施妍 ，周莉英，沈保華，陳航，劉夢曦，2，向平，劉偉

1.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 司法部司法鑒定重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；2.沈陽藥科大學藥學院，遼寧 沈陽 110000

近年來，含合成大麻素類物質(zhì)的“娜塔莎”“小樹枝”等新型毒品不斷出現(xiàn)，在全球范圍內(nèi)引起了廣泛的關(guān)注。合成大麻素通常與不同香料、藥草或電子煙油混合，以不同存在形式逃避濫用藥物管控，通過互聯(lián)網(wǎng)、微信等渠道銷售。由于這類新型毒品與傳統(tǒng)毒品成癮的癥狀不同，表現(xiàn)形式不一樣，因此被不少吸食者誤認為是“娛樂消遣品”或者“俱樂部用品”，是一種無害的消遣用品。筆者所在實驗室近1 年來接收合成大麻素類相關(guān)案件數(shù)百例，其中最常見的為2-[1-（4-氟丁基）-1H-吲唑-3-甲酰氨基]-3，3-二甲基丁酸甲酯（4F-MDMB-BUTINACA）等7種合成大麻素類新精神活性物質(zhì)（new psychoactive substance，NPS）。與此同時，合成大麻素濫用人群擴大，由此類物質(zhì)濫用導致的急性中毒或死亡案件越來越多，對民眾身體健康和公共安全產(chǎn)生了極大的威脅。

合成大麻素類NPS 是NPS 中更新?lián)Q代速度最快的一類化合物[1]。該類化合物是傳統(tǒng)毒品四氫大麻酚（Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC）的類似物，其成癮性強、價格低廉、隱蔽性強而且不易被檢測，常被作為傳統(tǒng)毒品的吸食替代品[2]。合成大麻素類NPS的作用效力比THC 強，其與大麻素受體1（cannabinoid receptor 1，CB1）、CB2結(jié)合的親和力比THC 高80～100 倍[3-6]，濫用合成大麻素會出現(xiàn)頭暈、嘔吐、精神恍惚、致幻等反應(yīng)，過量吸食會出現(xiàn)休克、窒息甚至猝死等情況[7-10]。

對于合成大麻素類NPS 濫用的鑒定和打擊預防是當前司法鑒定領(lǐng)域的重要需求。盡管當前針對合成大麻素類NPS的免疫分析法有所發(fā)展，但由于特異性不足以及合成大麻素的衍生物不斷出現(xiàn)，免疫分析法仍然受到限制[11-12]。已有文獻報道分析尿液[1，13]、血液[3]和唾液[14]中合成大麻素類NPS 主要采用的方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15]、氣相色譜-質(zhì)譜法[16-17]等。毛發(fā)是監(jiān)測藥物濫用的重要檢材，與其他生物檢材相比，毛發(fā)具有易獲得、易保存、分析物穩(wěn)定、能反映較長時間內(nèi)藥物濫用情況等優(yōu)點[18-19]。但目前分析毛發(fā)中合成大麻素類NPS 的樣品前處理方法耗時長[20-22]。因此，本研究旨在建立簡便的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）方法同時定量測定毛發(fā)中4F-MDMB-BUTINACA 等7 種我國常見合成大麻素類NPS，并將其應(yīng)用于實際案例。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

QTRAP 6500+三重四極桿線性離子阱復合質(zhì)譜系統(tǒng)（美國AB Sciex 公司）配備AcquityTMUltra per?formance LC I-CLASS超高效液相色譜儀（美國Waters公司），SB-2200-T超聲波清洗儀（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司），JXFSTPRP-CLN 冷凍研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司），XW-80A 旋渦混合器（上海醫(yī)科大學儀器廠），MiniSpin 微量離心機（德國Eppendorf公司），BSA124S電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］。0.22 μm 濾膜購自國藥集團化學試劑有限公司。

