李婷婷，程江華，張煥煥，錢 坤，蘇世廣，徐雅芫

（1. 安徽農業(yè)大學 生命科學學院，安徽 合肥 230061；2. 安徽農業(yè)科學院 農產品加工研究所，安徽 合肥 230031；3. 安徽農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031）

0 引言

發(fā)酵大豆食品是古人智慧結晶的代表，將大豆靜置于敞開環(huán)境中自然發(fā)酵，在這一過程中大豆完成了從原料到發(fā)酵成品的轉化，形成了各具特色的調味品，如腐乳、豆醬、醬油及豆豉等，不僅改善了風味，而且營養(yǎng)更易被吸收[1]。傳統發(fā)酵手工藝得到了廣泛的傳播和良好的傳承，目前民間手工作坊仍以傳統發(fā)酵為主。因受到地域和環(huán)境的影響，導致產品中關鍵微生物也不完全一致，形成了各具特色的風味。這也為發(fā)酵豆制品的現代化企業(yè)打造了地域品牌，增加了產品特色。因此，發(fā)酵豆制品中關鍵微生物的挖掘和工藝的優(yōu)化成為了研究的重點。

近年來，發(fā)酵豆制品年銷售量年增長率超過12%[2]，說明市場對發(fā)酵豆制品的需求在逐年增加，傳統發(fā)酵豆制品受到群眾廣泛的喜愛，隨著現代化技術的進步，大豆發(fā)酵過程中微生物資源的研究取得了很大的進展，關鍵微生物的現代化應用也取得了一定的成果。目前，發(fā)酵豆制品中關鍵微生物主要包括以霉菌和酵母菌為典型代表的真菌類，以枯草芽孢桿菌和乳酸菌為典型代表的細菌類[3-4]，對主要發(fā)酵豆制品中菌種資源的挖掘和發(fā)酵工藝的改良展開論述，探討了發(fā)酵豆制品中微生物最新研究現狀，包括對發(fā)酵菌種選育和混菌發(fā)酵組合進行歸納，為發(fā)酵豆制品的產業(yè)化水平提升提供了改進方向。

1 腐乳

1.1 腐乳生產中的關鍵菌種

腐乳是一種具有抗氧化生理活性功能的發(fā)酵食品。研究發(fā)現，微生物的種類和數量是決定腐乳風味及品質主要因素[5-7]。研究人員通過傳統分離篩選方法與先進的分子生物技術領域變性梯度凝膠電泳（DGGE）、高通量測序（HTS） 等技術相結合，發(fā)現腐乳發(fā)酵過程始終伴隨著微生物種類和數量的變化，在發(fā)酵各階段有著不同關鍵微生物。學者通過分離、篩選及鑒定等手段對腐乳菌群結構進行研究，發(fā)現霉菌、酵母菌和乳酸菌等是腐乳發(fā)酵環(huán)節(jié)的關鍵菌種[8-10]。

1.1.1 霉菌

霉菌是傳統腐乳最重要的優(yōu)勢菌種，其種類和豐度不僅受地域影響，還受到輔料添加、生產過程控制等因素的干預。Gu J 等人[11]選擇5 個地區(qū)的青腐乳作為樣品進行菌種的分離篩選，共得到微生物116 株，經過分子生物學鑒定確定為26 個種，結果表明霉菌是各地腐乳中主要的優(yōu)勢菌群，種類和豐度具有優(yōu)勢。研究發(fā)現，同一地區(qū)的2 種自然發(fā)酵的腐乳，輔料的不同影響著腐乳中微生物的菌群結構差異，曲霉是夾江香辣腐乳和白菜腐乳的優(yōu)勢菌群，但在夾香辣腐乳中含量更具優(yōu)勢[12]。有研究人員通過對后酵120 d 輻照3 h 并于25 ℃下貯藏60 d 的腐乳與未輻照處理的腐乳進行比較，發(fā)現前者霉菌總數減少了25%～33%，結果表明在發(fā)酵結束后一定程度的輻照處理可以減少關鍵微生物的數量，保證品質最佳。近些年研究者紛紛對各地腐乳的優(yōu)勢菌種資源進行挖掘，袁華偉等人[13]從宜賓腐乳中分離篩選得到生產效果良好的優(yōu)勢毛霉SH12 菌株，通過單因素試驗對其生長特性和產酶性能進行研究，將毛霉接種于豆腐坯上，在pH 值7.5，溫度為26 ℃最佳條件下培養(yǎng)48 h 時，中性蛋白酶活力達到最大。程昌澤等人[14]在貴州地區(qū)的腐乳中篩選出20 株菌株，經過復篩最終得到一株產蛋白酶活性較高的優(yōu)勢雅致放射毛霉MGC317 菌株，在自然pH 值、常溫下接種于豆腐坯中培養(yǎng)48 h 時，產蛋白酶活力最高可達到13.82 μL，在腐乳前酵時期菌絲最長可達3.1 cm，發(fā)酵性能表現最好。

