楊 瑩，許雯銥,2，李聰慧,2，楊俊林,2

(1. 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121； 2. 浙江省器官發(fā)育與再生技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311121)

少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte，OL)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中包裹軸突形成髓鞘的大膠質(zhì)細(xì)胞，它們負(fù)責(zé)產(chǎn)生髓鞘，并且在保持軸突完整性以及電脈沖沿軸突快速有效傳導(dǎo)等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用.少突膠質(zhì)細(xì)胞由少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)分化成熟而來(lái)[1].OPCs是一種潛在的干細(xì)胞，能分化成為少突膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的形成[2].同時(shí)，OPCs是脫髓鞘病變中髓鞘再生的主要種子細(xì)胞[3]，因此，它們除了被廣泛用于脫髓鞘疾病致病機(jī)理的研究之外，在移植治療脫髓鞘疾病方面也具有廣闊的應(yīng)用前景[4].此外，OPCs在發(fā)育過(guò)程中參與維持血腦屏障的完整性，其移植可以減少血腦屏障的滲漏，是治療缺血性腦卒中的新途徑[5].OPCs移植到受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中還可以治療脊髓損傷[6].目前，小鼠OPCs主要通過(guò)培養(yǎng)小鼠大腦皮層組織獲得[7]，但是所獲OPCs的數(shù)量和質(zhì)量依賴(lài)于培養(yǎng)時(shí)所使用的胎牛血清，即使同一品牌的血清也存在批次間的差異，常常使得OPC的制備充滿(mǎn)不確定性[4]，導(dǎo)致小鼠OPC的制備充滿(mǎn)挑戰(zhàn)性[8].鑒于星形膠質(zhì)細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中能夠分泌一些生長(zhǎng)因子來(lái)促進(jìn)OPCs的存活和增殖[7]，如PDGFaa、bFGF、EGF等，本研究擬利用這一特點(diǎn)，探索建立一種比較穩(wěn)定的OPC制備體系，以滿(mǎn)足對(duì)OPCs日益增長(zhǎng)的需要.

1 材料和方法

1.1 材料

ICR新生小鼠(P0)；D/F20S培養(yǎng)基(79% DMEM/F-12培養(yǎng)基；20%胎牛血清；1% Penicillin-Streptomycin(雙抗))；星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(ACM)、抗體、24孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶等.

1.2 小鼠大腦皮層組織原代培養(yǎng)

解剖、獲得ICR小鼠大腦皮層組織的方法參考已有的文獻(xiàn)報(bào)道[9]，所有實(shí)驗(yàn)程序都按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用的準(zhǔn)則進(jìn)行，該準(zhǔn)則得到了杭州師范大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn).簡(jiǎn)要概括如下：首先對(duì)ICR新生小鼠噴灑70%乙醇后于4 ℃冰箱中低溫麻醉，然后取出小鼠再次噴乙醇消毒.用剪刀剪下小鼠腦袋，置于盛有1×PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，洗去多余的血液，然后于一新的盛有1×PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中解剖出小鼠大腦皮層，用鑷子將皮層組織上的腦膜輕輕撕除.將大腦皮層轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)皿中，用鑷子將大腦皮層夾碎成約1 mm3大小的組織塊，加入適量的D/F20S培養(yǎng)基后接種于包被有PDL的T75培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，前兩天不移動(dòng)培養(yǎng)瓶，保證組織能夠更好地貼壁.2 d后，首次更換新鮮培養(yǎng)液，之后隔天換液，直到細(xì)胞長(zhǎng)至匯合.

1.3 ACM的制備

等上述小鼠大腦皮層組織原代培養(yǎng)的細(xì)胞長(zhǎng)至匯合，將培養(yǎng)瓶置于恒溫?fù)u床上以200 r/min的轉(zhuǎn)速搖培2 h，去除小膠質(zhì)細(xì)胞，去上清后換上新鮮培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中額外培養(yǎng)2 h以上，以平衡培養(yǎng)體系的pH值.然后再次置于搖床上以250 r/min的轉(zhuǎn)速搖過(guò)夜(12～15 h)，通過(guò)去掉培養(yǎng)上清的方式去除OPCs，從而達(dá)到純化小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的目的[10].接著向培養(yǎng)瓶中加入普通培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞4 d[4]，使星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌足夠多的生長(zhǎng)因子到培養(yǎng)液中，收獲培養(yǎng)上清之后經(jīng)孔徑為0.22 μm的過(guò)濾器過(guò)濾即得到ACM.

1.4 小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備

按照1.3中所描述的方法去除新生小鼠大腦皮層組織原代培養(yǎng)物中的小膠質(zhì)細(xì)胞和OPCs，然后用0.05%的胰蛋白酶將培養(yǎng)瓶中的星形膠質(zhì)細(xì)胞消化下來(lái)，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色及細(xì)胞計(jì)數(shù)之后，按照6×104個(gè)/cm2的密度接種活細(xì)胞到細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)[11]，過(guò)夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁.第2天更換培養(yǎng)基，除去未貼壁的細(xì)胞，然后加入20 μg/mL的絲裂霉素處理星形膠質(zhì)細(xì)胞2 h，使其停止細(xì)胞分裂[4,12]，即獲得純化處理的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層.

