鄧 潔，王 帥，陳功文，胡福良，鄭火青

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

蜜蜂(Apisspp.)是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，不僅能為人類提供蜂產(chǎn)品，還能為植物授粉，保護(hù)生態(tài)系統(tǒng)多樣性[1,2]。但近幾十年來，蜂群損失現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重[3]。研究表明，蜂群健康受到多種因素影響，主要包括蜜蜂病毒感染、微孢子蟲和狄斯瓦螨侵染、農(nóng)藥和殺螨劑殘留、氣候變化、蜜粉源條件惡化、遺傳多樣性降低和棲息地缺失等[4]。

病毒感染是影響蜜蜂健康的最重要因素之一[5]。目前在蜂群中發(fā)現(xiàn)的病毒已經(jīng)超過30種[6]。其中大部分病毒為屬于傳染性軟腐病毒科 (Iflaviridae)或雙順反子病毒科(Dicistroviridae)的正義單鏈RNA病毒。蜂群內(nèi)最常見且易致病的蜜蜂病毒包括蜜蜂急性麻痹病毒(Acute bee paralysis virus,ABPV)、黑蜂王臺(tái)病毒(Black queen cell virus,BQCV)、慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)、殘翅病毒(Deformed wing virus,DWV)、克什米爾蜜蜂病毒(Kashmir bee virus,KBV)、以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus,IAPV)和囊狀幼蟲病毒(Sacbrood virus,SBV)等7種[7]。還有少數(shù)蜜蜂病毒為DNA病毒，例如蜜蜂絲狀病毒(Apis melliferafilamentous virus,AmFV)和蜜蜂虹彩病毒(Apis iridescentvirus,AIV)[8]。

本文從IAPV的發(fā)現(xiàn)與分布、分子結(jié)構(gòu)特征、致病特征、傳播途徑、檢測(cè)方法和防治措施等方面進(jìn)行了系統(tǒng)性的介紹，以期為蜂群中IAPV的檢測(cè)、分子致病機(jī)制和防治等研究提供一定的參考和依據(jù)。

1 IAPV的發(fā)現(xiàn)與地理分布

1.1 IAPV的發(fā)現(xiàn)

IAPV最早在2004年由以色列希伯來大學(xué)的Ilan Sela等人發(fā)現(xiàn)，由于它的發(fā)病癥狀、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、生物學(xué)和核酸序列等與急性蜜蜂麻痹病毒(ABPV)高度相似，并且給以色列養(yǎng)蜂業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失，所以命名為以色列急性麻痹病毒[9-10]。

1.2 IAPV的地理分布

IAPV分布廣泛。在國內(nèi)，我國學(xué)者2008年首次在廣東的西方蜜蜂蜂群(主要為意大利蜜蜂Apis melliferaligustica，簡稱意蜂)中檢測(cè)到了IAPV[11]；2012年發(fā)現(xiàn)IAPV也能侵染我國的東方蜜蜂(主要為中華蜜蜂Apis cerana，簡稱中蜂)[11]。在國外，法國[8]、韓國[12]、美國[13]、以色列[14]、澳大利亞、墨西哥[15]、西班牙[16]、波蘭[17]、日本[18]、意大利[19]、巴西[20]、丹麥[21]、土耳其[22]、南非[23]、約旦[24]和越南[25]等除南極洲以外的各大洲的西方蜜蜂中也都有檢測(cè)到IAPV。

根據(jù)ORF1區(qū)域的遺傳多樣性，IAPV有3個(gè)典型基因型，包括澳大利亞、美國的2個(gè)基因型以及在中國、以色列和韓國地區(qū)檢測(cè)到的1個(gè)基因型[26-27]。

2 IAPV的分子結(jié)構(gòu)特征

IAPV是正義單鏈RNA病毒，屬仿小核糖核酸病毒目(Picorna-likevirus)雙順反子病毒科(Dicistroviridae)，具有一個(gè)無被膜的20面體蛋白外殼，病毒粒子直徑為20～30 nm，在氯化銫中的浮力密度為1.33～1.42 g/mL，沉降系數(shù)為100～190 S[28-29]。