1.1.2 酵母菌

酵母菌是傳統發(fā)酵腐乳中優(yōu)勢菌種之一，尤其是對腐乳的后酵風味的形成起著至關重要的決定作用[15]，產生的風味物質主要包括2 - 苯乙醇、乙酸、乙酯類、脂肪酸和其他揮發(fā)性風味物質。發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、奧默柯達酵母（Kodamaea ohmeri） 和魯氏酵母（Saccharomyces rouxii） 為潛在風味關聯菌株。其中，與發(fā)酵畢赤酵母呈顯著正相關的風味物質數量最多，為25 種。據報道，發(fā)酵畢赤酵母可生成2 - 苯乙醇，已廣泛應用于發(fā)酵食品的改善中。此外，當發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母共同發(fā)酵時，發(fā)酵畢赤酵母可明顯提高乙酸、乙酯類、脂肪酸和其他揮發(fā)性風味物質含量。研究者為了提高風味活性物質含量，對酵母菌的最佳添加量進行了研究，從自然發(fā)酵的腐乳坯上分離得到一株形狀優(yōu)良的酵母菌，通過正交試驗和均勻試驗得出酵母菌添加量為0.27%時腐乳發(fā)酵劑中風味物質活性最高[16]。

1.1.3 細菌

細菌通過產生乳酸等滋味物質改善腐乳品質，其中腐乳優(yōu)勢細菌主要包括乳酸菌、芽孢桿菌和藤黃微球菌等。許家威等人[17]對腐乳前期微生物進行動態(tài)分析，結果表明，腐乳生產的3 個階段（白坯階段、腌坯階段、后酵階段） 中腌坯時期的微生物數量呈現先增長后下降的趨勢，但總量仍比白坯時期高一個水平，其中乳酸菌數量在腌坯時期達到最高值9.11(lg(CFU/g))，此時總酸含量也呈現峰值，乳酸菌對生產中期腐乳品質的形成具有重要意義。不同品種的腐乳種乳酸菌優(yōu)越性存在差異，Han B Z 等人[9]對23 個腐乳市售樣品中微生物種類及數量進行了研究得出樣品中的乳酸菌占需氧菌總數的80%，數量級可達到106～107CFU/g，其中白腐乳中乳酸菌數量明顯高于青腐乳和紅腐乳。腌坯時期的優(yōu)勢細菌根據腐乳產地表現出多樣性，Feng Y 等人[18]采用聚合酶鏈反應- 變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）的方法對克東腐乳的菌落結構分析發(fā)現，腌坯時期藤黃微球菌、鳥腸球菌、糞腸球菌、肉葡萄球菌為優(yōu)勢菌群。

1.2 腐乳發(fā)酵菌種改良及工藝優(yōu)化

隨著技術的進步，研究者對關鍵菌種進行深入研究，發(fā)酵中菌種采用單菌或混菌組合的添加方式，在生產中高新技術的應用也為發(fā)酵工藝提供一臂之力。挖掘優(yōu)勢菌種的最大潛力并應用于工業(yè)生產中，以提高發(fā)酵效率、改善產品品質及縮短生產周期。

