張 夢 王欣玲

非動脈炎性前部缺血性視神經(jīng)病變(NAION)是僅次于青光眼的第二常見的視神經(jīng)病變[1]，一般在 50 歲以上的中老年人群發(fā)病，多發(fā)于57～65歲[2]。在美國，NAION發(fā)病率為(2.3～10.2)/100 000[3]。有報道顯示，我國NAION的發(fā)病率為1/16 000[4]。因該病對患者視力損害以及生活影響極大，對其機(jī)制的研究顯得十分重要。有文獻(xiàn)報道，銀杏葉可通過清除自由基、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等發(fā)揮藥理作用[5]。目前已經(jīng)將銀杏葉應(yīng)用于臨床NAION患者的治療，并發(fā)現(xiàn)其對患者的臨床癥狀有明顯的改善，但由于銀杏葉成分復(fù)雜多樣，作用機(jī)制尚未十分明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從多角度對基因、代謝、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)整合調(diào)節(jié)，從分子層面揭示藥物作用于復(fù)雜疾病的潛在機(jī)制[6-7]。 本研究便基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，從銀杏葉治療NAION的主要活性成分和靶點出發(fā)，揭示銀杏葉治療NAION的潛在分子機(jī)制，供臨床應(yīng)用以及科學(xué)研究參考。

1 方法

1.1 藥物活性成分和潛在靶點篩選在TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)中以銀杏葉為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，根據(jù)藥代動力學(xué)參數(shù)，以藥理活性的兩個重要評價指標(biāo)(口服生物利用度≥ 30%[8]和類藥物≥ 0.18[9])為篩選條件，獲得銀杏葉的生物活性成分，并獲得其潛在的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。使用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，限定條件為人源并已經(jīng)過驗證，將各個活性成分對應(yīng)的靶點蛋白進(jìn)行基因名的轉(zhuǎn)換，用于進(jìn)一步研究。

1.2 疾病靶點篩選通過GeneCards、OMIM、disgenet、drugbank、TTD、Digsee數(shù)據(jù)庫分別獲得NAION的作用靶點，去除重復(fù)值得到其主要作用靶點，同樣經(jīng)過Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)換，刪除未經(jīng)過驗證的無效靶點，得到NAION的潛在靶點基因。

1.3 獲取疾病-藥物交集基因利用Venn在線軟件，輸入銀杏葉作用靶點以及NAION的潛在靶點基因，得到交叉靶點，以此作為銀杏葉治療NAION的潛在作用靶點，得到數(shù)據(jù)集。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將上述交集基因?qū)隨TRING網(wǎng)絡(luò)平臺(https://string-db.org/)，將蛋白相互作用數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape(version 3.8.2)軟件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，以構(gòu)建蛋白網(wǎng)絡(luò)圖(PPI網(wǎng)絡(luò)圖)。

1.5 主要活性成分以及核心靶點的篩選通過Cytoscape 3.8.2 軟件進(jìn)行拓?fù)浞治觯肗etwork Analyzer插件中三個重要參數(shù)：度值、介數(shù)中心性和中心接近度作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，參數(shù)較高的節(jié)點視為關(guān)鍵節(jié)點，從而篩選出Hub靶點基因集，構(gòu)成Hub集。利用CytoHubba插件，選取MCC為最優(yōu)算法[10]篩選出靶點基因集，構(gòu)成MCC集。利用MCODE插件進(jìn)行聚類分析，篩選出各個功能模塊所涉及的靶點基因集，構(gòu)成MCODE集。以上三種方法得到的交集基因即為核心靶點，其對應(yīng)的藥物成分認(rèn)為是產(chǎn)生藥效的主要活性成分。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行生物富集分析，其包括GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。將藥物和疾病交集靶點導(dǎo)入該數(shù)據(jù)庫，以P<0.05、錯誤檢出率(FDR)<0.05為顯著性閾值，預(yù)測銀杏葉治療NAION的可能機(jī)制。

1.7 構(gòu)建藥材-化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖通過KEGG通路富集分析得到銀杏葉作用NAION的主要通路以及對應(yīng)的靶點基因，導(dǎo)入Cytoscape-3.8.2中進(jìn)行可視化，得到藥材-化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，并對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，得到其中作用程度較大的通路，視為銀杏葉治療NAION的主要信號通路。

