郭楊燕 孫行云 孟繁興 王 樂 李楠楠

北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院腦病一科，北京 100078

腦梗死是指由于多種原因引起腦細(xì)胞缺血缺氧性病變壞死，同時(shí)產(chǎn)生相對應(yīng)的神經(jīng)功能缺損癥的疾病，約占腦血管疾病的70%[1]，是中國居民十大死亡原因之首[2-3]?！吨袊X梗死中西醫(yī)結(jié)合診治指南2017》[4]推薦中西醫(yī)綜合治療腦梗死。中醫(yī)治療腦梗死多以活血通絡(luò)為主，以三七類活血化瘀藥為代表的血塞通在臨床應(yīng)用廣泛。有研究顯示，血塞通可上調(diào)患者腦梗死后血清中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）通路信號的表達(dá)[5]，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。可溶性Fms 樣酪氨酸激酶1（soluble FMS-like tyrosine kinase 1，sFlt-1）可與VEGF高親和力結(jié)合，抑制VEGF通路信號的表達(dá)，具有抗新血管生成作用[6]。sFlt-1 與VEGF、VEGFR-2 相互制約，共同維持血管正常生理功能。本研究擬建立小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型，探究血塞通注射液對OGD/R損傷小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF、VEGFR-2 和sFlt-1 蛋白表達(dá)的影響，探究其對VEGF通路表達(dá)的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系（bEnd.3）（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 血塞通注射液（云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號：20170913，規(guī)格：2 ml∶100 mg/支）。

1.1.3 主要試劑及器材 β-actin（Proteintech）；羊抗鼠-HRP（Abmart，貨號：M21001L）；羊抗兔-HRP（上海華安，貨號：HA1001）；蛋白marker（北京全氏金生物技術(shù)有限公司，貨號：DM111）；VEGFA Mouse（abclonal，貨號：A17877）、VEGF Receptor 2（abclonal，貨號：A5609）；soluble VEGF Receptor 1（Invitorgen，貨號：36-1100）；缺氧培養(yǎng)裝置（MIC-101，Billups-Rothenberg）；酶標(biāo)儀（ELX800，Bio-Teck）；電泳儀（EPS300，Tanon）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 OGD/R 模型的建立 氧糖剝奪階段:吸棄細(xì)胞原培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液漂洗1 次，以無糖Kreb’s液代替完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，放入模塊化缺氧培養(yǎng)裝置，向裝置內(nèi)通入混合氣體（預(yù)混的95%N2+5%CO2），充分置換空氣10 min，測氧儀測試氧氣含量為0 后，夾閉進(jìn)、出氣口，將裝置連同細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中孵育6 h。復(fù)氧階段：缺氧培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄無糖Kreb’s 液，使用磷酸鹽緩沖液漂洗1 次，再以完全培養(yǎng)基在正常條件下培養(yǎng)不同的時(shí)間。

1.2.2 氧糖剝奪6 h 對不同種板濃度細(xì)胞活力的影響取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種至2 個(gè)96 孔板上，分為板1 和板2。種板的細(xì)胞濃度梯度為5×105、2.5×105、1×105、5×104、2.5×104、1×104個(gè)/ml。每列設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，空白部分添加磷酸鹽，板1 做氧糖剝奪造模處理6 h，板2 做正常培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后用CCK-8 溶液給細(xì)胞換液并置于培養(yǎng)箱孵育1 h，取出后用酶標(biāo)儀分別檢測2 個(gè)板在450 nm 處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%，As 為造模處理的實(shí)驗(yàn)孔OD 均值，Ab 為只含培養(yǎng)基的空白孔OD 均值，Ac 為正常處理的對照孔OD 均值，As-Ab 為板1 的去空白數(shù)據(jù)均值，Ac-Ab 為板2 的去空白數(shù)據(jù)均值。

1.2.3 不同濃度血塞通在不同復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)對造模后細(xì)胞活力的影響 根據(jù)“1.2.2”結(jié)果確定細(xì)胞種板濃度。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4]，選擇血塞通終藥濃度12.5、25、50、100 mg/L 共4 個(gè)安全濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)，復(fù)氧時(shí)間選擇3、6、12 h 共3 個(gè)水平。實(shí)驗(yàn)分為造模組和實(shí)驗(yàn)組，均造模處理6 h。復(fù)氧階段，造模組以完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組分別以不同濃度的血塞通+完全培養(yǎng)基混合液培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種至3 個(gè)96孔板內(nèi)行氧糖剝奪造模處理6 h。造模結(jié)束后，對3 塊板2～6 列依次按完全培養(yǎng)基、12.5、25、50、100 mg/L濃度的血塞通+完全培養(yǎng)基混合液的順序統(tǒng)一換液，每列設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。復(fù)氧階段：板1 的復(fù)氧時(shí)間為3 h，板2 的復(fù)氧時(shí)間為6 h，板3 的復(fù)氧時(shí)間為12 h。采用CCK-8 法檢測細(xì)胞存活率，方法同上。