1.2.1 菌種定向選育

劉芳等人[19]對腐乳中產蛋白酶的毛霉進行紫外誘變得到酶活高、耐熱性好的誘變菌株SCLG——毛霉16，經單因素試驗結果表明，該菌株在32 ℃下能正常生長，蛋白酶活力較出發(fā)菌株高出51.4%，釀制的腐乳時間縮短，經感官評定，腐乳品質明顯提高。研究人員對克東腐乳后酵時期高產蛋白酶的藤黃微球菌進行紫外誘變處理得到突變菌株T4，其產蛋白酶活力是出發(fā)菌株的1.54 倍。通過單因素試驗和正交試驗確定了突變菌株的最佳發(fā)酵條件為接種量6%，pH 值7.5，35 ℃下靜置培養(yǎng)36 h，在此工藝下縮短克東腐乳發(fā)酵周期，減低生產投入成本[20]。

1.2.2 混菌改良發(fā)酵

研究人員通過不同方法摸索混菌發(fā)酵最佳組合及組合比例，以達到優(yōu)化產品的目的。張斌等人[21]采用正交試驗對浙江地區(qū)腐乳中優(yōu)勢菌種進行分離純化，篩選出2 株霉菌分別為2 #魯氏毛霉和1 #米根霉，并按7∶3 比例混合，在28 ℃下發(fā)酵72 h，可有效改善腐乳品質。羅曉妙等人[16]通過均勻試驗和正交試驗探索腐乳接菌量，結果表明在含水量為51%的麩皮、米粉和豆粉的混合物中接入2.45%霉菌、0.27%的乳酸菌和0.27%酵母菌混合菌液，25 ℃下培養(yǎng)5 d 的發(fā)酵劑可得到高品質腐乳。李順等人[22]應用單因素試驗和響應面法探索總狀毛霉（Mucorracemosus） 和米根霉（Rhizopusoryzae） 雙菌按1∶1 混合在28 ℃下發(fā)酵56 h，其產生的蛋白酶和糖化酶活力分別為50.5 U/mL 和15.2 U/mL，比單菌最優(yōu)條件下含量高10.1%～52.1%。

2 豆醬

2.1 豆醬生產中的關鍵菌種

制曲和發(fā)酵是豆醬生產發(fā)酵的2 個階段。微生物在制曲階段產生的酶活大小直接影響豆醬的發(fā)酵周期，在這發(fā)酵階段產生的酯類是構成豆醬香氣的主要成分。2 個環(huán)節(jié)缺一不可，發(fā)揮的作用不同，關鍵菌種也不同，研究表明制曲階段以霉菌和芽孢桿菌為優(yōu)勢菌種，乳酸菌主要是后酵時期的優(yōu)勢菌種。

2.1.1 霉菌

霉菌是豆醬制曲階段的優(yōu)勢真菌，Kim D Y 等人[23-24]利用DGGE 測序方法對韓國市售的5 份傳統發(fā)酵豆醬中微生物多樣性進行研究，結果表明整個發(fā)酵過程中主要微生物為青霉屬和毛霉屬。安飛宇等人[25]利用MiSeq 測序方法得到制曲階段中優(yōu)勢菌為毛霉菌（Mucor）。張鵬飛等人[26]對制曲的醬醅和發(fā)酵成熟的豆醬成品中微生物關系進行研究，結果表明產品的2 個階段中優(yōu)勢微生物基本相同，以毛霉菌和青霉菌為代表的優(yōu)勢真菌。Jung J Y 等人[27]利用焦磷酸測序技術對制曲中微生物多樣性進行研究，結果顯示豆醬制曲中毛霉菌屬（Mucor）、青霉菌屬（Penicillium） 為主要優(yōu)勢真菌屬。

