沈乎醒，高衛(wèi)萍，韋慶波，徐 倩

0引言

干眼是一種淚膜失去穩(wěn)定性，伴有眼表不適癥狀的常見疾病，全球發(fā)病率約為5%～50%，我國發(fā)病率為21%～68.3%[1]。干眼的眼表不適癥狀，如干澀、異物感、燒灼感、刺痛感等，治療困難，嚴重影響患者的工作和生活。2017年國際眼表和淚膜協(xié)會第二次會議(TFOS DEWS Ⅱ)強調(diào)干眼的主要發(fā)病機制是淚膜高滲和不穩(wěn)定、眼表炎癥和損傷以及神經(jīng)感覺異常，年齡、性別、用眼方式、滴眼液中的防腐劑和全身性藥物、隱形眼鏡、眼科手術(shù)和非手術(shù)治療都可能導(dǎo)致干眼[2]。未來干眼的研究需要進一步的流行病學(xué)調(diào)查以更好地確定風(fēng)險因素，創(chuàng)造出毒性更小的藥物，設(shè)計出創(chuàng)傷更小的眼科手術(shù)，基因組學(xué)的發(fā)展為這些研究打開了新的局面。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和免疫印跡實驗(Western blot)、基因組學(xué)等技術(shù)的廣泛運用，進一步明確了干眼患者眼表細胞因子和淚液成分的變化。宏基因組學(xué)、基因工程動物、基因芯片及基因轉(zhuǎn)染研究的開展，為深入研究干眼的發(fā)病機制，研發(fā)治療干眼的新藥提供了良好的條件。

1宏基因組學(xué)在干眼發(fā)病率研究中的運用

在已報告的干眼發(fā)病率調(diào)研中，超過40歲的患者約38%～68%有瞼板腺功能障礙(MGD)[2]。研究表明，眼表微生物群與MGD導(dǎo)致的干眼密切相關(guān)，但因為淚膜的抗菌特性和淚液的機械沖刷，只有零星的眼表區(qū)域被微生物定殖，細菌培養(yǎng)技術(shù)有限，無法準確檢測[3]。宏基因組學(xué)的技術(shù)可以分析復(fù)雜環(huán)境群落微生物，甚至包括不可培養(yǎng)的微生物[4]。

Li等[5]提取了35例40歲以上的干眼患者(其中25例診斷有MGD)球結(jié)膜多個部位拭子樣本中細菌的DNA，并用PCR技術(shù)擴增RNA，繼而采用QIIME軟件對細菌16SrRNA基因V3-V4可變區(qū)進行測序，分析結(jié)膜樣本中微生物群落OTU聚類及多樣性。不僅區(qū)分了易致干眼的細菌以及益于眼表健康的菌落，還發(fā)現(xiàn)假單胞菌、巴氏桿菌等才是MGD的關(guān)鍵致病菌，而金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌則與MGD的發(fā)病無明顯相關(guān)性。MGD導(dǎo)致的干眼與年齡也有關(guān)，研究指出老年小鼠MGD與人類MGD患者表現(xiàn)的眼表癥狀相似[6]。人與小鼠的基因有80%相同，Parfitt等[7]摘取3月齡和2歲共10只小鼠的瞼板腺等組織，采用高通量基因測序方法讀取組織中提取的DNA并制成了宏基因組文庫，對不同年齡小鼠的瞼板腺等組織進行差異基因表達分析，結(jié)果顯示有698個基因被鑒定為差異表達，確定了包括成纖維細胞生長因子(FGF)和Wnt在內(nèi)的數(shù)條信號通路在瞼板腺隨著年齡發(fā)生功能障礙的過程中產(chǎn)生重要作用，為進一步研究MGD導(dǎo)致干眼的機制提供了基礎(chǔ)。IL-2受體α鏈(CD25)是IL-2的結(jié)合受體,CD25基因敲除(CD25KO)小鼠表現(xiàn)出干燥綜合征(Sj?gren綜合征)的多種特征，包括雙眼皮腺炎、眼瞼腺炎和角膜結(jié)膜炎等[8]。Zaheer等[9]比較了飼養(yǎng)在常規(guī)和無菌條件下的CD25KO小鼠，無菌飼養(yǎng)的CD25KO小鼠與常規(guī)的相比，結(jié)膜杯狀細胞密度降低，角膜屏障功能障礙明顯，CD4+T細胞浸潤增多。將野生型C57BL/6J小鼠糞便的微生物移植給無菌CD25KO小鼠，可逆轉(zhuǎn)無菌CD25KO小鼠的自發(fā)性干眼表型。研究表明，體內(nèi)共生微生物的缺乏可加速淚腺炎癥發(fā)生、加重其嚴重程度，并產(chǎn)生了具有更強致病性的CD4+T細胞，共生微生物或其代謝產(chǎn)物具有保護外分泌腺的免疫調(diào)節(jié)特性。宏基因組學(xué)揭示了微生物在干眼發(fā)病原因和發(fā)病機制中的重要地位，為精確治療干眼提供了新的靶點。