IAPV基因組由9 487個(gè)核糖核苷酸組成(不包括poly(A)尾巴)，包含2個(gè)不重疊的開放閱讀框(open reading frame,ORF)，分別編碼含有非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的多蛋白，靠3'端的O RF由908個(gè)氨基酸組成，這2個(gè)O RF被184個(gè)核苷酸間隔開；終止密碼子位于結(jié)構(gòu)蛋白的C末端附近，緊接著是甲硫氨酸密碼子，所以可能會(huì)發(fā)生通讀，翻譯合成含944個(gè)氨基酸的序列[10,30]。

IAPV病毒粒子呈球形，其最大外徑為34 nm，由衣殼蛋白VP1、VP2和VP3以偽T=320面體對(duì)稱性排列而成，次要衣殼蛋白VP4附著在衣殼的內(nèi)表面。VP1亞基圍繞5倍軸形成五聚體，VP2和VP3亞基圍繞20面體3倍軸構(gòu)成交替的異六聚體，3種主要的衣殼蛋白均具有β夾心折疊結(jié)構(gòu)，且其N末端位于衣殼內(nèi)部，C末端暴露在病毒體表面[31]。

由于IAPV空衣殼結(jié)構(gòu)緊湊，不含可能用作基因組釋放通道的孔，因此，IAPV基因組可能是通過衣殼壁中獨(dú)特區(qū)域重排形成的孔進(jìn)行釋放和傳遞，基因組釋放后該孔則會(huì)關(guān)閉[32]。

3 IAPV的致病性

3.1 IAPV與蜂群崩潰失調(diào)癥

2006年底，美國出現(xiàn)蜂群異常損失的現(xiàn)象，之后蔓延到美國的35個(gè)州和加拿大部分地區(qū)，造成了30%～90%的蜂群損失率，這種現(xiàn)象被命名為蜂群崩潰失調(diào)癥(Colony Collapse Disorder,CCD)[33]?；加蠧CD的蜂群看起來很健康，沒有任何疾病跡象，但大量成年工蜂在短時(shí)間內(nèi)消失，并且蜂箱周圍沒有工蜂的尸體，但蜂王、幼蟲、未成年的工蜂以及蜜蜂食物等仍留在蜂箱中。由于CCD事件的發(fā)生，全球農(nóng)業(yè)授粉危機(jī)和生態(tài)危機(jī)受到了社會(huì)各界的廣泛關(guān)注，與之相關(guān)的蜜蜂病毒病也逐漸被重視[9]。

最初，IAPV被認(rèn)為是導(dǎo)致CCD的主要因素[10]。之后的研究表明，CCD爆發(fā)可能是病毒和其他病原微生物等多因素作用的結(jié)果，例如狄斯瓦螨、微孢子蟲與IAPV和DWV等病毒的綜合作用[35]。雖然后續(xù)的研究并沒有發(fā)現(xiàn)IAPV與CCD之間的必然聯(lián)系[36]，但I(xiàn)APV對(duì)蜂群的影響仍不容忽視。

3.2 IAPV的致病特征

IAPV可以導(dǎo)致蜜蜂的全身感染。在發(fā)病早期，蜜蜂的唯一癥狀是腹部尾端變黑；發(fā)病中期，蜜蜂的胸部變暗，不停地在蜂箱附件轉(zhuǎn)圈，幾乎不飛行和覓食；發(fā)病后期，蜜蜂肢體會(huì)出現(xiàn)麻痹和發(fā)抖的癥狀，經(jīng)過一段時(shí)間的抽搐、痙攣，最終死亡。被IAPV感染的蜜蜂會(huì)出現(xiàn)行為、認(rèn)知障礙和學(xué)習(xí)、記憶能力衰退等現(xiàn)象[30,37]。此外，IAPV感染不僅會(huì)降低蜜蜂的歸巢能力，而且會(huì)縮短蜜蜂的壽命[38]。

3.3 IAPV與冬季越冬蜂群損失

多項(xiàng)在美國和德國的長期調(diào)查表明IAPV等病毒與冬季蜂群損失間有緊密聯(lián)系[6,9]。近年來，我國的西方蜜蜂蜂群也出現(xiàn)了蜂群大量損失的現(xiàn)象[40-41]。陳功文等對(duì)浙江省3個(gè)蜂場(chǎng)的48群蜜蜂進(jìn)行了跟蹤調(diào)查，探究了與越冬期蜜蜂健康緊密相關(guān)的病毒種類，發(fā)現(xiàn)IAPV是影響越冬期意蜂健康的重要因素[7]。