2.1.2 芽孢桿菌

芽孢桿菌為制曲階段優(yōu)勢細菌，Jung J Y 等人[27]利用焦磷酸測序技術對制曲中微生物多樣性進行研究，結果表明豆醬制曲中芽孢桿菌屬是優(yōu)勢細菌。國內也有學者對制曲中微生物多樣性進行研究，姜靜等人采用Miseq 測序法研究制曲階段關鍵微生物，結果表明優(yōu)勢的細菌屬以乳桿菌屬（Lactobacillus）為主。張鵬飛等人[26]對制曲的醬醅和發(fā)酵成熟的豆醬成品中微生物關系進行研究，結果表明產品的制曲和發(fā)酵階段中優(yōu)勢微生物基本相同，芽孢桿菌為優(yōu)勢細菌。

2.1.3 乳酸菌

乳酸菌是豆醬生產中的優(yōu)勢微生物，主要包括魏斯氏菌、嗜鹽四聯球菌及植物乳桿菌等，豆醬發(fā)酵全過程乳酸菌都發(fā)揮優(yōu)越性作用，不同地域的豆醬中乳酸菌種類存在差異。陳浩等人[28]對南京地區(qū)2 份傳統發(fā)酵豆醬不同階段的優(yōu)勢原核微生物進行篩選，研究表明優(yōu)勢菌種是乳酸菌中的魏斯氏菌（Weissella cibaria，Weissella confusa，Weissella paramesenteroides） 和嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcus halophilus）。對河北地區(qū)傳統豆醬后酵時期優(yōu)勢微生物進行篩選，經16S rDNA 鑒定菌株xj008 為植物乳桿菌[29]。不同生產方式的豆醬中乳酸菌含量存在差異，乳酸菌主要通過產生乳酸提升腐乳品質，研究發(fā)現自然發(fā)酵豆醬中乳酸含量高于商品豆醬，感官評定中自然發(fā)酵豆醬的香味和滋味相比較商品豆醬都更勝一籌[30]。

2.2 豆醬發(fā)酵菌種改良及工藝優(yōu)化

2.2.1 菌種定向選育

研究者利用紫外誘變和化學誘變技術對菌種進行定向選育，王海曼等人[31]以東北豆醬中一株高產纖溶酶芽孢桿菌為出發(fā)菌株，經亞硝基胍化學誘變得到突變菌株HDBF-DJ3N7，其纖溶酶活力為368.78 IU/mL，是出發(fā)菌株的2.1 倍。米曲霉是豆醬生產中被廣泛應用、發(fā)酵性能優(yōu)良的工業(yè)發(fā)酵菌種，琥珀酸是米曲霉主要代謝產物也是人體所需的必要化合物。于江[32]利用紫外誘變選育一株產琥珀酸米曲霉菌株ASQ-1，在高鹽稀態(tài)條件下發(fā)酵90 d，應用ASQ-1 接種的豆醬中琥珀酸含量比米曲霉AS3.042原始菌種接種的豆醬高出6.5 倍。

2.2.2 混菌改良發(fā)酵

隨著科技的進步，各類生物組學技術的應用逐步揭示了豆醬中微生物相互作用及作用機理，結合現有技術為工業(yè)化生產提供指導依據?，F階段，工業(yè)化生產中逐步利用混合菌種制曲發(fā)酵。古小露[33]通過3 種發(fā)酵方式（單菌種發(fā)酵、分開制曲復合發(fā)酵和混合菌種發(fā)酵） 通過對比研究發(fā)現，當米曲霉3.042、黑曲霉AS3.35、枯草芽孢桿菌3 種菌株分開制曲，再按1∶2∶1 比例進行混合發(fā)酵，蛋白酶活力、總酯、氨基酸態(tài)氮含量最高，且感官評價分值接近市售豆醬。

