甘靖宇 ， 孫維婧 ， 盧嘉茵 ， 王子旭 ， 陳耀星 ， 董玉蘭

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京 海淀 100193)

在我國生豬規(guī)模化養(yǎng)殖中，對妊娠期母豬主要采用限位欄養(yǎng)殖模式[1]。該模式雖然便于實施孕期管理，且節(jié)省養(yǎng)殖空間，能夠降低仔豬死亡率(因母豬壓死仔豬引起)[2]，但是狹小的活動范圍卻會給妊娠期母豬帶來嚴重的慢性心理應激危害，出現(xiàn)規(guī)癖行為[3]，影響其飲食攝入、神經(jīng)營養(yǎng)和激素分泌，甚至增加流產(chǎn)概率[4]，危害仔豬健康[5]。2013年，歐盟正式出臺禁止對妊娠期母豬使用限位欄的規(guī)定[6]，以提高動物福利，減輕妊娠期母豬焦慮情緒，減少由于應激帶來的潛在疾病，從而提高母豬生產(chǎn)性能和養(yǎng)殖效率。

本試驗使用妊娠巴馬小型豬進行18 d限位欄飼養(yǎng)，建立制動應激模型，通過檢測血漿中應激相關激素水平驗證動物應激模型的有效性后，檢測應激相關受體表達水平，分析制動應激對孕豬下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能的影響，為研究限位欄養(yǎng)殖對孕豬的神經(jīng)內(nèi)分泌功能和器官性損傷提供可參考的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 豬促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素ELISA試劑盒(CEA835Po)、豬5-羥色胺ELISA檢測試劑盒(CEA808Ge)，均為武漢云克隆科技股份有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(A5001)，北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器 多管放射免疫計數(shù)器BFM-96(合肥眾成機電技術(shù)公司)；實時熒光定量PCR儀(StepOneplus公司)；電泳儀(伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司)；超微量紫外分光光度計(Implen公司)。

1.3 實驗動物 巴馬小型豬，雌性，8～9月齡，體重20～30 kg，購自北京實創(chuàng)小型豬養(yǎng)殖基地。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗設計 6頭巴馬小型豬成功配種后隨機分為2個組，分別為試驗組和對照組，每組3頭。對照組可自由活動；試驗組單獨飼養(yǎng)于50 cm×60 cm×100 cm的金屬籠中，模擬限位欄養(yǎng)殖方式，制作制動應激模型，其余飼養(yǎng)管理相同。分組飼養(yǎng)后的第18天上午處死小型豬。

1.4.2 樣品采集與保存 制動應激處理前1天記為D 0(發(fā)情期)，試驗期間分別于D 0、D 5、D 10和D 18采集孕豬頸靜脈血樣。18 d制動應激結(jié)束后，麻醉孕豬并心臟放血處死。迅速打開腹腔采集腎上腺，剔除脂肪稱重后，左側(cè)用液氮凍存，右側(cè)置于4%多聚甲醛固定。

1.4.3 ELISA檢測 檢測血漿中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin releasing hormone,CRH)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的濃度，收集各組孕豬血樣，3 000 r/min離心10 min后，按照試劑盒說明書操作檢測血漿CRH和5-HT的濃度。

1.4.4 放射免疫法 檢測血漿中的促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotrophic,ACTH)和皮質(zhì)醇(Cortisol,COR)濃度，將血漿樣品解凍，按照試劑盒說明書操作檢測各管沉淀的放射性計數(shù)并采用“相對結(jié)合率—對數(shù)計量的分數(shù)對數(shù)”的數(shù)學模型進行擬合。

1.4.5 熒光定量PCR檢測下丘腦、腎上腺和海馬應激激素受體基因轉(zhuǎn)錄水平 應用 StepOneplus 實時熒光定量PCR儀檢測糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)、黑素腎上腺皮質(zhì)激素2受體(Melanocortin 2 receptor，MC2R)、5-羥色胺受體(5-hydroxyptamine receptor, 5-HTR)和鹽皮質(zhì)激素受體(Mineralocorticoid receptor，MR)基因的轉(zhuǎn)錄水平，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物序列見表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限合成。RNA反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 5 μL(400 ng/μL)、Oligo(dT) 1 μL、GoScriptTM5×Reaction Buffer 4 μL、MgCl23.2 μL、PCR Nucleotide Mix (dNTP) 1.0 μL 和 Nuclease-free H2O 5.3 μL。cDNA擴增反應體系：上游引物0.4 μL、 下游引物0.4 μL、cDNA 2 μL、2×T5 Fast qPCR、Mix(SYBR Green I) 10 μL、Nuclease-free H2O 7.2 μL。PCR反應程序：預變性95 ℃ 10 min， 變性95 ℃ 15 s，退火57 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，穩(wěn)定過程95 ℃ 15 s。

