王晨豫，胡馨勻，魏 勇，陳 杰，曹夢園，陳明杰，齊亞銀＊

1 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003

2 新疆天潤乳業(yè)股份有限公司，新疆烏魯木齊 830000

0 引言

犢牛腹瀉是規(guī)?；翀龀Ｒ姲Y狀，引起癥狀的原因復(fù)雜，主要集中在3月齡內(nèi)，致死率高。新疆晝夜溫差大，而且養(yǎng)殖水平相對落后，大部分牧場沒有犢牛島，在養(yǎng)殖生產(chǎn)上一旦控制不當(dāng)，易造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。犢牛免疫力較弱，對外界環(huán)境抵抗力較差，極易出現(xiàn)腹瀉，病程為5～7天，會逐漸消磨犢牛的生命力，最后導(dǎo)致其脫水死亡。

造成犢牛腹瀉的主要因素有以下幾個方面。一是病毒因素，主要由輪狀病毒、冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）引發(fā)。病毒引起犢牛腹瀉無明顯季節(jié)性，主要以地方性流行。當(dāng)飼養(yǎng)密度過大，環(huán)境中懸浮顆粒較多，潮濕均有利于病毒傳播。通常由妊娠期母牛垂直傳播給犢牛或犢牛對外界抵抗力較弱而被感染。二是細(xì)菌因素，主要是由于犢牛生存在衛(wèi)生條件差、易滋生細(xì)菌和病毒的環(huán)境下而感染大腸桿菌和沙門氏菌引發(fā)。三是寄生蟲因素。主要由以隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲為代表的寄生蟲引發(fā)，且不容易被發(fā)現(xiàn)，往往通過母牛傳染給犢牛。四是飼養(yǎng)因素，主要由飼養(yǎng)人員在哺乳期母牛飼料調(diào)控工作方面出現(xiàn)差錯而引發(fā)。此外，犢牛缺乏營養(yǎng)也常會出現(xiàn)腹瀉的情況[1，2]。

本文通過對新疆某規(guī)模化牧場腹瀉犢牛糞便及血液進(jìn)行檢測，查明該牧場犢牛腹瀉的病因，為該牧場的后續(xù)治療和防控提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

BVDV酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）抗原檢測試劑盒購自IDEXX公司；PrimeScript? RT Master Mix購自TaKaRa公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、TIANamp Virus RNA Kit購自天根生化科技（北京）有限公司；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ購自南京諾唯贊生物科技有限公司；RNA專用氯仿、RNA專用75.00%乙醇、異丙醇等購自生工生物（上海）有限公司。犢牛腹瀉4聯(lián)抗原快速檢測試劑盒購自yoyoung公司。

1.2 樣品來源

2020年12月采集新疆奎屯地區(qū)某牧場48 份3月齡內(nèi)犢牛糞便及血液，血液置于采血器中析出血清，分裝在1.5 mL離心管中放于-20 ℃保存。糞便樣品置于5 mL離心管中，4 ℃保存，運輸回實驗室，立即進(jìn)行細(xì)菌試驗。試驗后糞便樣品轉(zhuǎn)至-80 ℃長期保存。

1.3 犢牛腹瀉4 聯(lián)抗原快速檢測

用棉簽蘸取糞便，插入樣品稀釋管中，混勻，使用一次性滴管吸去混合樣品上清液，緩慢滴加4 滴至測試卡樣品孔中。10 min內(nèi)讀取結(jié)果。

1.4 犢牛血清BVDV抗原檢測

1．4．1 ELISA檢測

從-20 ℃冰箱取出先前采集的各牧場血清，恢復(fù)至室溫后，按照BVDV血清抗原檢測試劑盒產(chǎn)品說明書分別對血清和耳組織進(jìn)行BVDV抗原檢測。

1．4．2 BVDV血清抗原檢測試劑盒結(jié)果判定

檢測計算樣品的校正OD值。被檢樣品的S-N值≤0.300，判為BVDV抗原陰性；被檢樣品的S-N值＞0.300，判為BVDV抗原陽性。

1.5 BVDV病原RT-PCR檢測

1．5．1 樣品制備

采集血清學(xué)抗原檢測陽性牛只的糞便、鼻腔分泌物，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行RT-PCR復(fù)檢。取PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和EB染色后，經(jīng)凝膠成像掃描儀觀察目的片段大小。通過膠回收目的條帶，送檢測序。

1．5．2 引物設(shè)計

根據(jù)Decaro等[3]采用的方法，設(shè)計通用檢測引物（表1），由生工生物（上海）有限公司合成。

表1 BVDV引物序列、位置及大小

1．5．3 RT-PCR擴(kuò)增

按照天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取試劑盒說明書方法提取血清中的RNA，根據(jù)TaKaRa公司的cDNA合成試劑盒說明書方法將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5．4 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件見表2。