3 醬油

3.1 醬油生產中的關鍵菌種

自1990 年起，隨著科技的不斷進步，研究者采用先進的分子生物學技術對醬油釀造中關鍵微生物進行深入挖掘[34]。微生物在醬油釀造的制曲和醬醪發(fā)酵工藝環(huán)節(jié)中發(fā)揮著不同的作用，霉菌在制曲階段發(fā)揮關鍵作用，乳酸菌在醬油釀造全過程均發(fā)揮著重要作用，芽孢桿菌在醬醪發(fā)酵及風味形成時期發(fā)揮著重要作用[35-36]。

3.1.1 霉菌

霉菌在醬油制曲階段發(fā)揮主要作用，霉菌數量受到醬油含鹽量的影響。Zhang L 等人[37]利用PLFA法對傳統發(fā)酵醬油的不同狀態(tài)（高鹽稀態(tài)和低鹽液態(tài)） 下醬醪過程中優(yōu)勢微生物進行研究，結果表明發(fā)酵全過程中，高鹽稀態(tài)醬醪的霉菌數量高于低鹽液態(tài)，于發(fā)酵60 d 達到峰值。釀造過程中霉菌種類豐富且功能不同，趙謀明等人[38]在醬醪中分離篩選得到18 株霉菌，經18S rDNA 鑒定后，曲霉屬主要包括黑曲霉、米曲霉和紅綬曲霉。對霉菌進行霉系分析發(fā)現，黑曲霉的β - 葡萄糖苷酶含量最高，米曲霉和紅綬曲霉的中性蛋白酶活力突出，為優(yōu)質霉菌的篩選提供理論依據。

3.1.2 乳酸菌

乳酸菌對醬油的風味形成至關重要，在醬油釀造各階段都表現出一定的優(yōu)勢。Wei Y 等人[39]采集了中國和日本醬油，對其發(fā)酵過程中微生物的群落結構變化進行綜合分析，結果表明醬油制曲階段優(yōu)勢菌群是乳酸菌，醬醪階段優(yōu)勢菌群仍是乳酸菌，但數量不足制曲階段的1/3。Tanasupawat S 等人[40]對泰國醬油醬醪階段中微生物種類和數量進行綜合分析，發(fā)現優(yōu)勢菌種為乳酸菌中的Lactobacillus acidipisis 和Tetragenococcus halophilus。許延濤等人[41]采用高通量測序對醬油釀造過程中風味細菌與風味物質生成進行研究，醬油形成的有機酸依靠乳酸菌作用使得醬油口感更加綿延絲滑。

3.1.3 芽孢桿菌

芽孢桿菌影響著醬油的滋味形成，吳博華等人[42]對傳統釀造醬油中篩選出產蛋白酶和淀粉酶的3 株芽孢桿菌分別為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），3 株菌產吡嗪類風味物質具有優(yōu)勢，給后續(xù)醬油中風味因子的研究提供依據。許延濤等人[41]采用高通量測序對醬油釀造過程中風味細菌與風味物質生成進行研究，保障了醬油的醇香風味，研究發(fā)現枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和葡萄球菌具有一定代謝L - 谷氨酰胺酶的能力，醬油品質不僅依賴米曲霉，還離不開滋味因子的關鍵菌保障了醬油的品質。

3.2 醬油發(fā)酵菌種改良及工藝優(yōu)化

3.2.1 菌種定向選育

吳博華等人[42]對工業(yè)使用的米曲霉3.042 經過連續(xù)復合誘變得到一株高產蛋白酶的突變菌株UCD4，蛋白酶含量較出發(fā)菌株提高了2 倍。張偉等人[43]通過在醬醪中添加適宜的高水平鹽含量來定向選育高耐鹽乳酸菌，利用其產乳酸特性降低醬醪pH 值達到改善品質的目的，在醬油醬醪中分別添加耐鹽乳酸菌突變體，醬醪的乳酸含量相比對照組增加了57.7%，風味物質相比對照組增加4 種，有機酸的峰面積比對照組增加了82.9%，結果表明高耐鹽乳酸菌對高鹽稀態(tài)醬油的風味和滋味有明顯改善作用。張夢寒等人[44]對解淀粉芽孢桿菌進行化學誘變、等離子誘變及定向馴化方法得到多個可高效利用精氨酸的突變菌株，結果顯示紫外誘變的突變體菌株C12 利用精氨酸能力較出發(fā)菌株提高了18%。

