biāo)。植物在土壤中的年限直接影響土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)[36]，其細(xì)菌組成和豐度大小均有一定程度的差異[32]。本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)年限對(duì)甘肅貝母根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有一定的差異，但主要優(yōu)勢(shì)菌群較穩(wěn)定，均以放線菌門(Actinobacteria)豐度最高，其次是變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)。這與Wu等[37]和Xiong等[38]在高粱和黑胡椒連作對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致。這意味著放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)均能適應(yīng)各種植物物種的根際環(huán)境。土壤中每一特定性的菌類均具有不同的功能特性，放線菌門是自養(yǎng)型細(xì)菌，它不依賴土壤養(yǎng)分而生存，變形菌門是一類適應(yīng)性很強(qiáng)的細(xì)菌，該類菌中既包含動(dòng)植物的病原菌也存在抑制致病菌的有益菌。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)各生長(zhǎng)年限均有其特定的細(xì)菌微生物，并偏向特定種群，這與Lauber[39]等的研究結(jié)果相吻合。究其原因可能是多年生的甘肅貝母根系分泌物積聚在根際土壤中，為多個(gè)微生物群提供了底物。Chen[40]等同樣發(fā)現(xiàn)，植物不僅為微生物群落提供了營(yíng)養(yǎng)，而且它們的根系分泌物還含有各種抗微生物代謝產(chǎn)物。

3.3 生長(zhǎng)年限對(duì)甘肅貝母土壤理化因子與根際土壤細(xì)菌群落的相關(guān)性

在連續(xù)種植中，土壤理化因子能夠更好地體現(xiàn)土壤的健康狀況，并且能夠影響土壤微生物種群數(shù)量及分布。不同植被的營(yíng)養(yǎng)代謝活動(dòng)導(dǎo)致土壤養(yǎng)分具有一定的差異[41]。有研究表明，土壤理化因子與土壤微生物群落顯著相關(guān)，土壤環(huán)境因子的改變會(huì)影響土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)[42]。在本研究中，除TN、TK和TP外，其他pH、OM、HN、AP和AK等土壤理化因子與甘肅貝母生長(zhǎng)年限均呈顯著差異(P<0.05)，其中pH、OM、HN、AP和AK是驅(qū)動(dòng)甘肅貝母根際土壤細(xì)菌群落的主要因子。近年來，土壤pH值在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)形成中的重要作用已得到了充分的論證，均被揭示出pH值是決定細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主導(dǎo)因子[29,43]。Degrune等[44]發(fā)現(xiàn)微小的土壤pH值變化與細(xì)菌群落組成及多樣性指數(shù)存在顯著的相關(guān)性(P<0.01)。本研究同樣得出pH與放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，這進(jìn)一步說明pH值下降有利于放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的生長(zhǎng)。放線菌門(Actinobacteria)是自養(yǎng)型細(xì)菌，它不依賴土壤養(yǎng)分而生存，因此它與土壤養(yǎng)分相關(guān)性不顯著。OM、HN和AP均與厚壁菌門(Firmicutes)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而對(duì)擬桿菌門(Bacteroidetes)具有正向作用。擬桿菌門是有機(jī)碳的主要礦化者[29]，可以增加有機(jī)碳的含量，并為其他微生物及土壤酶活性提供能量。說明除土壤pH值外，土壤養(yǎng)分是引起不同種植制度中土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的另一主要貢獻(xiàn)因子。

4 結(jié) 論

本研究從分子生物學(xué)的角度，采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，甘肅貝母生長(zhǎng)年限的延長(zhǎng)顯著影響其土壤理化因子和細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，其中BM-5Y顯著降低了土壤OM、HN和AP的含量，也顯著降低細(xì)菌多樣性，但各生長(zhǎng)年限中的優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)穩(wěn)定，均為放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)。土壤理化因子的變化會(huì)顯著影響細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)，其中pH、AK、OM、HN、AP含量是驅(qū)動(dòng)根際土細(xì)菌群落的主要因子，且pH與放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而OM、HN和AP均與厚壁菌門(Firmicutes)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。因此，在甘肅貝母栽培中，應(yīng)結(jié)合輪作倒茬適時(shí)采挖，避免因生長(zhǎng)年限過長(zhǎng)而使土壤養(yǎng)分偏耗，進(jìn)而改變根際土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)，影響甘肅貝母生長(zhǎng)。

致謝：感謝甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)博士生安志剛及碩士生袁洪超、金彥博和郭一青參與馴化栽培。感謝碩士生王紅燕及本科生周錦程參與野外田間管理、土樣采集及室內(nèi)實(shí)驗(yàn)。感謝康俊彥及郭志軍在栽培和田間管理中的技術(shù)指導(dǎo)。