1.8 分子對接驗證為進(jìn)一步了解藥物活性成分和核心靶點之間相互作用程度并深入了解其分子對接情況，將1.1得到的銀杏葉主要活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索其分子結(jié)構(gòu)，并在Chemoffice 3D(2019版)中進(jìn)行能量最小化等優(yōu)化處理后，保存為mol2格式。再從Uniprot數(shù)據(jù)庫中得到核心靶點蛋白的結(jié)構(gòu)，并從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫篩選含有配體分子(不包括離子和復(fù)雜結(jié)構(gòu))、分辨率高且蛋白鏈數(shù)少的3D 分子結(jié)構(gòu)下載并保存為pdb 格式。最后利用SYBYL-X 2.0軟件構(gòu)建活性成分的分子表單數(shù)據(jù)庫，對靶點蛋白做刪除無效配體、分配電荷、去結(jié)晶水、加氫等前處理，選擇與小分子相似的配體作為活性口袋位點，將其與活性成分的分子表單數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分子對接，通過Total Score對對接結(jié)果進(jìn)行分析，對接復(fù)合物的穩(wěn)定性與該值大小呈正比，該值越大，說明化合物與受體的結(jié)合程度越好[11]。

2 結(jié)果

2.1 銀杏葉中活性成分與靶蛋白的篩選從TCMSP分析平臺得到銀杏葉中307種有效成分，并根據(jù)藥代動力學(xué)參數(shù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到銀杏葉中27個化合物符合標(biāo)準(zhǔn)，其中有7個成分無靶點，故得到20個活性成分(表1)。利用UniProt 數(shù)據(jù)庫校正并保留有效數(shù)據(jù)之后則得到20個活性成分的521個靶點。其中靶點最多的前5個化合物分別為：槲皮素、山奈酚、毛地黃黃酮、β-谷甾醇、異鼠李素。

表1 銀杏葉中主要化合物以及其藥代動力學(xué)參數(shù)

2.2 NAION靶點篩選通過GeneCards、OMIM、disgenet、drugbank、TTD、Digsee數(shù)據(jù)庫分別獲得NAION的作用靶點，去除重復(fù)值后得到756個主要作用靶點。

2.3 藥物和疾病靶點的交集將得到的藥物靶點與疾病靶點通過Venny2.1軟件作圖工具平臺取交集，得到銀杏葉和NAION的共同作用靶點26個。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將26種疾病與藥物的交叉靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，調(diào)節(jié)參數(shù)：物種限制為 “Homo sapiens”，設(shè)定最低蛋白相互作用閾值為中等可信度(可信度>0.400)，隱藏網(wǎng)絡(luò)中無關(guān)聯(lián)節(jié)點，獲得蛋白質(zhì)相互作用信息，該網(wǎng)絡(luò)圖中有26個節(jié)點、114條邊，每個節(jié)點連接的靶點數(shù)目越多，代表此靶點越重要，可能成為核心靶點。

將上述蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)信息導(dǎo)入Cytoscape中。度值大小決定節(jié)點面積大小以及顏色深淺，節(jié)點面積越大、顏色越深則代表該靶點在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中越重要，節(jié)點的平均值為8.77(圖1)。

圖1 基于Cytoscape軟件的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 主要活性成分和靶點的篩選在Cytoscape-v3.8.2中對PPI網(wǎng)絡(luò)圖使用Network Analyzer工具行拓?fù)浞治觯肊xcel獲取拓?fù)鋮?shù)度值、介數(shù)中心性和中心接近度的中位數(shù)分別是9.5、0.025、0.59，并篩選出大于其中位數(shù)的靶點構(gòu)成Hub集。

在CytoHubba插件拓?fù)浞治鲋杏?2種算法，選擇MCC為最優(yōu)算法，篩選出排名前1/2的靶點基因12個，排名由高到低分別為：VEGFA、RELA、JUN、EGF、FOS、ESR1、MMP2、HIF1A、MYC、NOS3、APP、IL2，構(gòu)成MCC集。

同樣利用MCODE插件對 PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，默認(rèn)參數(shù)設(shè)置識別出3個蛋白質(zhì)模塊，同一蛋白質(zhì)模塊中的蛋白質(zhì)靶點相互作用更緊密且功能特征相近，共涉及關(guān)鍵靶點24個，構(gòu)成MCODE集(表2)。其中MCODE1中有12個節(jié)點和58條邊,核心節(jié)點為NOS3，剩余節(jié)點圍繞其聚集，MCODE1的分?jǐn)?shù)為10.545，為三個模塊中分?jǐn)?shù)最高的蛋白模塊，可認(rèn)為最主要核心和功能靶點在此聚集。

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)節(jié)點聚集分析結(jié)果

將以上3種方法篩選出的核心靶點導(dǎo)入在線網(wǎng)絡(luò)平臺Venny2.1得到三者的交集，篩選出交集靶點共8個，分別為VEGFA、JUN、EGF、RELA、APP、ESR1、FOS、MYS，經(jīng)過Uniprot數(shù)據(jù)庫校正并得到銀杏葉治療NAION的主要靶點。