3.2.2 混菌改良發(fā)酵

盛明健等人[45]發(fā)現米曲霉2174 和2339 菌之間無拮抗作用，將兩菌等比例混合制曲以達到優(yōu)化制曲工藝的目的，獲得的種曲酶活力相較于單菌純種發(fā)酵均衡，初步應用于醬油的低鹽固態(tài)生產并取得了良好的成效。鐘方權等人[46]通過單因素試驗和正交試驗對醬油中篩選出的優(yōu)勢乳酸菌和米曲霉混合制曲的最佳工藝進行研究，結果顯示雙菌按2∶5 的比例混合置于33.5 ℃條件下發(fā)酵40 h 生產的醬油酶活性最高。研究人員先以米曲霉、黑曲霉菌種混合制坯，輔以乳酸菌和酵母菌等進行發(fā)酵，在不同發(fā)酵時期依次添加混合菌種的創(chuàng)新方式，大大改善了釀造醬油風味。米曲霉和黑曲霉以3∶1 最佳比例制曲后，發(fā)酵時7 d 添加乳酸菌，10 d 添加球擬酵母，20 d添加4 號魯氏酵母的為最佳菌株組合和最佳添加時間，發(fā)酵40 d 醬油的品質高，風味和色澤得到提升，特征香味物質豐富[47-48]。

4 豆豉

4.1 豆豉生產中的關鍵菌種

研究人員采用先進的分子生物學技術對臘豆發(fā)酵過程中關鍵微生物進行深度挖掘。臘豆發(fā)酵工藝環(huán)節(jié)包括制曲和后酵，其中制曲又包含前期、中期和后期，酵母菌在制曲初期為優(yōu)勢菌種，霉菌在制曲中后期發(fā)揮關鍵作用，細菌在后酵期成為優(yōu)勢菌種。

4.1.1 霉菌

霉菌是臘豆制曲的中后期的優(yōu)勢菌種，以根霉、曲霉和毛霉為主。陳麗艷等人[49]對臘豆的4 個發(fā)酵時期的優(yōu)勢微生物進行篩選，結果顯示霉菌在制曲中期及后期快速增長并抑制了酵母菌和細菌的生長成為此階段的優(yōu)勢菌種，后酵期霉菌受到細菌抑制，在整個生產過程中霉菌呈現先增長后下降的趨勢。石聰等人[50]采用454 高通量焦磷酸測序技術對瀏陽傳統發(fā)酵豆豉的微生物多樣性進行動態(tài)結構觀察，在后15 d 真菌顯著增加，制曲中關鍵微生物為根霉和曲霉。樊敏等人[51]采用聚合酶鏈式反應- 變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE） 技術對貴州地區(qū)4 種豆豉樣本進行發(fā)酵微生物的篩選，結果顯示霉菌屬曲霉菌（Aspergillus） A1bC-4 和沙門柏干酪青霉（Penicillium camemberti） 為優(yōu)勢真菌。倪慧等人[52]采用MiSeq測序技術對苗族自治州的傳統發(fā)酵豆豉中關鍵真菌菌群結構進行研究，結果顯示傳統發(fā)酵豆豉優(yōu)勢微生物多樣性較高，曲霉（Asperhillus） 和米根霉（Rhizopus） 是主酵微生物。李薇等人[53]對永川毛霉型豆豉傳統發(fā)酵過程中關鍵微生物進行群落結構的分析及動態(tài)變化的規(guī)律總結，結果顯示在制曲階段，以毛霉屬、曲霉屬為主的真菌占絕對優(yōu)勢。