2-[1-（5-氟戊基）-1H-吲哚-3-甲酰氨基]-3，3-二甲基丁酸甲酯（5F-MDMB-PICA）、4F-MDMBBUTINACA、1-（5-氟戊基）-N-（2-苯基丙-2-基）-1H-吲唑-3-甲酰胺（5F-CUMYL-PINACA，SGT-25）、3，3-二甲基-2-[1-（4-戊烯-1-基）-1H-吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯（MDMB-4en-PINACA，MDMBPENINACA）、3，3-二甲基-2-[1-（5-氟戊基）吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯（5F-ADB，5F-MDMB-PINACA）、3，3-二甲基-2-[1-（4-氟丁基）吲哚-3-甲酰氨基]丁酸甲酯（4F-MDMB-BICA，4-fluoro-MDMB-BUTICA）、1-（4-氰基丁基）-N-（2-苯基丙-2-基）-1H-吲唑-3-甲酰胺（4CN-CUMYL-BUTINACA，SGT-78，CUMYL-4CN-BINACA，4CN-CUMYL-BINACA，CUMYL-CBPINACA，CUMYL-CYBINACA）對照品購自美國Cayman公司，內(nèi)標N-（1-金剛烷基）-1-戊基吲唑-3-甲酰胺-d9（APINACA-d9，AKB48-d9）對照品購自美國Globio公司，甲醇（色譜純）和乙腈（色譜純）購自美國Sigma-Aldrich 公司，98%甲酸溶液和98%乙酸銨溶液購自瑞士Fluka 公司，超純水由Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備。

1.2 標準溶液配制

取7 種合成大麻素類NPS 及內(nèi)標對照品適量，加入甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的標準物質(zhì)儲備液，置于冰箱中冷凍保存。再用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的含7 種合成大麻素類NPS 的混合溶液，隨后用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為200、100、50、25、10 和5 ng/mL的混合工作溶液。將1 mg/mL的內(nèi)標儲備液用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為0.4 ng/mL 的內(nèi)標工作溶液。所有工作溶液在使用前均置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 毛發(fā)樣品及樣品前處理

空白毛發(fā)樣品采集自10 名無吸毒史的健康志愿者（男女性各5 名，平均年齡32.5 歲），用于制備校正曲線和質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品。實際案例的毛發(fā)樣品取自疑似合成大麻素類物質(zhì)使用者。

將毛發(fā)樣品依次用去離子水和丙酮各清洗2 次，室溫下干燥，然后用剪刀將毛發(fā)樣品剪成1～2 mm段。稱取毛發(fā)20 mg 放入2 mL 研磨管中，加入含0.4 ng/mL APINACA-d9的內(nèi)標工作溶液1 mL，在4 ℃下研磨毛發(fā)樣品。研磨參數(shù)設(shè)置：速度6 m/s，研磨時間20 s，平衡時間40 s，循環(huán)10次。研磨后的樣品超聲10 min后以14 104×g離心5 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，濾液直接供儀器分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm；美國Waters 公司）。流動相A 為20 mmol/L 乙酸銨、0.1%甲酸和5%乙腈的水溶液，流動相B 為乙腈。采用線性梯度洗脫程序：0～1 min，50% B；1～6 min，線性增加到90% B；6～9 min，保持90% B；9～9.1 min，回到初始50% B；9.1～10 min，保持50% B。流速0.3 mL/min，總運行時間10 min，進樣體積5 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

公司擁有多臺無人機和相關(guān)拍攝制作設(shè)備，項目滾動式發(fā)展，公司資金可以滿足目前發(fā)展的要求，不會使項目在實施到中途因為資金問題導致違約。

采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）正離子模式，在多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction moni?toring，MRM）模式下采集數(shù)據(jù)。ESI 參數(shù)設(shè)置如下：離子源溫度500 ℃；氣簾氣（N2）18 psi；離子噴射電壓5 000 V，碰撞室出口電壓10 V、入口電壓10 V；離子源氣體1（GS1）40 psi，離子源氣體2（GS2）35 psi。MRM參數(shù)和保留時間如表1所示。

表1 合成大麻素類NPS和內(nèi)標的MRM參數(shù)和保留時間Tab.1 MRM parameters and retention times for synthetic cannabinoids NPS and internal standard substance

1.5 方法學驗證

1.5.1 選擇性

取10份不同來源的空白毛發(fā)樣品，分別按照1.3節(jié)進行樣品前處理，考察毛發(fā)樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)及內(nèi)標是否干擾分析物的測定。