表1 基因引物信息Table 1 Gene primers information

1.4.6 Western Blot檢測下丘腦、腎上腺和海馬應激激素受體表達水平 制備蛋白樣品后進行制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉非特異性抗原、孵育一抗、孵育二抗和熒光顯色，使用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)進行圖像采集，目的蛋白和內(nèi)參蛋白的面積和光密度使用Image J軟件統(tǒng)計。封閉液：5%脫脂奶。一抗：兔抗NR3C1多克隆抗體、兔抗NR3C2多克隆抗體、鼠抗 β-actin 單克隆抗體。二抗：HRP標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗鼠IgG。

1.4.7 組織病理學檢查 取固定好的腎上腺組織，經(jīng)常規(guī)組織脫水、透明、包埋、切片，然后進行蘇木精-伊紅(H.E.)染色，顯微鏡下觀察并記錄病理變化。

1.5 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準誤表示，使用軟件SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用獨立樣本t檢驗法進行差異顯著性檢驗，P≤0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 孕豬制動應激模型的建立 以觀察到母豬陰門發(fā)紅腫脹、陰道濕潤并有濃稠液體流出判定為發(fā)情期，對其進行配種。妊娠成功的母豬陰門收縮成縫且紅腫。將配種成功的妊娠母豬飼養(yǎng)于特制的妊娠籠，模擬集約化生產(chǎn)時的限位欄飼養(yǎng)，建立孕豬制動應激模型。

2.2 孕豬血漿中應激相關激素的水平 試驗組在制動應激處理18 d后，血漿CRH水平較應激前上升221.65%(t=2.71，P=0.046)，較同時間的對照組顯著上升296.36%(t=3.026，P=0.038)(圖1)。放射免疫法結(jié)果顯示，試驗組在第18天時血漿ACTH水平較應激前上升64.97%(t=5.151，P= 0.007)，較同時間的對照組則高出62.98%(t=4.549，P=0.010)(圖1)；而COR水平較應激前上升97.76%(t=5.131,P=0.007)，較同時間的對照組則顯著高出109.86%(t=5.602，P=0.005)(圖1)。制動應激處理后，孕豬血漿中各級應激激素水平均顯著上升，故孕豬制動應激模型成功建立。

圖1 制動應激對孕豬血漿 CRH、ACTH 和 COR 水平的影響Fig.1 Effect of restraint stress on plasma CRH,ACTH and COR level in pregnant sowsA：CRH濃度； B：ACTH濃度； C：COR濃度；D 0:制動應激開始前1天; D 18：制動應激第18天*:試驗組與相同日齡的對照組具有顯著性差異(P≤0.05)A:The concentration of CRH; B:The concentration of ACTH; C:The concentration of COR. D 0：One day before the restraint stress treatment; D 18: 18 th day of the restraint stress treatment. *: The difference was significant between the control group and the experimental group (P≤0.05)

2.3 制動應激對孕豬腎上腺形態(tài)學的影響 經(jīng)過18 d的制動應激，試驗組的腎上腺皮質(zhì)束狀帶細胞索間血竇大量充血，束狀帶細胞胞體腫脹(圖2)，同時腎上腺器官指數(shù)較對照組增加了62.86%(t=2.479，P=0.068)，表明腎上腺的形態(tài)學結(jié)構(gòu)由于制動應激而被破壞。

圖2 制動應激對孕豬腎上腺皮質(zhì)形態(tài)學結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of restraint stress on the morphological structure of adrenal cortex in pregnant sowsA：對照組； B：試驗組。方框中放大區(qū)域：腎上腺束狀帶；比例尺=100 μmA:Control Group; B:Experimental group. Enlarged area in the box: Adrenal fascicular band; Scale bar=100 μm