2.6 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析利用 David 數(shù)據(jù)庫對銀杏葉治療NAION的26個交集靶點進(jìn)行GO功能富集分析(P<0.05、FDR <0.05)，共得到62條信號通路，其中生物過程19條、細(xì)胞成分12條、分子功能31條(圖2列出了生物過程、細(xì)胞成分和分子功能中的前10個條目)，發(fā)現(xiàn)銀杏葉治療NAION的交集靶點GO功能富集分析主要涉及血管生成反應(yīng)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、血小板活化反應(yīng)、應(yīng)對缺氧等，參與細(xì)胞膜、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、細(xì)胞空隙以及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞組分，以及參與酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、生長因子結(jié)合、一氧化氮合酶活性等分子功能。

圖2 GO功能富集分析

對銀杏葉與NAION的共同靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析(P<0.05、FDR <0.05)，得到77條信號通路，其中前15條富集結(jié)果利用R語言軟件進(jìn)行可視化(圖3)。富集基因數(shù)和P值決定節(jié)點的顏色與大小，顏色從紅色到紫色代表P值從小到大，節(jié)點從大到小代表富集基因數(shù)從多到少，F(xiàn)DR與相關(guān)聯(lián)基因數(shù)呈反比。篩選出用于研究內(nèi)容相關(guān)的信號通路，結(jié)果顯示，銀杏葉主要通過癌癥通路、癌癥中膽堿代謝信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等多條通路對NAION起作用，通路上涉及的靶點越多則代表該通路在銀杏葉治療NAION過程中發(fā)揮作用的可能性越大。

圖3 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 藥材-化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖將銀杏葉與NAION的交集靶點導(dǎo)入Cytoscape中，得到藥材-化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)(圖4)，圖4中紅色v形代表藥物，淺紫色橢圓代表銀杏葉主要化合物，綠色菱形代表銀杏葉與NAION的交集靶點，橙色四邊形代表KEGG通路。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點越大代表此化合物、靶點或通路在相互作用網(wǎng)絡(luò)圖中越重要?？梢妶D中節(jié)點數(shù)量有112個，386條邊，平均相鄰節(jié)點數(shù)量為6.86。在化合物中節(jié)點最大的為槲皮素、毛地黃黃酮以及山奈酚，提示銀杏葉可能通過槲皮素等化合物起到治療NAION的作用。此網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5的靶點為PIK3CG、PRKCA、PRKCB、RELA、VEGFA。KEGG網(wǎng)絡(luò)通路中節(jié)點度值靠前的有癌癥通路、T細(xì)胞受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等，提示銀杏葉可能通過這幾條通路對NAION起治療作用。

圖4 藥材-化合物-靶點-通路

2.8 分子對接模擬驗證基于 SYBYL2.0軟件，將銀杏葉20個主要化合物與8個核心靶點蛋白進(jìn)行對接計算，以更直接的方式檢驗化合物與靶蛋白之間的分子對接緊密性，經(jīng)篩選，5個化合物與7個核心靶點對接結(jié)果良好，而與FOS靶點結(jié)合程度不佳?？偡衷礁邉t代表分子與靶標(biāo)之間結(jié)合程度越好，總分>4.25分表示有結(jié)合活性，總分>5.00分表示有良好的結(jié)合活性，總分>7.00分則表示有較強(qiáng)的結(jié)合活性[12](表3)。

表3 與靶標(biāo)結(jié)合良好的化合物數(shù)量及其靶標(biāo)生物效應(yīng)

3 討論

NAION為供應(yīng)篩板前區(qū)及篩板區(qū)的睫狀后血管的小分支發(fā)生缺血，致使視盤發(fā)生局部梗死，以致患者突發(fā)單側(cè)視力喪失，無疼痛，但伴有典型的視野缺損(與生理盲點相連的扇形缺損)[13]。長期以來，臨床上對NAION的治療一直以西醫(yī)為主，且大部分臨床醫(yī)生以經(jīng)驗治療為主，國際上目前尚無公認(rèn)、有效的治療方案。除此之外，NAION的發(fā)病機(jī)制同樣存在爭議。有研究顯示，視神經(jīng)缺血后導(dǎo)致視盤充血、水腫,進(jìn)而釋放炎癥因子,導(dǎo)致視神經(jīng)進(jìn)一步損傷[14-15]。同樣有研究推測，視神經(jīng)受到缺血缺氧的刺激后,啟動了細(xì)胞凋亡機(jī)制,造成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量減少,從而進(jìn)一步導(dǎo)致視功能的損傷[16]。