1.5.2 線性、檢出限和定量限

稱取20 mg 空白毛發(fā)樣品，加入合成大麻素及其代謝物的混合標準溶液，配制成質(zhì)量分數(shù)為1、2、5、10、20、50、100 和200 pg/mg 的加標毛發(fā)樣品，按照1.3節(jié)樣品前處理方法制備樣品。以每個分析物的質(zhì)量分數(shù)為橫坐標（x），以定量離子對與內(nèi)標的峰面積比為縱坐標（y），以加權(quán)最小二乘法（W=1/x）進行回歸運算，得到線性方程。以信噪比（S/N）≥3 為檢出限（limit of detection，LOD），以S/N≥10 為定量限（limit of quantitation，LOQ）。

1.5.3 精密度和準確度

稱取20 mg 空白毛發(fā)樣品，加入合成大麻素及其代謝物的混合標準溶液，配制成包括LOQ 在內(nèi)的4個質(zhì)量分數(shù)的QC 樣品，每個濃度點制備6 個平行樣品，按照1.3 節(jié)方法進行樣品前處理，連續(xù)測定4 d。精密度用相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）來評估。經(jīng)線性方程計算的測定值與實際添加標準樣品的質(zhì)量分數(shù)的百分比為準確度。要求QC樣品的精密度（RSD）不超過15%，LOQ 樣品的精密度（RSD）不超過20%[23]；QC 樣品的準確度在85%～115%，LOQ樣品的準確度在80%～120%。

根據(jù)MATUSZEWSKI 等[23]提出的方法考察基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率?；|(zhì)效應(yīng)主要表現(xiàn)為離子抑制或增強作用。選取包括LOQ 在內(nèi)的4 個質(zhì)量分數(shù)的QC 樣品，測得按照1.3 節(jié)方法處理后進樣的峰面積（A），空白樣品按照1.3節(jié)方法處理后加入相應(yīng)質(zhì)量分數(shù)的混合標準溶液進樣的峰面積（B）和標準溶液的峰面積（C），用B/C計算基質(zhì)效應(yīng)，用A/B計算提取回收率。

1.5.5 穩(wěn)定性

稱取20 mg 空白毛發(fā)樣品，加入合成大麻素的混合標準溶液，配制成包括LOQ 在內(nèi)的4個質(zhì)量分數(shù)的QC樣品，每個濃度點制備6個平行樣品，按照1.3節(jié)方法進行樣品前處理，將提取液儲存在4 ℃的自動進樣器中24、48、72 h，考察常見合成大麻素類NPS 在人類毛發(fā)中的穩(wěn)定性，偏倚在±15%以內(nèi)，可認為樣品穩(wěn)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學驗證

2.1.1 選擇性

10 份不同來源的空白毛發(fā)樣品經(jīng)樣品前處理后，在待測分析物對應(yīng)的保留時間處均無內(nèi)源性干擾以及內(nèi)標的干擾，說明該方法的選擇性良好。

2.1.2 線性、LOD和LOQ

各分析物的線性范圍、LOD 和LOQ 見表2。結(jié)果表明，各分析物在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99，LOD 在0.5～2 pg/mg，LOQ 在1～5 pg/mg（色譜圖見圖1），可以滿足鑒定實踐的需求。

表2 毛發(fā)中7種合成大麻素的線性、LOD和LOQTab.2 The linearity，LOD and LOQ of 7 synthetic cannabinoids in human hair

圖1 7種合成大麻素的提取離子色譜圖（LOQ）Fig.1 Extracted ion chromatograms of 7 synthetic cannabinoids（LOQ）

2.1.3 精密度和準確度

各分析物的精密度和準確度見表3。該方法的日內(nèi)精密度為0.1%～10.9%，日內(nèi)準確度為89.2%～110.7%，日間精密度為2.5%～12.6%，日間準確度為94.5%～105.7%。精密度均在15%以內(nèi)，準確度均在85%～115%，表明該方法的精密度和準確度良好。