2基因芯片在干眼炎癥機制研究中的運用

淚液中含有復(fù)雜的細胞因子成分，可調(diào)節(jié)多種細胞功能，也可作為干眼發(fā)生的眼表標志物和疾病康復(fù)的信號。由于淚液樣本微量，ELISA只能檢測樣本中復(fù)雜的細胞因子中的個別因子的濃度，想要得到淚液中各種細胞因子之間相互作用和整體變化的結(jié)果，需要大量檢測樣本，操作繁瑣，費時費力?；蛐酒?，又稱DNA微陣列，可以通過生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光檢測雜交探針的位置，與大量被測生物細胞或組織標記的核酸序列雜交后，實現(xiàn)基因信息的快速檢測[10]?；蛐酒夹g(shù)具有高通量、高靈敏度、高特異性的特點，非常適合于同時檢測微量淚液樣本中的多個細胞因子[11]。

Li等[12]采用細胞因子基因芯片檢測干眼模型鼠淚液中炎癥因子、抗炎因子、生長因子以及其他細胞凋亡因子等，發(fā)現(xiàn)B7-2/Cd86、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、MMP-8、Fas配體、TNF-α和TIMP-1較正常水平升高?；蛐酒夹g(shù)也可用于分析不同疾病導(dǎo)致干眼的淚液成分的特異性變化，為預(yù)防繼發(fā)性干眼提供早期診斷和療效評估的實驗指標。例如曾孝宇[13]通過人干眼定量抗體基因芯片(QAH-DED-1)檢測糖尿病干眼患者的淚液樣本，發(fā)現(xiàn)干眼患者淚液中EGF、IL-1RA及MIP-1d較非干眼糖尿病患者的有明顯趨勢變化，這些細胞因子或許可以成為糖尿病性干眼早期診斷的標志物。Gad等[14]用多重細胞因子抗體基因芯片測定配戴硅水凝膠角膜軟性接觸者淚液中7種細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α的濃度，顯示有干眼眼部癥狀的配戴者促炎細胞因子IL-17A水平較高，證實了角膜軟性接觸鏡導(dǎo)致的干眼眼部癥狀與眼表炎癥有關(guān)。Zhang等[15]運用細胞因子基因芯片數(shù)據(jù)檢測鬼針草水提取物對干眼模型鼠淚液中細胞因子B7-2/Cd86、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、MMP-8、FasL、TNF-α和TIMP-1的作用，為進一步選擇合適的細胞因子進行Western blot、檢驗鬼針草的抗炎作用提供了便利。

