利虹瑛 李 艷 張夢圓 姚 勇 蔡季平 謝田華 邵 珺

年齡相關性黃斑變性 (AMD) 是一種視網膜黃斑區(qū)結構的衰老性病變。Bruch 膜增厚、玻璃膜疣形成、視網膜色素上皮 (RPE) 細胞和感光細胞損傷、脈絡膜新生血管是AMD的主要病理特征[1]。AMD分為干性和濕性，目前臨床上對濕性AMD的治療已取得巨大進展，如抗血管內皮生長因子、光動力療法等，但對于干性AMD仍無有效治療方法。RPE細胞死亡在干性AMD疾病發(fā)展中起著關鍵調控作用。程序性細胞死亡是一類由特定基因介導并調控的細胞死亡過程，在人體生長發(fā)育、疾病調節(jié)中起著重要作用[2]。程序性細胞死亡主要有凋亡、自噬、壞死性凋亡、焦亡和鐵死亡5種形式。本文就近年來5種程序性細胞死亡在干性AMD中的研究進展作一綜述，為干性AMD的發(fā)病機制研究及治療提供新思路。

1 AMD臨床現(xiàn)狀及發(fā)病機制

AMD是導致全球老年人失明的主要原因。據(jù)報道，2020年全球AMD的患者約達1.96億人，預計到2040年將增加到2.88億人[3]。除了衰老這一主要因素外，AMD的病因還包括遺傳、性別、種族、飲食、吸煙、慢性光損傷、體重指數(shù)、高血壓、脈絡膜血管功能不全等[4]。AMD的臨床癥狀主要表現(xiàn)為進行性中心視力急劇下降，病情呈不可逆性進展。根據(jù)有無脈絡膜新生血管，可分為干性和濕性兩大類。濕性AMD的臨床表現(xiàn)更為嚴重，但干性AMD發(fā)病率更高，且晚期干性AMD有可能進一步發(fā)展為濕性。干性AMD患者RPE細胞受損后其吞噬功能下降，Bruch 膜增厚，玻璃膜疣形成，誘發(fā)炎癥反應，進一步導致RPE細胞死亡及脈絡膜毛細血管萎縮[5]。程序性細胞死亡導致的RPE細胞死亡在干性AMD的發(fā)病機制中起到一定的作用，其背后的潛在機制仍未完全被人們了解。

2 程序性細胞死亡的分子機制

程序性細胞死亡廣泛參與多種疾病的病理生理過程，其分子機制經常被用作疾病的治療靶點。除了經典的凋亡和自噬外，新的程序性細胞死亡形式包括壞死性凋亡、焦亡和鐵死亡。表1主要從形態(tài)學特征、生化特征、有無炎癥反應和核心靶點四個方面對5種程序性細胞死亡特征進行了比較。

表1 5種程序性細胞死亡特征的比較

3 程序性細胞死亡與干性AMD的關系

3.1 細胞凋亡與干性AMD細胞凋亡是機體通過調控相關基因的表達激活或抑制細胞自主死亡的過程。凋亡的啟動依賴于caspase家族的激活。在外來信號刺激下，起始 caspase (caspase-8、caspase-9) 激活，進而激活執(zhí)行 caspase (caspase-3、caspase-6、caspase-7) ,引發(fā)下游連鎖反應，誘發(fā)凋亡。細胞活力測定、免疫印跡凋亡關鍵蛋白評價、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記等是細胞凋亡的常用檢測方法[6]。