1.2.4 Western blot 檢測細(xì)胞中VEGF、VEGFR2 和sFlt-1 蛋白表達(dá)的水平 根據(jù)“1.2.3”結(jié)果，選用OGD6h/R6h、血塞通濃度100 mg/L 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種至96 孔板內(nèi)，分為正常組、造模組和實(shí)驗(yàn)組。正常組以完全培養(yǎng)液正常培養(yǎng)12 h；造模組氧糖剝奪培養(yǎng)6 h，復(fù)氧階段以完全培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h；實(shí)驗(yàn)組氧糖剝奪培養(yǎng)6 h，復(fù)氧階段給終藥濃度100 mg/L 的血塞通+完全培養(yǎng)基混合液培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞沉淀于離心管中，加入150 μl裂解液于冰上裂解30 min，-4℃、60 mm、12 000 r/min，離心15 min。BCA 試劑盒測蛋白濃度，根據(jù)結(jié)果配制分離膠、濃縮膠。將蛋白樣品與5×loading buffer 混合后于100℃處理5 min，每孔上樣100 μg 細(xì)胞總蛋白。使用SDS-PAGE 預(yù)制膠以15 mA 恒流電源進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，室溫?fù)u床封閉2 h。加入1∶5000 β-actin 抗體，1∶250 VEGFA Mouse 抗體，1∶500 VEGF Receptor 2，1∶50 soluble VEGF Receptor 1，4℃孵育過夜。洗去多余一抗，加入用封閉液稀釋HRP 標(biāo)記二抗（1∶1000），37℃搖床孵育2 h。超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，Image J 軟件進(jìn)行灰度值測定分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用重復(fù)測量方差分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OGD/R 模型對細(xì)胞形態(tài)的影響

正常培養(yǎng)6 h 后，細(xì)胞胞漿豐富，呈“旋渦狀”緊密排列，邊界清晰。缺氧造模6 h 后，細(xì)胞回縮，部分細(xì)胞變圓漂浮，細(xì)胞間連接斷裂、間隙變大。見圖1。

圖1 正常培養(yǎng)及氧糖剝奪造模6 h 后細(xì)胞形態(tài)（40×）

2.2 最適細(xì)胞種板濃度的確定

氧糖剝奪6 h 后，不同種板濃度的細(xì)胞存活率分別如下。①5×105個(gè)/ml：70.306%；②2.5×105個(gè)/ml：69.070%；③1×105個(gè)/ml：63.112%；④5×104個(gè)/ml：58.947%；⑤2.5×104個(gè)/ml：50.922%；⑥1×104個(gè)/ml：42.039%。細(xì)胞濃度為2.5×104個(gè)/ml 時(shí)，細(xì)胞存活率接近50%，為便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)觀察，選擇此濃度繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 最適血塞通濃度和復(fù)氧時(shí)間的確定

整體分析顯示：各組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），交互作用比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），提示不同濃度血塞通在不同復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)對造模后細(xì)胞活力的影響不同，血塞通濃度與復(fù)氧時(shí)間不存在協(xié)同作用。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較：各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），提示相同濃度血塞通在不同復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)對造模后細(xì)胞活力的影響不同。組間比較：復(fù)氧3、6、12 h，不同濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力均高于造模組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），提示相同復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)下不同濃度血塞通對造模后細(xì)胞活力的影響不同。其中，OGD6h/R6h、血塞通作用濃度100 mg/L 時(shí)，造模組與實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力差值最大，提示在該方案下，血塞通對細(xì)胞活力的促進(jìn)效果最顯著，為便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)觀察，選擇此血塞通濃度和復(fù)氧時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1。

表1 不同濃度血塞通在不同復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)對造模后細(xì)胞活力的影響（，n=6）

表1 不同濃度血塞通在不同復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)對造模后細(xì)胞活力的影響（，n=6）

注：與造模組同期比較，aP ＜0.05；與本組復(fù)氧3 h 比較，bP ＜0.05；與本組復(fù)氧6 h 比較，cP ＜0.05

2.4 血塞通對OGD6h/R6h 模型細(xì)胞中VEGF、VEGFR-2和sFlt-1 蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，造模組和實(shí)驗(yàn)組的VEGF、VEGFR-2和sFlt-1 蛋白的表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與造模組比較，實(shí)驗(yàn)組中VEGF 和VEGFR-2蛋白的表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），sFlt-1 蛋白的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖2～3。

圖2 VEGF、VEGFR-2 和sFlt-1 蛋白條帶

圖3 血塞通對OGD6h/R6h 模型細(xì)胞中VEGF、VEGFR-2 和sFlt-1 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