銀杏葉主要含黃酮類化合物及萜類成分，為銀杏科植物的干燥葉，主歸心、肺經(jīng)，味甘、苦、澀，性質(zhì)平和?！吨兴幹尽酚涊d：銀杏葉可以收斂肺氣，止咳平喘[17]。中藥藥理學(xué)研究顯示，銀杏葉的治療作用較為廣泛，如改善心血管及周圍循環(huán)功能，改善心肌缺血，促進(jìn)記憶力、改善腦功能等。此外，銀杏葉還具有降低血液黏稠程度及有效清除氧自由基的功效[18]。目前，銀杏葉也逐漸用于NAION的治療，但其詳細(xì)的治療機(jī)制尚不明確。故基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析銀杏葉單味中藥在治療NAION中的作用機(jī)制和關(guān)鍵通路有重要意義。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，檢索到銀杏葉包含的20個活性化合物的521個靶點，與NAION的756個疾病相關(guān)靶點進(jìn)行基因映射，獲得26個映射基因，構(gòu)建了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。銀杏葉中槲皮素、山柰酚和毛地黃黃酮幾個成分自由度較高，表明這幾個成分在治療NAION方面起主要作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，槲皮素能夠清除超氧自由基并減輕氧化應(yīng)激的損傷，還可以通過降低對炎癥因子的反應(yīng)和抑制細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗炎和抗凋亡作用[19]，與此同時，槲皮素還可以舒張血管，繼而起到治療NAION的效果[20]。山奈酚與木犀草素也具有抗炎與抗氧化作用[21]，且與本研究結(jié)果相一致的是，木犀草素在腦內(nèi)神經(jīng)缺血缺氧過程中可減輕神經(jīng)炎癥并有神經(jīng)保護(hù)的作用[22-23]。

在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中經(jīng)過三種方法的篩選并相互整合，得到銀杏葉治療NAION的核心靶點基因：VEGFA、JUN、EGF、RELA、APP、ESR1、FOS、MYC;銀杏葉主要通過這幾個核心靶點治療NAION。由于NAION主要機(jī)制為睫狀后短動脈供應(yīng)不足引起的視盤循環(huán)的短暫破壞導(dǎo)致灌注不足和缺血，有研究表明[24-25]，VEGFA、EGF在缺血缺氧環(huán)境中可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成并促使血管通透性的增加。在NAION的病理過程中，缺血缺氧則會使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)，促使細(xì)胞內(nèi)釋放大量的炎癥因子，MYC基因與RELA基因在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。RelA/p65是NF-κB復(fù)合體，有研究指出，凋亡的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)中NF-κB和TNF-α的表達(dá)增加[26]。抑制AMPK、激活和刺激HCAR1-ARRB2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可減少NF-κB和TNF-α的表達(dá)增加，具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[27]。MYC基因是較早發(fā)現(xiàn)的一組癌基因,有研究發(fā)現(xiàn)，N-Myc下游調(diào)控基因(NDRG)在囊泡運(yùn)輸、應(yīng)激反應(yīng)以及神經(jīng)再生等方面具有明顯的作用[19]。 對于APP、FOS、ESR1，均有報道顯示它們參與神經(jīng)疾病損傷的病理過程[28-29]，在神經(jīng)元細(xì)胞的興奮性以及神經(jīng)元細(xì)胞的可塑性和突觸的可塑性方面起著重要的神經(jīng)保護(hù)作用[30-33]。綜上，銀杏葉通過多靶點參與缺血缺氧、氧化應(yīng)激以及炎癥等病理過程以治療NAION。

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，銀杏葉治療NAION涉及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些通路主要使RGC適應(yīng)缺血缺氧的環(huán)境，并產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)因子以延長RGC的壽命，減少凋亡。在諸多通路中，癌癥信號通路排第一，其中最為典型的可有Wnt信號通路[34]。研究表明，高水平的Norrin和隨后在RGC中Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活可防止通過IGF-1引起的視神經(jīng)軸突損傷，從而引起PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性增加；并且Norrin可減輕青光眼小鼠模型中RGC及其軸突的慢性損傷，從而起到一定的保護(hù)RGC的作用[35]。這與本研究結(jié)果相一致，即銀杏葉通過提高Norrin蛋白的表達(dá)，減輕因缺血而造成的RGC的損傷。此外本研究還顯示，銀杏葉治療NAION過程中涉及PI3K-Akt信號通路，這與之前報道的提高PI3K-Akt信號通路以及相關(guān)蛋白且提高缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)可以提高組織對缺血缺氧的適應(yīng)相符合[36-38]。而Wang等[39]研究顯示，抑制MAPK信號通路可以有效地改善缺血缺氧造成的神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡與損傷，并能促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的功能修復(fù)。

綜上，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究了銀杏葉活性成分治療NAION的潛在作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀杏葉可通過多成分、多靶點、多途徑對NAION發(fā)揮治療作用。與以往的傳統(tǒng)藥理學(xué)研究相比，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)研究獲得了一定的突破，為后期圍繞預(yù)測得到的化合物、作用靶點及信號通路進(jìn)一步深入探究銀杏葉治療NAION機(jī)制的實驗驗證開辟新思路。