戶乃麗 徐曉雪 鄒林樾 田 蜜 趙君朋

(首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，北京100069)

肝臟含有豐富的免疫細(xì)胞一枯否細(xì)胞(Kupffer Cells，KCs)細(xì)胞，KCs是組成機(jī)體單核一巨噬細(xì)胞系統(tǒng)最大的群體。KCs具有吞噬、免疫調(diào)節(jié)及監(jiān)視等功能，2在肝臟的炎性反應(yīng)、缺血再灌注損傷、移植免疫等方面發(fā)揮著重要作用[1-3]。小鼠KCs以其表面表達(dá) F4/80、CD11b、CD68 和 C 型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員F為特征表[4,5]。KCs具有異質(zhì)性、極化性，盡管各型巨噬細(xì)胞均表達(dá)F4/80，但根據(jù)其來(lái)源和環(huán)境的不同KCs存在多種表型和亞群，各型之間也可相互轉(zhuǎn)化，相對(duì)于選擇性貼壁法和磁珠分選法，流式細(xì)胞分選在多參數(shù)細(xì)胞亞群識(shí)別上有著更好的應(yīng)用。目前，流式細(xì)胞分選廣泛應(yīng)用于血液或脾臟，肺臟等組織器官上目的細(xì)胞的篩選[6-8]，本實(shí)驗(yàn)擬利用密度梯度離心結(jié)合流式細(xì)胞4色標(biāo)記分選純化KCs，探索適宜KCs分選的實(shí)驗(yàn)條件并對(duì)分選后的KCs進(jìn)行活性、表型及功能的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠(10只雄性)，SPF級(jí)，體質(zhì)量28～30g，5～6 周齡，購(gòu)于大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

1.2 試劑與儀器

膠原酶IV、臺(tái)盼藍(lán)試劑外購(gòu)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清外購(gòu)；OptiprepTM 密度梯液、7-AAD染料、CD45-BV421、CD11b-APC、F4/80-PE、CD86-FITC、CD206AF700抗體外購(gòu)；FITC熒光微珠外購(gòu)；小鼠TNF-α、IL-1βELISA試劑盒外購(gòu)；流式細(xì)胞胞儀質(zhì)控CST微球、Accudrop beads外購(gòu)；實(shí)驗(yàn)所用儀器為BDAriaIII型流式細(xì)胞分選儀，配有488nm、561nm、633nm、405nm 4只激光器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1肝細(xì)胞懸液的制備

膠原酶灌注：小鼠給予100g/mL水合氯醛0.3mL腹腔注射，麻醉后消毒皮毛剪開(kāi)腹腔，暴露肝臟門靜脈，門靜脈穿刺并縫合固定，于常溫緩慢注入D-Hanks液(無(wú)Ca2+，Mg2+，Ph=7.4)至肝臟膨大為原來(lái)的2倍大，剪斷下腔靜脈，肝臟血液被沖出回縮后，繼續(xù)灌注D-Hanks溶液20mL至肝臟變?yōu)榘咨?。將肝臟取出置于平皿中，用含37℃0.05%IV型膠原酶D-Hanks溶液灌注5mL/min 灌注10min，肝組織逐漸松散塌陷，用滴管吹打，使細(xì)胞脫落呈懸液狀態(tài)，200目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾收集肝細(xì)胞懸液。

1.3.2密度梯度離心分離肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞

灌注分離出的單細(xì)胞懸液，4℃50g離心2～3次，棄沉淀，將上清液500g 離心10min，棄上清，細(xì)胞沉淀RPMI-1640 培養(yǎng)基懸浮，清洗一遍并重懸，樣品即可用于梯度離心。15mL離心管，依次加入17.6%的OptiprepTM 液5mL，11.2% 的OptiprepTM 液5mL，頂層加PBS懸浮細(xì)胞懸液3mL，常溫 1400g離心15 min。收集介于17.6% 與11.2% OptiprepTM液之間的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞[9]，加入RPMI-1640 培養(yǎng)基10ml重懸細(xì)胞，4℃，1000g 離心10min，棄上清，然后重懸細(xì)胞，得到肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞懸液。

1.3.3流式細(xì)胞染色及分選

取分離的細(xì)胞5×105細(xì)胞，用100mlPBS定容懸浮，F(xiàn)c-R 阻斷劑封閉后依次加入BV421標(biāo)記的CD45、PE標(biāo)記的F4/80、APC標(biāo)記的CD11b抗體各1μl，冰上避光孵育1h，加入PBS離心洗滌2次后棄上清，將細(xì)胞懸液加PBS定容至400μl，加入1μl 7-AAD混勻待上機(jī)檢測(cè)分選。流式細(xì)胞儀鞘液桶和水桶用75%酒精浸泡消毒4h以上，用純水沖洗干凈，鞘液桶中加入無(wú)菌PBS，開(kāi)機(jī)打開(kāi)FACSDiva軟件并運(yùn)行開(kāi)機(jī)程序，安裝85μm噴嘴，分選電壓4500V，F(xiàn)req設(shè)定為47.4，調(diào)節(jié)液滴振幅Ampl值使液流處于穩(wěn)定狀態(tài)，第一滴液流斷點(diǎn)位置Drop1為345，Gap為9，選中主液流框的sweet spot鍵，維持液流穩(wěn)態(tài)。上樣Accudrop beads微球調(diào)節(jié)Drop delay數(shù)值為30.31，微球在initial或fine tune分選模式下側(cè)液流偏轉(zhuǎn)都達(dá)到99%以上。上樣后通過(guò)空白和陰性對(duì)照管圈定目的細(xì)胞群，采用purity模式分選7AAD-CD45+CD11b+F4/80+的KCs，接收管中預(yù)置0.5mL培養(yǎng)基接收分選所得細(xì)胞。