4 IAPV的感染與傳播

4.1 IAPV的宿主

IAPV首次在西方蜜蜂上發(fā)現(xiàn)[10]，已知還能感染東方蜜蜂、熊蜂和胡蜂等授粉昆蟲[18,42-44]。在熊蜂和西方蜜蜂上已有IAPV致病性相關(guān)的報(bào)道。在熊蜂上，IAPV能侵染其各個(gè)組織，且主要富集在腸道和脂肪體等組織[45-46]。

IAPV不僅能侵染多種授粉昆蟲，還能侵染其他非授粉昆蟲。目前，有研究發(fā)現(xiàn)寄生蜂、蜂箱小甲蟲和蜚蠊目、革翅目、鱗翅目昆蟲以及蛛形綱的動(dòng)物中都能檢測(cè)到IAPV[44,47]，但這些昆蟲是取食了受感染的蜜蜂或者其他食物還是真正的感染了該病毒，仍需進(jìn)一步研究來明確。

4.2 IAPV的組織分布

感染了IAPV的蜜蜂，其血淋巴、腦、脂肪體、唾液腺、咽下腺、腸、神經(jīng)、氣管和肌肉中均能檢測(cè)到該病毒，但不同組織中IAPV病毒基因組拷貝數(shù)的相對(duì)豐度差異較大，由低到高依次為：肌肉<脂肪體<大腦<氣管<唾液腺<咽下腺<神經(jīng)<腸道。神經(jīng)組織的IAPV含量相對(duì)其他組織較高，這與蜜蜂發(fā)病時(shí)出現(xiàn)麻痹、發(fā)抖、抽搐等癥狀也緊密相關(guān)。原位雜交顯示IAPV特異性信號(hào)也存在于受感染蜂王的卵子、卵巢和精子以及腸道中[26]。IAPV也可以在胡蜂的中腸、脂肪體、腦和卵巢等組織中累積，其中脂肪體的含量最高[45]。

4.3 IAPV的擴(kuò)增特性

蜜蜂通常被多種病毒共同感染[48]，所以直接從自然感染的成年蜜蜂中分離出單一的IAPV病毒十分困難。Humberto等[49]通過對(duì)意蜂工蜂蛹進(jìn)行一系列的病毒接種和純化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，注射接種富含IAPV的混合病毒液(IAPV、BQCV、ABPV和DWV)20 h后，工蜂蛹體內(nèi)的IAPV大量擴(kuò)增且蜂蛹只能發(fā)育到粉眼階段。利用接種混合病毒液5d后的工蜂蛹提取病毒液，將病毒液再次注射到工蜂體內(nèi)，如此重復(fù)2次，所提取的病毒液中僅含IAPV，且IAPV的含量至少為每微升含105個(gè)病毒粒子[63]。利用該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)IAPV的富集，獲得純度很高的IAPV病毒液。

IAPV在成年工蜂中也具有類似的擴(kuò)增特性。Carrillo-Tripp等[50]使用富含SBV的混合病毒液(SBV、IAPV、DWV和BQCV)感染意蜂工蜂，發(fā)現(xiàn)IAPV在接種24 h后顯著增加，并且只有IAPV滴度在所有檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)(12 h、36 h和60 h)都升高。與其他病毒相比，IAPV在蜜蜂蛹期和成蜂期的擴(kuò)增都具有顯著優(yōu)勢(shì)，這可能與IAPV的急性致病特征有關(guān)，但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究?；贗APV的擴(kuò)增特性，其對(duì)蜜蜂的影響更不容忽視。

4.4 IAPV的傳播途徑

蜜蜂病毒在蜂群中主要有2種傳播途徑：水平傳播和垂直傳播[51]。水平傳播是指病毒在同一世代的不同個(gè)體間擴(kuò)散。水平傳播主要有4種途徑，分別是飼糧、體表接觸、蜂王交尾和蟲媒傳播。垂直傳播指蜜蜂病毒可以通過蜂王的繁殖，在成年蜜蜂與其子代個(gè)體之間傳播[13]。