2.4 制動應激對孕豬海馬、下丘腦、腎上腺的應激激素受體轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的影響 經(jīng)過18 d的制動應激，試驗組下丘腦中的GR轉(zhuǎn)錄較對照組上升113%(t=5.735,P<0.001)，GR蛋白水平上升71%(t=2.400，P=0.032)，腎上腺上的MC2R在轉(zhuǎn)錄水平上顯著上升73%(t=5.325，P=0.05)，表明HPA軸中下丘腦和腎上腺內(nèi)應激受體在應激激素高水平表達下適應性表達上調(diào)。與此同時，試驗組海馬中的GR和MR的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均有顯著下降。海馬中GR的轉(zhuǎn)錄水平下降23%(t=3.260，P= 0.048)，GR蛋白水平下降54%(t=5.735，P<0.001)，MR的轉(zhuǎn)錄水平下降45%(t=2.400，P=0.032)，MR蛋白水平下降45%(t=5.325，P=0.005)，表明海馬中應激受體在應激激素高水平表達下表達下調(diào)，信號轉(zhuǎn)導量變小，表明在持續(xù)高水平的HPA軸功能作用下，海馬的副調(diào)控作用降低(圖3、圖4)。

圖3 制動應激對孕豬下丘腦、腎上腺和海馬中應激激素受體轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.3 Effect of restraint stress on stress hormone receptor transcription level of hypothalamus,adrenal and hippocampus in pregnant sowsA：下丘腦中GR的轉(zhuǎn)錄水平； B：腎上腺中MC2R的轉(zhuǎn)錄水平; C：海馬中MR、GR的轉(zhuǎn)錄水平*：試驗組與對照組具有差異性顯著(P≤0.05)A:GR mRNA level in hypothalamus; B:MC2R mRNA level in adrenal; C:MR and GR mRNA level in hippocampus*: The difference was significant between the control group and the experimental group (P≤0. 05)

圖4 制動應激對孕豬海馬和下丘腦中應激激素受體蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of restraint stress on stress hormone receptor protein level of hippocampus and hypothalamus in pregnant sowsA：海馬中GR的蛋白水平； B：海馬中MR的蛋白水平； C：下丘腦中GR的蛋白水平*:試驗組與對照組具有差異性顯著(P≤0.05)A:GR protein level in hippocampus; B:MR protein level in hippocampus; C: GR protein level in hypothalamus*:The difference was significant between the control group and the experimental group (P≤0.05)

2.5 制動應激對孕豬海馬、下丘腦和腎上腺中5-羥色胺能系統(tǒng)的影響 經(jīng)過18 d的制動應激，試驗組海馬中的5-HT水平顯著下降21%(t=2.144，P=0.04)，而在下丘腦(P=0.892)和腎上腺(P=0.136)中變化并不顯著(圖5)。在5-HT受體表達上，試驗組海馬中的5-HT2A的轉(zhuǎn)錄水平較對照組相比下降27%(t=3.846，P=0.06)，5-HT7的轉(zhuǎn)錄水平下降21%(t=0.597，P<0.001)；下丘腦中5-HT1A、5-HT2A和5-HT7三種5-HT受體的轉(zhuǎn)錄分別下降22%(t=2.239，P=0.03)、26%(t=3.846，P<0.001)和18%(t=3.846，P=0.005)。而在外周的腎上腺中，試驗組和對照組5-HT1A(P=0.081 9)、5-HT2A(P=0.523 5)和5-HT7(P=0.083 8)3種受體的轉(zhuǎn)錄水平均未表現(xiàn)出顯著差異，表明中樞5-羥色胺能神經(jīng)元接收到的5-HT能信號減少可能為HPA軸反應性下降的原因。

圖5 制動應激對孕豬海馬、下丘腦和腎上腺中5-羥色胺能系統(tǒng)的影響Fig.5 Effect of restraint stress on serotonergic system of hippocampus, hypothalamus and adrenal in pregnant sowsA：孕豬海馬、下丘腦和腎上腺中5-HT水平； B：孕豬海馬中5-HT受體轉(zhuǎn)錄水平； C：孕豬下丘腦中5-HT受體轉(zhuǎn)錄水平； D：孕豬腎上腺中5-HT受體轉(zhuǎn)錄水平*:試驗組與對照組具有差異性顯著(P≤0.05)A:5-HT level of hippocampus,hypothalamus and adrenal in pregnant sows; B:5-HT receptor transcription level of hippocampus; C:5-HT receptor transcription level of hypothalamus; D:5-HT receptor transcription level of adrenal *:The difference was significant between the control group and the experimental group (P≤0.05)