3基因轉(zhuǎn)染在干眼新藥研究中的運用

在干眼流行病學(xué)調(diào)查中，根據(jù)癥狀報告得出的疾病總發(fā)病率在14.4%～24.4%，根據(jù)體征報告得出的則為1.3%～10.4%[2]，神經(jīng)病理性疼痛在干眼發(fā)病機制中有重要作用，是導(dǎo)致干眼癥狀和體征分離的主要原因。干眼淚液分泌減少以及炎癥均可激活角膜傷害性感受器，導(dǎo)致疼痛不適癥狀[16]。角膜的傷害感受器包括機械神經(jīng)感受器、多模態(tài)-嗅覺傳感器以及冷熱覺感受器[17]。Yang等[18]將不同濃度的角膜冷覺TRPM8受體激動劑cryosim-3(C3，1-二異丙基膦?；赏?溶液用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人TRPM8 cDNA的中國倉鼠卵巢細胞，測試細胞內(nèi)鈣離子動員曲線，從而篩選有效激動劑濃度，經(jīng)過鼠感覺神經(jīng)元鈣反應(yīng)試驗后，最終選取合適的cryosim-3濃度(2mg/mL)溶液用于干眼患者眼表，證實cryosim-3溶液可緩解干眼患者眼表燒灼感等不適癥狀，為治療干眼提供了新型的藥物和研究方法。

眼部的基因治療具有局限性，角膜和結(jié)膜、上皮和淚膜以及如眨眼或淚膜間隙等生理機制限制了DNA有效地滲透到眼球?；钚苑肿优c納米載體的結(jié)合，使分子能與特定的眼球結(jié)構(gòu)緊密地相互作用，克服解剖和生理障礙，延長DNA在靶組織中的停留時間[19]。MUC5AC是一種具有凝膠形成特性的糖蛋白，Contreras-Ruiz等[20]將含有加載了編碼修飾的MUC5AC蛋白的納米質(zhì)粒的陽離子化明膠覆蓋在健康和實驗性干眼小鼠的角膜上，成功地在角膜和結(jié)膜上皮細胞轉(zhuǎn)染了MUC5AC蛋白，修正了干眼小鼠眼表組織MUC5AC的表達，使其眼表組織的結(jié)構(gòu)和形態(tài)趨于正常，炎癥因子水平下降，CD4+T細胞浸潤減少，干眼癥狀明顯減輕[21]。將基因轉(zhuǎn)染技術(shù)和納米分子材料學(xué)技術(shù)相結(jié)合，更加有效地為研發(fā)治療干眼新藥物提供了新的技術(shù)。

4基因測序在干眼手術(shù)治療中的運用

越來越多的患者尋求眼部護理和整容手術(shù)，如長期配戴角膜鏡和使用含有防腐劑的滴眼液、多次眼表手術(shù)等都可能使角膜上皮損傷、角膜緣干細胞(LESCs)功能障礙或缺損，出現(xiàn)干眼。癥狀嚴重者可有眼瞼痙攣、劇烈疼痛，甚至失明[22]。1989/1994年先后報道了成功完成人自體LESCs移植和人同種異體LESCs移植重建角膜表面，治療眼表損傷和LESCs缺乏[23-24]，研究人員從1997年開始進行體外擴增的LESCs研究。明確角膜上皮的表型是成功獲得體外擴增LESCs的關(guān)鍵因素[25]。由于缺乏LESCs的特異性生物標志物和原位上皮細胞亞群的精確分子表征，這一生物工程領(lǐng)域的進展受到了實質(zhì)性的阻礙。Bath[26]利用激光捕獲顯微解剖和RNA測序相結(jié)合的方法，對人類角膜上皮細胞的原位亞群進行分析，進行全局轉(zhuǎn)錄組分析，明確了原位角膜上皮亞群的綜合分子表征，獲得了適合LESCs的選擇性體外擴增的有效低氧濃度和培養(yǎng)基，為通過培養(yǎng)的角膜上皮移植治療角膜緣上皮干細胞缺乏提供了大量的數(shù)據(jù)。間充質(zhì)干細胞(MSCs)被認為是值得進一步探索的可以限制組織破壞的修復(fù)細胞[27]。Lee等[28]將小鼠骨髓衍生間充質(zhì)干細胞(mMSCs；1×105cells/20μL；BSS)注射到干眼模型鼠淚腺中，與注入PBS緩沖液的淚腺組織進行對比，結(jié)果顯示淚腺注射mMSCs后組織中CD4+細胞浸潤減少，IL-2和IFN-γ表達水平下降；瞼結(jié)膜的杯狀細胞的數(shù)量明顯增加、黏液的分泌量也有所增加；萎縮的淚腺結(jié)構(gòu)在局部灌注mMSCs后也有部分恢復(fù)，表明MSCs可以通過抑制炎癥，促進組織修復(fù)來保護眼表。干細胞的培養(yǎng)和移植依賴在干眼領(lǐng)域的研究還有可以探索的廣泛內(nèi)容，運用好基因組學(xué)的技術(shù)，可以促進干細胞在干眼領(lǐng)域運用的長足進步。