IAPV能通過水平傳播侵染各個(gè)級(jí)型和發(fā)育時(shí)期的蜜蜂。蜜蜂在取食被病毒顆粒污染的食物、哺育蜂在飼喂患病蜂王和幼蟲以及內(nèi)勤蜂在清理患病幼蟲時(shí)，都會(huì)接觸并傳播IAPV[37]。此外，狄斯瓦螨在吸食不同蜜蜂的血淋巴時(shí)也能促進(jìn)IAPV在蜂群中的傳播[52]。

在蜂王儲(chǔ)精囊和卵巢內(nèi)的生殖細(xì)胞以及雄蜂精液中也能檢測(cè)到IAPV，表明其不僅可以通過交配行為在蜂群內(nèi)水平傳播，也可以通過垂直傳播進(jìn)行擴(kuò)散[26]。

5 IAPV的檢測(cè)方法

5.1 IAPV檢測(cè)難點(diǎn)

由于蜜蜂病毒大部分情況下為隱性感染，且IAPV和A B PV的致病癥狀極為相似，所以很難通過表觀癥狀判斷蜂群是否感染IAPV[30,53]。而即使通過分子生物學(xué)檢測(cè)，也存在難點(diǎn)。

ABPV、KBV和IAPV均屬于典型的雙順反子病毒科病毒，ABPV和IAPV之間的基因同源性為92%，而KBV和IAPV之間的基因同源性高達(dá)96%。由于病毒的氨基酸序列高度相似，所以IAPV曾被認(rèn)為是KBV的一個(gè)變種或者亞型；最初的幾年里，IAPV也常被誤報(bào)道為KBV[53-54]。例如，韓國、俄羅斯、約旦、澳大利亞檢測(cè)到的某些病毒序列其實(shí)是將IAPV誤報(bào)道為KBV[53,55]。此外，也有KBV被報(bào)道為IAPV的情況發(fā)生[56]。ABPV、KBV和IAPV間的相似性使得病毒種類的鑒定、分類以及流行病學(xué)調(diào)查變得困難，但隨著檢測(cè)方法的優(yōu)化，已能準(zhǔn)確地對(duì)這3種病毒進(jìn)行區(qū)分。

5.2 基于核酸序列的檢測(cè)方法

近年來，隨著核酸分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè)病毒的手段也不斷創(chuàng)新?；诰酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的檢測(cè)是一種常用方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(Realtime-qPCR)被證明比酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或常規(guī)PCR更為靈敏[57]；巢式PCR可以提高從環(huán)境樣品中檢測(cè)蜜蜂病原體的靈敏度；多點(diǎn)超快速實(shí)時(shí)PCR(UR-qPCR)則可以快速地同時(shí)檢測(cè)多種蜜蜂病原體[58]。

與KBV和ABPV相比，IAPV的聚合酶多蛋白基因(polymerase polyprotein)相對(duì)保守[53]，張?bào)w銀等[59]針對(duì)該基因建立了快速檢測(cè)IAPV的常規(guī)PCR方法。

UR-qPCR方法能針對(duì)IAPV基因組內(nèi)的多個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，利用3對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增RNA依賴性RNA聚合酶基因(RdRp)和2個(gè)衣殼蛋白基因(VP1和VP3)，不僅提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，也降低了引物設(shè)計(jì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；此外，該方法還可以用于快速篩選IAPV基因組特定區(qū)域中的突變位點(diǎn)[60]。

2020年，Cagirgan和Yazici基于多重RT-PCR技術(shù)開發(fā)了一種可以同時(shí)檢測(cè)ABPV、BQCV、CBPV、DWV、IAPV和SBV的方法，具有較高的特異性和準(zhǔn)確性，但該檢測(cè)方法靈敏度較低，不適用于蜂群中病毒滴度較低時(shí)的檢測(cè)[61]。

5.3 其他檢測(cè)方法

病毒形態(tài)學(xué)檢測(cè)雖然能較為準(zhǔn)確地測(cè)定蜜蜂病毒顆粒的大小、外型和侵染位置，但在電鏡下無法直觀地區(qū)分病毒顆粒的種類。此外，樣本處理的復(fù)雜性和設(shè)備的昂貴使得這一檢測(cè)方法不便用于常規(guī)鑒定。