腦梗死又稱為缺血性腦卒中，屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇。病位在腦，常涉及心、肝、腎、脾，病因以積損正衰為主，病機(jī)多為氣血逆亂，腦脈痹阻，治當(dāng)以調(diào)節(jié)臟腑、補(bǔ)氣行血、化痰通瘀為主[7]。目前西醫(yī)治療腦梗死主要以抗凝、抗板、降纖、溶栓為主[8]，較為公認(rèn)的是盡早恢復(fù)受損腦組織及缺血半暗帶的血供、挽救受累的神經(jīng)細(xì)胞，以恢復(fù)正常的神經(jīng)功能[9]。

VEGF 是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長特異的有絲分裂原和血管通透性因子，可特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞已糖化的多功能蛋白，誘導(dǎo)新生血管形成[10]，對MCAO細(xì)胞的恢復(fù)起重要作用[11]。VEGF 主要與其受體VEGFR-2 結(jié)合，高度特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，促進(jìn)腦梗死后缺血區(qū)血管生成和修復(fù)，減少腦梗死的體積、保護(hù)神經(jīng)[12-14]。同時(shí)還可動(dòng)員一些骨髓源細(xì)胞和單核細(xì)胞到血管中，參與血管生成、誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶生成，促使內(nèi)皮細(xì)胞釋放生長因子[15]。因此，VEGF 和VEGFR-2 兩個(gè)蛋白的表達(dá)情況，可間接反映血管新生狀況。sFlt-1 由Flt-1 基因選擇性胞外區(qū)剪接形成，因其缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)域而無細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，主要通過與VEGF 結(jié)合，中和血漿中VEGF 含量；同時(shí)可與VEGFR-2 結(jié)合形成異源二聚體，阻斷VEGF 介導(dǎo)的受體酪氨酸磷酸化，抑制VEGF通道的激活，是VEGF 的內(nèi)源性抑制劑[16-17]。

血塞通為臨床治療腦梗死的常用藥物，其主要成分是提取自中藥三七中的三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）[18]。三七主入肝、胃經(jīng)，功能為散瘀止血，消腫定痛[19]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，三七具有改善能量代謝障礙、保護(hù)血腦屏障、修復(fù)神經(jīng)血管等作用[20]。PNS 可促進(jìn)腦梗死患者的白質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)重塑，改善細(xì)胞毒性及血管源性水腫[21-22]，并可刺激骨髓中干細(xì)胞因子的產(chǎn)生，通過降低黏附分子對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附作用促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向血漿的動(dòng)員，改善梗死區(qū)的微環(huán)境，具有提高梗死區(qū)干細(xì)胞的存活率、促進(jìn)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞之效[23]。研究顯示，聯(lián)合血塞通治療腦梗死效果顯著，具有良好的協(xié)同作用和效果，不良反應(yīng)較少，臨床應(yīng)用安全有效[24-26]。

本研究以缺氧培養(yǎng)裝置和無糖Kreb’s 液制備細(xì)胞OGD/R 模型，體外模擬腦細(xì)胞缺血再灌注損傷的病理過程[27]。篩選出最適細(xì)胞種板濃度、復(fù)氧時(shí)間和血塞通注射液濃度后，在該條件下探究血塞通注射液對細(xì)胞內(nèi)VEGF、VEGFR-2、sFlt-1 蛋白的表達(dá)影響。研究結(jié)果顯示，血塞通注射液對氧糖剝奪損傷后的細(xì)胞具有一定改善細(xì)胞損傷的作用。在蛋白分子水平上，與正常組比較，造模組的VEFG、VEGFR-2 蛋白的表達(dá)明顯升高；與造模組比較，實(shí)驗(yàn)組的VEFG、VEGFR-2 蛋白的表達(dá)更高。提示缺血缺氧等刺激因素使細(xì)胞內(nèi)VEGF 及其受體含量的表達(dá)升高，血塞通注射液使氧糖剝奪損傷的細(xì)胞內(nèi)VEGF 及其受體含量的表達(dá)更高。與正常組比較，實(shí)驗(yàn)組sFlt-1 蛋白表達(dá)升高；與造模組比較，實(shí)驗(yàn)組的sFlt-1 蛋白的表達(dá)降低。提示血塞通注射液可抑制氧糖剝奪損傷的細(xì)胞內(nèi)sFlt-1 蛋白的表達(dá)，起到促進(jìn)VEGF通路表達(dá)的作用。

綜上所述，血塞通注射液可上調(diào)OGD/R損傷的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF通路信號的表達(dá)，且其上調(diào)VEGF通路信號表達(dá)的機(jī)制可能與sFlt-1 蛋白的表達(dá)受到抑制有關(guān)。目前本研究僅從蛋白水平探討血塞通注射液與VEGF通路表達(dá)的關(guān)系，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)深入研究mRNA 水平是否也有相同趨勢的改變。