隨著年齡的增長，線粒體功能障礙會誘導RPE細胞凋亡，加速干性AMD的發(fā)病。研究發(fā)現(xiàn)，AMD患者RPE細胞中凋亡陽性細胞數(shù)增多且 caspase-3 表達上調[7]。Z-VAD-FMK (Pan caspase抑制劑)、Z-IETD-FMK(caspase-8抑制劑)或Z-ATAD-FMK(caspase-12抑制劑)等凋亡抑制劑能夠逆轉7-酮膽固醇(一種脂蛋白沉積氧化產物)誘導的RPE細胞凋亡[8]。β-淀粉樣蛋白(玻璃膜疣的主要成分)通過激活糖基化終末產物受體/核因子κB(NF-κB)信號通路，激活 caspase-3，誘導RPE細胞凋亡[9]。蒺藜醇[10]、白皮杉醇[11]通過激活 PI3K/Akt-Nrf2 信號通路，以Nrf2作為轉錄因子，誘導抗氧化基因 (HO-1、NQO1、GCLC、SOD1) 表達，降低氧化應激誘導的RPE細胞凋亡。異染色質通過抑制 P53 介導的RPE凋亡，緩解AMD病情[12]。Krüppel樣轉錄因子4通過激活白細胞介素-17受體A介導的炎癥反應，誘導RPE細胞凋亡[13]。miRNA是一類非編碼RNA，在許多疾病過程中起著不可或缺的作用。Liu 等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-21-3p可負性調控G蛋白信號調節(jié)因子4誘導的 caspase-3 活性，促進RPE細胞凋亡。miR-144 通過直接靶向作用于Nrf2，促進Nrf2降解，抑制Nrf2介導的抗凋亡作用[15]；同樣，miR-626通過靶向kelch樣 ECH 關聯(lián)蛋白1，抑制其與Nrf2結合，促進Nrf2入核，激活Nrf2介導的抗凋亡作用[16]。miR-374a 則通過靶向 FasL/Fas 通路抑制 caspase-3 激活[17]。由此可見，細胞凋亡與干性AMD關系密切，它在干性AMD的預防和治療中的作用有待進一步研究。

3.2 細胞自噬與干性AMD細胞自噬是一種廣泛存在的溶酶體依賴的細胞內降解過程，主要分為巨自噬、微自噬和伴侶介導的自噬。自噬的經典過程可以概括為：(1)引發(fā)/成核；(2)延伸；(3)成熟；(4)融合和降解。多種蛋白參與了這一過程，包括自噬相關蛋白、自噬基因Beclin-1、p62蛋白、mTOR、微管相關蛋白輕鏈3[18]。

在干性AMD的發(fā)展中，視網膜組織不斷產生視黃醛、脂褐素、受損蛋白質、玻璃膜疣等毒性細胞代謝物，自噬能有效地清除RPE細胞中的細胞代謝物，緩解AMD的進展[19]。RPE細胞自噬功能障礙在AMD的發(fā)展中起著關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，AMD患者RPE細胞的自噬流水平顯著降低[20]。自噬核心基因 ATG5 和 ATG7 敲除小鼠可呈現(xiàn)AMD樣表型，表現(xiàn)為RPE細胞增厚、肥大(或營養(yǎng)不良)、色素異常、氧化蛋白積聚等[21]。自噬激動劑雷帕霉素能夠通過激活自噬，誘導清除受損線粒體，緩解AMD進一步發(fā)展[22]。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(或敲除 Beclin-1)通過抑制自噬增加了線粒體氧化應激，誘導脂褐素沉積，誘發(fā)RPE細胞凋亡[23]。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍(AMP 依賴的蛋白激酶激動劑)通過激活 AMP 依賴的蛋白激酶/mTOR信號通路，激活自噬從而緩解RPE細胞凋亡[24]。RS9(Nrf2 激動劑)可通過激活AMP依賴的蛋白激酶/mTOR 通路促進自噬，進而激活 P62/Nrf2維持RPE細胞的功能[25]。趨化因子受體5通過 PI3K/AKT 信號通路，抑制轉錄因子 FOXO1 的激活，從而調節(jié)RPE細胞的穩(wěn)態(tài)和自噬調控相關基因的表達[26]。miR-29在RPE細胞中過表達會導致p62降低、微管相關蛋白輕鏈3脂質形式增加、自噬通量增加。此外，miR-29 通過靶向信使 RNA 的 3’-UTRs 轉錄后進一步抑制mTORC1的活性，誘導細胞自噬[27]。NF-κB 激活可誘導 miR-24 表達降低，進而激活AKT/mTOR信號通路抑制自噬,誘導RPE細胞功能障礙[28]。以上研究均表明，自噬對RPE細胞起著重要的保護作用，自噬功能障礙可能會加劇氧化應激并導致干性AMD的發(fā)病，它可作為新的治療靶點。