基于免疫學(xué)原理的病毒檢測(cè)方法可用于基層檢驗(yàn)部門的快速檢測(cè)。目前，利用該方法已研制了可以用于CSBV臨床檢測(cè)的雙抗夾心ELISA檢測(cè)試劑盒[62]，該試劑盒具有較高的靈敏性和準(zhǔn)確性。但由于IAPV與ABPV、KBV具有較高的基因同源性，應(yīng)用該方法進(jìn)行IAPV的檢測(cè)會(huì)存在特異性較差等問題。

6 IAPV的防治

目前，仍沒有能治療IAPV感染的經(jīng)濟(jì)、有效措施。在生產(chǎn)上，對(duì)包括IAPV等病毒引起的蜜蜂病毒病都只能以預(yù)防為主，通過綜合性的手段保持蜂群健康，增強(qiáng)蜜蜂抵抗力。適當(dāng)?shù)难a(bǔ)助飼喂和保溫都能增強(qiáng)蜂群對(duì)病毒的抵抗能力。對(duì)于患病蜂群，可以通過斷子清巢來減少病原對(duì)蜂群產(chǎn)生持續(xù)性損害，同時(shí)，燒毀患病嚴(yán)重的子脾、適時(shí)更換巢脾和更換患病蜂王也可以減少病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散。

蜂螨與蜜蜂病毒的協(xié)同作用與蜂群的群勢(shì)下降密切相關(guān)[63]。當(dāng)瓦螨侵染蜜蜂時(shí)，隱性感染的病毒會(huì)快速增殖，從而使蜜蜂出現(xiàn)患病癥狀，導(dǎo)致蜜蜂死亡甚至蜂群崩潰[37]，所以及時(shí)地防螨治螨，增強(qiáng)蜂群的抵抗力對(duì)預(yù)防蜂群感染IAPV及其他病毒十分重要。

Maori等[30]合成了來源于IAPV基因序列的雙鏈RNA(dsRNA)，并飼喂給被IAPV感染的實(shí)驗(yàn)蜂群，使得IAPV出現(xiàn)基因沉默的現(xiàn)象，從而降低了蜂群中IAPV的感染量，改善了感染IAPV蜂群的整體健康狀況，所以RNA干擾技術(shù)(RNAi)也是控制IAPV的有效途徑[64]，但由于dsRNA生產(chǎn)成本較高，在實(shí)際生產(chǎn)上這一治療手段并未得到廣泛應(yīng)用。

7 小結(jié)與展望

IAPV是一種宿主范圍廣，對(duì)蜜蜂致病性高的常見病毒。對(duì)其流行病學(xué)、致病性等開展研究，不僅關(guān)系到蜂群健康和蜂業(yè)發(fā)展，同時(shí)對(duì)于維護(hù)農(nóng)業(yè)發(fā)展和保護(hù)野生授粉昆蟲都有重要意義。根據(jù)本課題組近年來開展的流行病學(xué)調(diào)查研究，IAPV在東方蜜蜂上的感染率也較高。鑒于IAPV在西方蜜蜂上的致病性，IAPV對(duì)東方蜜蜂等其他宿主的致病性亟待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

IAPV的防控是個(gè)極具挑戰(zhàn)但又必須面對(duì)的問題。蜂群用藥存在蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全問題的風(fēng)險(xiǎn)，靶向用藥不是唯一選擇，綜合防控是基本原則。IAPV與其他病原間的關(guān)系及在不同條件下的致病性研究一方面有助于增加對(duì)IAPV致病機(jī)制的了解，另一方面也有助于IAPV的防控。

針對(duì)IAPV的研究多集中于流行病學(xué)調(diào)查和致病性，對(duì)其致病機(jī)理的研究仍然較為缺乏。其中原因和缺少相應(yīng)的體外研究模型(無可用的成熟蜜蜂細(xì)胞系)有關(guān)。IAPV致病伴隨有明顯神經(jīng)性癥狀，未來可以蜜蜂為材料研究該病毒感染與其致病癥狀間的聯(lián)系，探討其致病機(jī)制。同時(shí)，該病毒在不同物種宿主間的傳播及適應(yīng)，在病毒的進(jìn)化和跨物種傳播方面也很有研究價(jià)值。