表2 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

反應(yīng)結(jié)束后，取8 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.50%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠（EB）染色后，經(jīng)凝膠成像掃描儀觀察目的片段大小。

2 結(jié)果

2.1 犢牛腹瀉病4聯(lián)抗原快速檢測結(jié)果

犢牛腹瀉4聯(lián)抗原快速檢測結(jié)果見表3、圖1，大腸桿菌K99陽性率為43.75%（21/48）。

表3 犢牛腹瀉4聯(lián)抗原快速檢測結(jié)果

圖1 部分犢牛腹瀉4聯(lián)抗原快速檢測結(jié)果

取大腸桿菌陽性糞便放至裝有5 mL 肉湯的培養(yǎng)基中，在搖床中增菌12 h，鏡檢觀察結(jié)果（圖2）。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)液接種于麥康凱瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后，觀察結(jié)果（圖3）。

圖2 大腸桿菌陽性糞培養(yǎng)菌液鏡檢圖片

圖3 培養(yǎng)液接種于麥康凱瓊脂平板圖片

2.2 犢牛血清BVDV抗原檢測

犢牛血清共計48 份，抗原檢測結(jié)果為BVDV抗原陽性4 份，陽性率為8.33%（4/48），見表4。

表4 犢牛血清BVDV抗原檢測

2.3 BVDV RT-PCR 結(jié)果

糞便共計48 份，RT-PCR結(jié)果顯示BVDV陽性糞便為14 份，陽性率為29.17%（14/48），見圖4。

圖4 BVDV病原核酸檢測結(jié)果

2.4 BVDV陽性結(jié)果序列分析

將4 份陽性樣品的測序結(jié)果使用DNAStar Megalign軟件與BVDV基因1-NADL，全基因組M31182.1參考株進(jìn)行序列對比，此次測序的4 份陽性樣品之間的同源性為97.90%～99.20%，XJB-W01株～XJB-W04株與參考基因NADL的同源性分別為67.10%、67.20%、66.70%、65.60%，屬于BVDV-1a型。使用MEGA軟件將測序的4 株BVDV基因與部分參考株做系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果表明，XJB19-01～XJB19-04為同一族，與參考株NADL處于同一進(jìn)化分支。各毒株間的同源性均在97.00%以上；而各毒株樣品與參考基因NADL同源性均在66.00%左右，基因變異較大。同源性比較詳見圖5，系統(tǒng)進(jìn)化樹圖譜詳見圖6。

圖5 各株基因與GenBank上參考基因的同源性比較結(jié)果

圖6 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建結(jié)果

3 討論

犢牛健康是牧場長期發(fā)展的依仗，犢牛腹瀉可對牧場造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，本試驗查明引起該牧場犢牛腹瀉的主要因素是BVDV和大腸桿菌。

BVDV感染會對奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，需要采取有效的防控凈化措施。一是發(fā)現(xiàn)持續(xù)感染牛；二是根據(jù)本地本場的牛群密度和感染率來制定防控措施，采取“免疫-檢疫-淘汰”策略[4]；三是加強(qiáng)牧場的消毒，制定消毒程序，使用復(fù)方醛類、氫氧化鈉、生石灰對圈舍、道路、圈舍周邊綠化帶等進(jìn)行定期消毒[5]。犢牛剛出生后免疫1 次哞樂優(yōu)（BVDV-IBR 二連滅活疫苗），間隔1 個月后加強(qiáng)免疫1 次，全群在每年4—10月中普免2 次。全群每年定期做BVDV抗原檢測，將陽性或疑似陽性牛隔離，采集鼻拭子、糞便或血清送至實驗室提取RNA，使用BVDV檢測引物進(jìn)行RT-PCR復(fù)檢，淘汰陽性犢牛。針對血清陽性率較高的地區(qū)，做好抗原的持續(xù)檢測，持續(xù)免疫，通過淘汰減少陽性牛以及做好綜合性生物安全安保體系，維持BVDV的凈化狀態(tài)[6]。因BVD沒有特效藥物，只能以提高牛只免疫力為主，對癥治療，即時補(bǔ)水，避免脫水死亡[7]。

大腸桿菌引起的犢牛腹瀉以抗生素治療為主，使用大腸桿菌敏感性抗生素，利用藥物互補(bǔ)增效的特點聯(lián)合用藥，從而快速控制癥狀[8]。常用于治療細(xì)菌性腹瀉的藥物有慶大霉素、土霉素、金霉素等。