5基因工程動物在干眼動物造模研究中的運用

基因工程動物的發(fā)展為復(fù)雜性狀疾病的研究提供了理想的動物模型，可以在活體內(nèi)分析單個候選基因的作用，將復(fù)雜的問題拆解開分析，分別對單一因素進行分析，為深入研究發(fā)病機制和基因治療創(chuàng)造了條件[29]。淚腺功能障礙使淚液分泌減少，引發(fā)干燥、導(dǎo)致炎癥反應(yīng)是干眼重要的發(fā)病機制之一。

低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)介導(dǎo)的細胞凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)可調(diào)控炎癥因子和免疫細胞表達[30]。Ji等[31]將HIF-1α條件性基因敲除的C57BL/6小鼠和野生型C57BL/6小鼠共同放置設(shè)定的干燥環(huán)境并皮下注射氫溴酸東莨菪堿(5mg/mL)誘導(dǎo)干眼，結(jié)果顯示HIF-1α基因敲除的小鼠淚腺腺泡細胞中CD45+細胞的浸潤顯著增強，TRAIL基因表達水平較野生型明顯降低，炎癥因子IL-1β、IL-17A蛋白表達水平顯著升高，誘導(dǎo)加速了腺泡細胞死亡。該研究為淚腺腺泡細胞衍生的TRAIL在炎癥性損傷中的調(diào)節(jié)功能提供了新的見解。淚膜的穩(wěn)定性對干眼眼表的健康也很重要，淚液的脂質(zhì)層可維持淚膜穩(wěn)定性，磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(PLTP)是人類淚液脂質(zhì)層的正常成分。為了研究PLTP在淚膜穩(wěn)定性中能否起到功能作用，Set?l?等[32]采用野生型C57BL/6小鼠和PLTP敲除的C57BL/6小鼠，均進行干眼誘導(dǎo)。PLTP敲除小鼠的角膜上皮損傷、上皮羧基熒光素通透性以及閉塞素裂解較野生型小鼠明顯加重。提示淚液中PLTP的存在對維持健康和功能正常的眼表是必不可少的?；蚬こ虅游锟梢詫⒏裳蹚?fù)雜和混合的發(fā)病機制拆解開，深入研究發(fā)病機制，為進一步研究新型的治療藥物和手段提供方法。

6結(jié)語

新一代基因組學(xué)技術(shù)使臨床醫(yī)生和研究人員能夠從大規(guī)模研究群體中收集基因組數(shù)據(jù)量，結(jié)合新的信息學(xué)方法將多種數(shù)據(jù)與基因組數(shù)據(jù)進行集成后，更好地理解疾病機制和藥物反應(yīng)[33]?！熬珳梳t(yī)學(xué)”這一概念被提出后，臨床上對基因組學(xué)的高通量測序技術(shù)需求越來越多。目前基因組學(xué)在干眼研究的主要側(cè)重于細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的變化，腸道和眼表微環(huán)境菌落的多樣性宏基因測序、炎癥及凋亡細胞因子基因芯片檢測，這些先進技術(shù)的運用為臨床醫(yī)生提供了較多較完善的干眼發(fā)病原因和發(fā)病機制的研究結(jié)論，利于指導(dǎo)臨床醫(yī)生制定更精準的治療方案。此外，基因組學(xué)多重技術(shù)對治療干眼新藥和新治療技術(shù)研發(fā)等提供科學(xué)支撐，目前已有跨學(xué)科的研究，基因組學(xué)結(jié)合材料學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等，不僅為眼表疾病，更為難治性、遺傳性眼底視網(wǎng)膜病變帶來治療的希望。在未來的研究中，更加側(cè)重于基因組學(xué)對干眼發(fā)病率、組織的修復(fù)和重建的作用，為尋找更加快速有效的診斷和治療方案以及疾病的預(yù)后提供新的思路。