4.1.2 酵母菌

酵母菌在制曲初期占發(fā)酵優(yōu)勢，陳麗艷等人[49]對臘豆的4 個發(fā)酵時期的優(yōu)勢微生物進行篩選，結果顯示制曲初期以酵母菌為優(yōu)勢菌種，制曲中后期細菌處于劣勢，后酵期酵母菌再度成為優(yōu)勢菌種并對豆豉的風味物質形成起到關鍵作用。酵母菌通過提高風味物質含量改善產品品質，萬明等人[54]利用TCC培養(yǎng)基對豆豉微生物進行分離篩選后的一株高產酒精的菌株，經分子生物學鑒定后，確定該菌株為釀酒酵母，提高風味物質羥基丙酮、丙醇和琥珀酸等含量，這對于豆豉獨特風味的形成具有非常重要的貢獻。

4.1.3 細菌

豆豉后酵時期細菌成為優(yōu)勢菌群，石聰等人[50]采用454 高通量焦磷酸測序技術對瀏陽傳統發(fā)酵豆豉的微生物多樣性進行動態(tài)結構觀察，發(fā)酵全過程中芽孢桿菌屬的含量和種類均處于高水平。樊敏等人[51]采用PCR-DGGE 技術對貴州地區(qū)4 種豆豉樣本進行發(fā)酵微生物的篩選，結果顯示芽孢桿菌為優(yōu)勢細菌，以地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌為主。李薇等人[53]對永川毛霉型豆豉傳統發(fā)酵過程中關鍵微生物進行群落結構的分析及動態(tài)變化的規(guī)律總結，結果顯示產品生產全過程細菌多樣性高于真菌，制曲階段細菌含量較少，但在后酵階段產品中微生物結構發(fā)生明顯變化，芽孢桿菌屬、乳球屬、葡萄球菌屬等細菌在這一階段有較為穩(wěn)定的豐度，細菌總數占絕對優(yōu)勢。細菌產生的物質是風味物質的組成成分，后酵階段是風味物質形成的重要時期。

4.2 豆豉發(fā)酵菌種改良及工藝優(yōu)化

目前，臘豆發(fā)酵多為傳統發(fā)酵，主要以家庭式生產為主，工業(yè)化程度低，近年來有較多學者致力于改良菌種發(fā)酵工藝，包括菌種優(yōu)化和混菌組合發(fā)酵等，以期提高豆豉風味和品質，并推廣致力于工業(yè)化生產應用。

4.2.1 菌種定向選育

劉敏等人[55]通過在臘豆制曲階段分別添加總狀毛霉和米曲霉滬釀3.042 發(fā)酵對生物胺含量變化的研究，結果顯示曲霉和毛霉組的產品在發(fā)酵后期生物胺含量分別增加3.40，3.05 倍。卞承蔭等人[56]對豆豉中產溶栓酶的蠟狀芽孢桿菌LD-8547 為出發(fā)菌種，通過紫外線和甲基磺酸乙酯的雙重誘變復篩后，最終得到一株發(fā)酵性能優(yōu)良且傳代穩(wěn)定的高產枯草芽孢桿菌，經純化5 代后，發(fā)現酶活力能夠保持相對穩(wěn)定的水平，維持在16 351 U/mL。

4.2.2 混菌改良發(fā)酵

孫成行等人[57]分別對枯草芽孢桿菌和曲霉菌純種制曲工藝進行優(yōu)化，前者在制曲階段接種量為1%，置于37 ℃下發(fā)酵50 h，后者接種量為4%，置于35 ℃下發(fā)酵48 h，根據前期純種制曲條件選定混菌制曲發(fā)酵正交試驗取值范圍，試驗結果顯示，制曲最佳條件為兩菌按1∶4 的比例混勻置于36 ℃下發(fā)酵50 h。高澤鑫等人[58]利用正交試驗法對枯草芽孢桿菌BN-05 和毛霉菌MS-7 雙菌混合發(fā)酵進行工藝優(yōu)化，結果顯示二者按2∶1 制得混合發(fā)酵液，接種量為6%置于30 ℃下發(fā)酵20 h 為最佳發(fā)酵條件，降低了豆豉產品中氨臭味，改善了豆豉風味。龐超[59]通過利用Design Expert 8.06 軟件對枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和清酒乳酸桿菌混合比例進行研究，結果表明，三者按照0.533∶0.367∶0.100 的比例配制凍干粉應用于臘豆發(fā)酵可達到最佳品質，說明臘豆發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌在品質提升中占主導作用。