3.3 細胞壞死性凋亡與干性AMD細胞壞死性凋亡是當正常凋亡途徑被抑制時發(fā)生的一種替代性程序性細胞死亡。它主要由RIPK1、 RIPK3和混合譜系激酶結構域樣假激酶調節(jié)。RIPK1/ RIPK3介導后者的磷酸化，啟動下游信號，誘導細胞壞死性凋亡[29]。

在AMD患者和小鼠中均能觀察到細胞腫脹、空泡等細胞壞死性凋亡的特征。在氧化應激作用下，RPE細胞可檢測到細胞膜通透性降低、RIPK1 和 RIPK3 激活、細胞核高遷移率族蛋白1釋放[30]。dsRNA(玻璃膜疣的一種成分)能夠誘導視網膜壞死和炎癥反應，而敲除 RIPK3 能夠降低細胞核高遷移率族蛋白1、腫瘤壞死因子-ɑ、IL-6 等炎癥因子含量，緩解視網膜壞死和炎癥反應[31]。在不同AMD動物模型中，RIPK1 抑制劑能保護RPE細胞免受壞死性凋亡的影響，維持了視網膜的視覺功能[32]，且具有良好的角膜滲透性，是臨床干性AMD治療候選藥物之一。4-乙酰氧基苯酚通過抑制 RIPK3 的激活，穩(wěn)定Nrf2，上調 NQO1 和 HO-1 抗氧化基因表達，保護RPE細胞，避免發(fā)生氧化應激所致的細胞壞死[33]。β-淀粉樣蛋白可以通過激活 Toll 樣受體4 (TLR4) /NF-κB 信號通路,誘導 IL-6、IL-8 和 IL-33 等炎癥因子的表達，介導RPE細胞壞死性凋亡；COBRA (TLR4 抑制劑)可逆轉以上現(xiàn)象[34]。Klettner 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，TLR3、TLR4 激動劑和腫瘤壞死因子-ɑ 均能夠誘導RPE細胞分泌 IL-6 和 IL-8，降低RPE細胞活性和細胞功能，導致視網膜萎縮變性。以上研究均證實了細胞壞死性凋亡在干性AMD發(fā)病過程中起到關鍵性作用。

3.4 細胞焦亡與干性AMD細胞焦亡(也稱炎性壞死)是一種依賴于 Gasdermin 蛋白家族膜打孔功能的裂解性程序性細胞死亡，通常與 caspase 激活有關。細胞焦亡可由不同的炎癥小體介導，目前對NLRP3 研究最為廣泛。NLRP3 炎癥小體由 NLRP3、凋亡相關微粒蛋白和活化的 caspase-1 組成[36]。激活 NLRP3炎癥小體后，以蛋白水解的方式切割炎癥因子前體，如 IL-1β、IL-18、Gasdermin D 等，會誘發(fā)細胞焦亡。