1.5 小鼠大腦皮層組織消化成單細(xì)胞

經(jīng)解剖獲得小鼠大腦皮層，于培養(yǎng)皿中將其剪碎成約1 mm3大小的組織塊，加入0.05%胰蛋白酶于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育15 min，期間每隔5 min用1 mL移液槍的槍頭吹打液體.15 min后加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化[7]，之后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，丟棄上清液，加10 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min.重復(fù)此操作2～3次后，加入適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液用孔徑為70 μm的濾網(wǎng)過(guò)濾，除去組織碎塊，得到單細(xì)胞懸液.

1.6 免疫熒光染色

吸出培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)基，在孔內(nèi)加入4% PFA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，用以保護(hù)細(xì)胞形態(tài)，避免細(xì)胞變質(zhì)[13].30 min后吸出PFA，用1×PBS洗3遍，每遍10 min.然后加入封閉液(含10%山羊血清和0.1% Triton的PBS)后靜置1 h，封閉非特異性表位.隨后吸出封閉液，加入一抗，在通透性試劑存在條件下，保證一抗接近細(xì)胞核內(nèi)的表位[14]，4 ℃過(guò)夜以保證抗體與目標(biāo)表位充分結(jié)合.第2天，用1×PBS洗3遍.然后加入針對(duì)一抗宿主物種并且有熒光標(biāo)記的二抗和DAPI[15]，室溫避光孵育1 h.去掉二抗之后加入1×PBS洗3遍，每遍10 min.從每個(gè)條件所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)孔內(nèi)隨機(jī)選取3個(gè)視野，用熒光顯微鏡拍照，然后對(duì)DAPI、SOX10陽(yáng)性(SOX10+)信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出SOX10+細(xì)胞數(shù)目與DAPI數(shù)目的比值.所使用到的抗體包括：小鼠抗GFAP 抗體(anti-GFAP，1∶1 000)，用于標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞；豚鼠抗SOX10抗體(anti-SOX10，1∶400)，用于標(biāo)記OPCs.

2 研究結(jié)果

2.1 ACM促進(jìn)小鼠大腦皮層單細(xì)胞培養(yǎng)獲得OPCs

為了驗(yàn)證ACM對(duì)通過(guò)小鼠大腦皮層單細(xì)胞培養(yǎng)制備OPCs的方式是否有促進(jìn)作用，設(shè)置了兩種實(shí)驗(yàn)條件：在包被有PDL的24孔板中，分別用D/F20S培養(yǎng)基(對(duì)照組)和ACM(實(shí)驗(yàn)組)培養(yǎng)小鼠大腦皮層單細(xì)胞，再比較這兩種條件下OPCs形成過(guò)程及數(shù)目的差異.在培養(yǎng)至第6天時(shí)，在顯微鏡下可觀察到明顯差異，ACM組中OPC樣的細(xì)胞明顯多于對(duì)照組.繼續(xù)培養(yǎng)至第8天，固定細(xì)胞做細(xì)胞免疫熒光染色，染色結(jié)果顯示ACM組SOX10+OPCs數(shù)目明顯多于對(duì)照組(圖1A)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明ACM組SOX10+OPCs占到細(xì)胞總數(shù)的13.90%，而對(duì)照組SOX10+OPCs僅占細(xì)胞總數(shù)的5.03%，且二者之間存在顯著性差異(圖1B).另外還觀察到ACM組的孔內(nèi)OPCs分布均勻，培養(yǎng)孔的每個(gè)區(qū)域都有OPCs的存在，而對(duì)照組OPCs則呈集群狀分布，只有少部分區(qū)域有OPCs的存在.

A：D/F20S組和ACM組代表性圖片；B：D/F20S組和ACM組SOX10+細(xì)胞占比的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(*表示P<0.05，以下同).

2.2 ACM促進(jìn)小鼠皮層組織塊制備OPCs

將小鼠大腦皮層切碎成1 mm3大小的組織碎塊，接種于包被有PDL的24孔板中，分別用D/F20S培養(yǎng)基(對(duì)照組)和ACM(實(shí)驗(yàn)組)進(jìn)行培養(yǎng).培養(yǎng)至第6天時(shí)，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)ACM組OPC樣的細(xì)胞明顯多于對(duì)照組.培養(yǎng)至第8天時(shí)的免疫熒光染色結(jié)果顯示，ACM組SOX10+OPCs數(shù)目明顯多于對(duì)照組(圖2A)，其OPCs占細(xì)胞總數(shù)的26.17%，而對(duì)照組OPCs僅占細(xì)胞總數(shù)的7.17%(圖2B)，差異顯著(P<0.05).這些結(jié)果說(shuō)明，ACM在用小鼠大腦皮層組織塊培養(yǎng)制備OPCs的方法中也同樣具有促進(jìn)作用.