5 結語

20 世紀90 年代以來，人們對加工大豆營養(yǎng)成分的認識逐漸深入，優(yōu)異的大豆加工工藝方式不僅大大減輕了大豆自身的酸苦氣味，還降低了各種抗藥性、抗營養(yǎng)因子。發(fā)酵豆制品受到廣泛喜愛，其研發(fā)生產及加工過程引起研究人員的重視，致力于解決產品品質不優(yōu)良、產品的安全無保障和生產工藝周期漫長、缺乏統一的食品生產流程和產品配方。目前，國內外學者已經積極展開對發(fā)酵豆制品工業(yè)化生產的相關研究，就目前的研究工作現狀情況來看分析，生產一種高品質的加工發(fā)酵豆制品建議從以下幾個方面進行入手。

5.1 菌種定向選育

研究者從傳統發(fā)酵豆制品中通過紫外誘變技術、化學誘變技術、耐鹽耐高溫等物理條件改良菌種，摸索菌種最佳發(fā)酵條件，發(fā)揮其功能特性最大化，以提高產品品質，從而能夠保護地方產品特色優(yōu)勢，改善發(fā)酵工藝、提高生產效率、節(jié)約成本投入及提高產品品質等。

5.2 優(yōu)化菌種組合

傳統發(fā)酵的食品主要是一系列自然微生物的共同作用下歷經漫長的時間發(fā)酵而形成，發(fā)酵環(huán)境不可控，給生產帶來局限性。因此，除了對菌種改良優(yōu)化外，還應該探索混合菌種組合發(fā)酵。分離出高質量菌種，并進行組合優(yōu)化，組合菌種共同作用于豆制品中發(fā)揮最大的作用，提高發(fā)酵豆制品所需生物量含量，使發(fā)酵過程提前完成，縮短生產周期。添加混合菌種的最佳組合比例和菌種的添加量一直是問題研究的一個重點。

5.3 嚴控雜菌污染

發(fā)酵豆制品的品質主要取決于優(yōu)勢菌種的有效作用，發(fā)酵食品也最易受到雜菌污染導致產品敗壞。一方面，控制食鹽的添加量，食鹽過量會減少雜菌污染但不利于產品風味和消費者飲食健康。研究人員認為需要在有效減少自制發(fā)酵豆制品污染風險的同時，也要能滿足人們對低油低鹽均衡膳食的健康追求，不斷尋求一個綜合平衡點的方法；另一方面，嚴格控制污染源，污染源主要來源于生產者手部、發(fā)酵器皿、生產設備、車間環(huán)境、輔味配料等，需要從多方面制定系統的操作規(guī)范，嚴格控制雜菌的污染，有效防范降低損失。

5.4 制定工藝標準

發(fā)酵豆制品品質不僅取決于微生物的作用，同時發(fā)酵過程的加工工藝也極其重要。傳統生產方式都是祖祖輩輩傳授，各家各戶的生產工藝都不完全相同。發(fā)酵豆制品的品質與當地氣候環(huán)境、生產制作的手藝和制作時間都息息相關。不同地域的人們往往訂制更適宜地區(qū)口味喜好的生產工藝，增加了發(fā)酵、釀造的復雜性和安全性。為了有效保證發(fā)酵豆制品的品質穩(wěn)定性和安全性，逐步完善發(fā)酵原材料選購、技術人員上崗培訓，舉辦產業(yè)交流、制定產品成分指標、規(guī)范生產環(huán)境和設施，完善并落實健全的生產體系，為發(fā)酵豆制品工業(yè)和千家萬戶居民提供一套可嚴格參照的生產工藝標準。