3 討論

本試驗以限位欄飼養(yǎng)妊娠母豬建立了18 d慢性制動應激模型，結(jié)果顯示，腎上腺的器官指數(shù)升高，腎上腺皮質(zhì)部束狀帶充血且細胞腫脹，表明長期應激對作為HPA軸的終末器官產(chǎn)生組織學上的損害。海馬中MR和GR表達下降，同時下丘腦中GR表達上升，下丘腦和海馬中的5-羥色胺能信號傳入減少。結(jié)果表明長期應激下，海馬對下丘腦釋放的去抑制信號下調(diào)，下丘腦接收到來自GC的負反饋信號增加，而下丘腦中上調(diào)CRH神經(jīng)元功能的5-羥色胺能信號輸入減少，總體表現(xiàn)出應激時HPA軸反應性的降低和內(nèi)分泌功能的鈍化，使孕豬無法在相同應激原的刺激下產(chǎn)生較對照組同等水平的COR。

許多慢性應激模型中都可觀察到HPA軸反應性的降低和內(nèi)分泌功能的鈍化[7]，但也有一些模型在再次急性應激時表現(xiàn)出HPA軸功能的亢進[8]，這與應激條件、處理時間以及動物的物種和品種有關[9]。此外，本試驗還觀察到海馬組織中5-HT受體水平的顯著下降，推測制動應激可能引起孕豬抑郁癥。應激是機體對外界環(huán)境變化的適應[10]，短期內(nèi)應激反應是有益的，但是長時間處于應激狀態(tài)，則會對機體免疫、內(nèi)分泌等功能產(chǎn)生負面影響[11-12]。應激產(chǎn)生的皮質(zhì)醇通過血腦屏障作用于大腦情緒控制區(qū)域，如背側(cè)海馬[13]，參與情緒、學習和應激反應的調(diào)節(jié)。皮質(zhì)醇與海馬中的核皮固醇受體結(jié)合，通過改變轉(zhuǎn)錄對特定神經(jīng)回路中的細胞代謝和興奮性產(chǎn)生長期的基因組效應，這可能導致特定的神經(jīng)元表型，從而產(chǎn)生特定的行為特征[14]。母豬不能充分適應時，孕豬的居住環(huán)境可被認為是一種應激原[15]。生產(chǎn)中使用限位欄飼養(yǎng)妊娠期母豬，約束其活動范圍，使母豬處于妊娠和制動造成的雙重應激狀態(tài)。仔豬斷奶后，母豬再次回到群體飼養(yǎng)，將因為重新進入社會群體里，重新建立優(yōu)勢等級，再次產(chǎn)生應激[14]。

對于母豬而言，由于其妊娠期平均長達114 d，限位欄導致其長期處于應激狀態(tài)下，HPA軸持續(xù)激活，體內(nèi)皮質(zhì)醇含量長期保持在較高水平時，不僅造成孕豬HPA軸反應性降低和內(nèi)分泌功能鈍化，還將抑制下丘腦釋放促性腺激素釋放激素，或抑制垂體釋放黃體生成素和卵泡刺激素，或通過干擾孕酮和雌激素直接干擾卵巢來破壞生殖過程[16-17]，并且胚胎存活也會受到負面影響[18]。慢性應激不僅會增加胚胎植入前的丟失概率，還分別在懷孕后和分娩時增加木乃伊胎兒和死胎的數(shù)量[19]。對于仔豬而言，母體分泌的糖皮質(zhì)激素一部分穿過胎盤屏障[20]，影響胎兒下丘腦、垂體和腎上腺的發(fā)育，可能導致胎兒下丘腦對皮質(zhì)醇的負反饋效應減少，從而導致HPA系統(tǒng)的亢進。在仔豬的生長過程中，這種狀態(tài)不利于機體對應激原的適應，可能會對生長發(fā)育和生殖產(chǎn)生不利影響，降低動物福利[21]。

綜上，限位欄飼養(yǎng)妊娠母豬的養(yǎng)殖模式雖然給管理方面帶來一定的便利，但是從長遠來看，其造成孕豬HPA軸反應性降低和內(nèi)分泌功能鈍化，在某種程度上反而加大了養(yǎng)殖成本。此外，動物福利低下也是限位欄養(yǎng)殖需要考慮和關注的因素。在薛亞輝等的研究中發(fā)現(xiàn)，群養(yǎng)模式下母豬整體繁殖性能優(yōu)于限位欄飼養(yǎng)模式，母豬的產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)、斷奶仔豬數(shù)、斷奶重等各項繁殖相關參數(shù)均在群養(yǎng)模式下升高[22]。對于妊娠母豬的短期管理和長期利益中，需要找到一個平衡點，從而更好地發(fā)展我國的生豬養(yǎng)殖業(yè)。