A：D/F20S組和ACM組代表性圖片；B：D/F20S組和ACM組SOX10+細(xì)胞占比的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

2.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層促進(jìn)單細(xì)胞培養(yǎng)法制備OPCs

將小鼠大腦皮層組織塊消化成單細(xì)胞后接種于星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層之上，用D/F20S培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)作為對(duì)照.培養(yǎng)至第8天，免疫熒光染色結(jié)果顯示飼養(yǎng)層組SOX10+OPCs占細(xì)胞總數(shù)的10.30%，而對(duì)照組孔內(nèi)的OPCs僅占細(xì)胞總數(shù)的5.03%，單因素方差分析結(jié)果表明兩組差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層對(duì)OPCs的形成具有促進(jìn)作用(圖3).然而相較于上述ACM培養(yǎng)小鼠大腦皮層單細(xì)胞所獲的OPC產(chǎn)率(約13.90%)，星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層支持OPCs產(chǎn)生的作用不如ACM.

A：有或無(wú)星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)小鼠大腦皮層單細(xì)胞獲得OPCs的代表性圖片；B：兩組SOX10+細(xì)胞占比的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

2.4 ACM與星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層協(xié)同促進(jìn)OPC的制備

以小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層協(xié)同ACM或D/F20S培養(yǎng)基對(duì)小鼠大腦皮層單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第8天，經(jīng)細(xì)胞免疫熒光染色后拍照，對(duì)2個(gè)組SOX10+細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù).統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，ACM與飼養(yǎng)層組的SOX10+OPCs占細(xì)胞總數(shù)的16.87%，高于星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層下以D/F20S為培養(yǎng)基的培養(yǎng)組(10.30%)，二者之間存在顯著性差異(圖4).這一結(jié)果說(shuō)明當(dāng)ACM和星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層共同應(yīng)用時(shí)，對(duì)OPCs產(chǎn)生的促進(jìn)作用大于只應(yīng)用星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層的情況.

A：D/F20S培養(yǎng)基與ACM培養(yǎng)大腦皮層單細(xì)胞獲得OPCs的代表性圖片；B：兩組SOX10+細(xì)胞占比的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞是一種獨(dú)特的細(xì)胞類(lèi)型，對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系中的其他細(xì)胞類(lèi)型具有關(guān)鍵作用，可以直接影響少突膠質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞的存活和產(chǎn)生[16].星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子支持OPCs的生長(zhǎng)[4]，因此，用小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞制備ACM，能使星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的各種生長(zhǎng)因子擴(kuò)散于ACM中，當(dāng)用ACM來(lái)培養(yǎng)小鼠大腦皮層細(xì)胞時(shí)，有利于從這些單細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生OPCs，這跟理論預(yù)期相符合.有研究顯示，小鼠的OPCs對(duì)消化酶比較敏感，導(dǎo)致很多OPCs在組織消化過(guò)程中遭受酶的消化損傷而死亡[7].本研究發(fā)現(xiàn)ACM有利于小鼠大腦皮層單細(xì)胞培養(yǎng)獲得OPCs，據(jù)此推測(cè)ACM可能提高了某些受酶損傷OPCs的存活率，從而有利于獲得更多SOX10+OPCs.大腦皮層組織塊未經(jīng)酶的消化損傷，因而有利于OPCs的存活及生長(zhǎng)[7].但是本研究發(fā)現(xiàn)ACM也有利于皮層組織塊培養(yǎng)獲得OPCs，可見(jiàn)ACM促進(jìn)OPCs的制備不僅僅局限于提高細(xì)胞的存活率，可能還通過(guò)促進(jìn)OPCs分裂，甚至通過(guò)促進(jìn)其他祖細(xì)胞向OPCs分化而獲得更多的SOX10+細(xì)胞.

星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)OPCs的支持作用有兩種途徑，其中之一是星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子，擴(kuò)散于培養(yǎng)基中，即制備ACM的原理；其二是星形膠質(zhì)細(xì)胞能通過(guò)細(xì)胞之間的直接接觸而傳遞某些有用的信號(hào)，從而支持OPCs的產(chǎn)生與分裂[4].因此，本研究設(shè)置了將小鼠大腦皮層單細(xì)胞接種于小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層之上的實(shí)驗(yàn)條件，與對(duì)照組相比，飼養(yǎng)層組獲得了更多的SOX10+細(xì)胞，印證了星形膠質(zhì)細(xì)胞支持OPCs生長(zhǎng)的第二條途徑.但是，星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層對(duì)OPCs產(chǎn)生的促進(jìn)作用不如ACM，推測(cè)出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)與OPCs之間的相互接觸進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的促進(jìn)作用不如其分泌的生長(zhǎng)因子強(qiáng).鑒于ACM和小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層對(duì)OPCs的產(chǎn)生均有促進(jìn)作用，且本研究證明兩種促進(jìn)因素共同存在時(shí)，OPCs的產(chǎn)量多于只有一種促進(jìn)因素時(shí)的情況，因此，在制備OPCs時(shí)可以考慮將這兩個(gè)有效因素合并使用.

4 總結(jié)

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ACM能顯著提高小鼠原代OPCs的制備效率，與星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層相搭配甚至可以進(jìn)一步提高OPCs的產(chǎn)量.這一方法有望獲得足夠數(shù)目的OPCs用于少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育或者脫髓鞘治病機(jī)理的研究.