2.1.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

本方法的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)見表3。各分析物的提取回收率為52.3%～93.3%，均大于50%?；|(zhì)效應(yīng)為19.1%～95.2%，其中5F-MDMB-PICA、4FMDMB-BICA 在毛發(fā)基質(zhì)中產(chǎn)生離子抑制，其基質(zhì)效應(yīng)范圍為19.1%～49.9%，其他目標物受基質(zhì)效應(yīng)影響較小。

表3 毛發(fā)中7種合成大麻素的精密度、準確度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)Tab.3 The precision，accuracy，recovery rate and matrix effect of 7 synthetic cannabinoids in human hair（%）

根據(jù)相關(guān)文獻[24]報道，在毛發(fā)基質(zhì)中合成大麻素類NPS存在離子抑制現(xiàn)象，分析物的基質(zhì)效應(yīng)受濃度影響較大，濃度越低越易受離子抑制影響。筆者也推測分析物在離子化過程中產(chǎn)生競爭關(guān)系，受分析物理化性質(zhì)的影響，5F-MDMB-PICA、4F-MDMB-BICA的極性相對較小，其他分析物的極性相對較大。5FMDMB-PICA、4F-MDMB-BICA 離子化效率降低，導致離子抑制。

2.1.5 穩(wěn)定性

毛發(fā)樣品經(jīng)提取后在4 ℃條件下保存24、48 和72 h 的偏倚分別為91.6%～111.8%、94.1%～112.7%和91.1%～113.3%（表4），表明各分析物在提取液中穩(wěn)定性良好。

表4 毛發(fā)中7種合成大麻素的穩(wěn)定性（偏倚）Tab.4 The stability of 7 synthetic cannabinoids in human hair（bias） （n=6，%）

續(xù)表4Continued Tab.4

2.2 案例應(yīng)用

某年8 月初，王某（女，20 歲）在與幾個朋友聚會后，從高層公寓樓的樓頂一躍而下。據(jù)了解，王某跳樓之前曾與一群同齡的男生一起抽電子煙。據(jù)那群男生回憶，抽了電子煙感到“很嗨”后，王某等幾個人就跑到樓頂，之后她就毫無預兆地跳樓了。為了尋找王某跳樓的真相，警方委托本單位進行鑒定。運用本研究所創(chuàng)建的方法在王某距根部3 cm 的頭發(fā)中檢出合成大麻素4F-MDMB-BUTINACA 成分，質(zhì)量分數(shù)為53.9 pg/mg（圖2）。

圖2 實際案例頭發(fā)中4F-MDMB-BUTⅠNACA的色譜圖Fig.2 Chromatograms of 4F-MDMB-BUTⅠNACA in human hair of an actual case

2.3 小結(jié)

本研究毛發(fā)中合成大麻素的LOD 與已有文獻報道相近，均達到pg 級水平[20-22]。在實際案例中分析了1 名疑似吸毒者的距根部3 cm 的頭發(fā)，按照頭發(fā)1 個月長0.7～1.4 cm 的生長速度[18]，本案例毛發(fā)中檢出的4F-MDMB-BUTINACA 成分可反映過去3 個月的服藥情況，表明其近3 個月吸食了含合成大麻素成分的電子煙。含合成大麻素類物質(zhì)的電子煙社會危害性極大，吸食后會出現(xiàn)幻視、幻聽等嚴重精神癥狀，過量吸食會出現(xiàn)休克、窒息甚至猝死等情況，對身心造成不可逆的傷害。在實際檢案工作中遇到類似的情況應(yīng)關(guān)注合成大麻素的鑒定。

2021 年7 月1 日起，國家禁毒委員會辦公室將合成大麻素類物質(zhì)列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄》進行整類列管，這是繼整類列管芬太尼類物質(zhì)后的又一次監(jiān)管創(chuàng)新實踐，對遏制合成大麻素類物質(zhì)等新型毒品犯罪具有重要意義。為適應(yīng)禁毒新形勢，本研究建立了UPLC-MS/MS方法用于同時測定毛發(fā)中7 種常見合成大麻素類NPS。該方法靈敏度高、選擇性好，樣品前處理方法簡單，適用于實際毛發(fā)樣品的定性定量分析。