2012年，人們首次研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3 與AMD相關[37]，從AMD患者眼球中分離出的玻璃膜疣成分可激活外周髓細胞和單核細胞中的 NLRP3 炎癥小體和 caspase-1,進而促進 IL-1β 和 IL-18 的分泌。選擇性的 NLRP3 抑制劑 (IFM-514、IFM-632 和 CRID3) 可顯著抑制RPE細胞焦亡以及氧化損傷[38]。caspase-1 敲除小鼠視網膜炎癥反應減少、光感受器細胞存活率升高、視網膜功能得到更好的保護[39]。Kerur等[40]研究發(fā)現(xiàn)，干性AMD患者和小鼠模型中可以檢測到 caspase-4、Gasdermin D 等含量升高。氧化型低密度脂蛋白能夠誘導RPE細胞 NLRP3、 caspase-1 和 IL-1β 的表達增加，而 INF39 (NLRP3 抑制劑) 能逆轉其誘導的細胞焦亡[41]。光氧化刺激RPE細胞可以促進外泌體分泌，并通過上調 NLRP3、IL-1β、IL-18 和 caspase-1 的表達加重細胞的氧化損傷以及焦亡[42]。microRNA-22-3p 通過直接靶向結合NLRP3，抑制 NLRP3 誘導的細胞焦亡，緩解AMD病程[43]。拉米夫定(核苷類似物逆轉錄酶抑制劑)通過抑制 NLRP3，顯著降低 RNA 誘導的人和小鼠RPE細胞 IL-18、IL-1β 和 p16 的表達，緩解RPE細胞衰老[44]。β-淀粉樣蛋白可以誘導RPE細胞產生腫脹、起泡、膜破裂等焦亡形態(tài)學特征，且伴隨著 IL-1β、IL-18 等細胞焦亡表型指標增加，其機制可能通過激活 NLRP3/caspase-1/GSDMD-N 信號通路誘導細胞焦亡；枸杞多糖則可通過抑制β-淀粉樣蛋白誘導的細胞焦亡緩解RPE細胞功能障礙[45]。Gao等[46]研究發(fā)現(xiàn)，當細胞焦亡被激活時，X-連鎖凋亡抑制蛋白表達下調，其可能通過抑制 caspase-1/IL-1β/IL-18 信號通路抑制RPE細胞焦亡?；ㄇ嗨?3-葡萄糖苷[47]通過抑制 c-Jun氨基末端激酶/活化蛋白-1信號通路，抑制NLRP3、IL-1、IL-18 和 caspase-1 相關細胞焦亡基因的表達，從而減輕RPE細胞焦亡。以上體內外研究均證實，細胞焦亡在AMD的發(fā)病機制中起著重要作用，抑制細胞焦亡可能成為治療或延緩AMD的新途徑。

3.5 細胞鐵死亡與干性AMD細胞鐵死亡是以鐵離子誘導的膜脂質過氧化為特征的程序性細胞死亡。在二價鐵和脂氧合酶的作用下，催化細胞膜上高表達的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化；同時由于膜脂修復酶GPx4失效，誘導細胞死亡[48]。其生物學特征主要為Fe2+濃度升高，GPx4 失活和谷胱甘肽濃度降低。

Hahn 等[49]研究發(fā)現(xiàn)，AMD患者視網膜中總鐵含量高于同齡健康人，鐵誘導生成的氧自由基參與AMD中RPE細胞的損傷過程。谷胱甘肽是RPE細胞中重要的抗氧化劑，AMD患者視網膜中谷胱甘肽含量顯著降低，并且伴隨著GPx4活性降低。RPE細胞中谷胱甘肽含量下降能夠誘導細胞鐵死亡、自噬和衰老，而給予鐵死亡抑制劑去鐵胺(抑制Fe2+)、鐵抑素-1(抑制脂質過氧化)或補充谷胱甘肽能逆轉以上現(xiàn)象，說明鐵死亡在AMD疾病進展中的重要性[50]。AMD患者視網膜中視黃醛含量顯著升高，過量視黃醛可誘導光感受器細胞中?；o酶A合成酶長鏈家族成員4表達升高，并可抑制溶質載體家族7成員11，誘導細胞內半胱氨酸含量降低，抑制谷胱甘肽合成，促進脂質過氧化，共同加速細胞鐵死亡[51]。硒蛋氨酸通過激活Nrf2進而誘導其靶基因溶質載體家族7成員11的表達[52]，增加細胞內半胱氨酸的含量，增加谷胱甘肽合成，增強RPE細胞的抗氧化能力，緩解鐵死亡。黃芪甲苷作為一種潛在的視網膜保護劑，可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶和 NF-κB 信號通路，進而抑制RPE細胞中鐵離子調節(jié)相關蛋白的表達，降低細胞內 Fe2+含量，抑制細胞鐵死亡[53]。因此，抑制鐵死亡可以作為治療干性AMD的新靶點。

4 總結與展望

RPE細胞發(fā)生程序性細胞死亡在干性AMD的病程發(fā)展中起著重要作用。凋亡、自噬、壞死性凋亡、焦亡和鐵死亡這5種程序性細胞死亡有可能成為治療干性AMD的新靶點。進一步深入研究程序性細胞死亡與干性AMD的發(fā)病機制的關系至關重要，可為臨床AMD的早期診斷和治療提供理論依據(jù)。