1.3.4分選后純度及細(xì)胞存活率檢測(cè)

吸取100μL分選后的細(xì)胞上流式細(xì)胞儀，在原分選方案中檢測(cè)分選后細(xì)胞的純度。另吸取新提取的細(xì)胞懸液按9∶1比例加入0.4% 臺(tái)盼藍(lán)溶液充分混勻后。加入改良的牛鮑計(jì)數(shù)板，顯微鏡下觀察細(xì)胞見(jiàn)未被染色細(xì)胞為活細(xì)胞。

1.3.5分選后KC表面標(biāo)志物的檢測(cè)

分選后的細(xì)胞離心去除上清液PBS，調(diào)整體積至100μL，F(xiàn)cR阻斷劑封閉后孵育抗體CD206AF700、CD86FITC，根據(jù)同型抗體染色情況確定CD206，CD86陽(yáng)性細(xì)胞比例。由于分選后的細(xì)胞為CD45BV421、F4/80PE、CD11bAPC陽(yáng)性的細(xì)胞，所以檢測(cè)時(shí)應(yīng)注意各檢測(cè)光路熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)。

1.3.6分選后細(xì)胞吞噬功能的檢測(cè)

分選后的細(xì)胞離心沉淀去上清，沉淀的細(xì)胞用含青鏈霉素的PRMI1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1×106/mL，取0.5mL細(xì)胞接種于12孔板中，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，每孔加入2μL FITC標(biāo)記的熒光微球，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2h,然后細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，PBS洗3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞吞噬熒光微球情況。

1.3.7KCs的促炎性反應(yīng)

分選后的細(xì)胞按照5×105接種入12孔板，培養(yǎng)24h后培養(yǎng)基中加入LPS，作用濃度為1μg/mL，分別于0h，8h收集上清液，ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β水平變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以 ±s 表示，進(jìn)行單因素方差分析。P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選KCs純度

密度梯度分離后的細(xì)胞經(jīng)7-AAD染色排除死細(xì)胞后，CD45+CD11b+F4/80+占CD45+細(xì)胞比例為58.4±3.6%，F(xiàn)ACS分選后比例提升為96.1±1.8%，兩者比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。圖1A、圖1B為分選前后CD45+CD11b+F4/80+各檢測(cè)門的單次檢測(cè)結(jié)果。

圖1 分選前后7-AAD-CD45+CD11b+F4/80+細(xì)胞純度對(duì)比A,B.分選前后流式結(jié)果圖; C.分選前后KCs純度百分比﹡P<0.05

2.2 分選后KC數(shù)量和存活率

平均每只小鼠分選獲得KCs細(xì)胞數(shù)為1.86±0.29×106/小鼠，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示分選后細(xì)胞存活率為96.5±2.1%，細(xì)胞形態(tài)良好。

2.3 分選后KC吞噬功能

與FITC熒光微球共孵育2h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)84.7±3.6%的KCs呈現(xiàn)出了吞噬熒光微球的情況，如圖2所示。

2.4 KCs表面標(biāo)志物的檢測(cè)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常小鼠肝臟KCs結(jié)果顯示，分選后的CD11b+F4/80+細(xì)胞中，CD86的表達(dá)為92.3±1.6%，CD206為2.1±0.8%，說(shuō)明分選后所得為CD86+CD206-細(xì)胞群，圖3所示。

圖2 分選后KCs吞噬熒光微球情況A.正常KCs；B.與熒光微球共培養(yǎng)2 h后的KCs

圖3 A,B顯示KCs分選后 CD86，CD206表達(dá)情況﹡﹡P<0.01

2.5 KCs TNF-α，IL-1β表達(dá)情況

LPS刺激8h后，KCs被激活，釋放炎性因子，細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β均高于刺激前(P <0.001)，見(jiàn)表1。

表1 LPS刺激后KCs炎性因子表達(dá)水平(x±s，pg/mL，n=3)

3 結(jié)論

目前對(duì)于KCs的分離純化除流式細(xì)胞分選外，密度梯度離心結(jié)合貼壁法或免疫磁珠分選法也是分離KCs分離純化法，可純化單一成分的KCs[10]或同時(shí)分離肝臟純化星狀細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和KCs[11,12]。相對(duì)于流式分選，貼壁法或磁珠分選法的優(yōu)勢(shì)在于細(xì)胞不受液流壓力和電荷刺激的影響，有利于維持細(xì)胞活性和狀態(tài)，缺點(diǎn)在于無(wú)法精確定位到某一特定亞群細(xì)胞的分選。流式細(xì)胞儀配有多激光多檢測(cè)通路，能夠多參數(shù)識(shí)別目的細(xì)胞，也可基于標(biāo)記物的表達(dá)水平進(jìn)行分選，分選過(guò)程中需要根據(jù)細(xì)胞的大小及對(duì)液流壓力的耐受能力選擇合適的噴嘴。對(duì)于FACSAriaⅢ型流式細(xì)胞儀分選KCs，選擇85μm噴嘴，控制上樣速度為8000～10000evts/s，是較適宜的分選條件，得到的KCs細(xì)胞數(shù)量和活力俱佳。上樣速度過(guò)高會(huì)使得分選回收率下降，造成部分陽(yáng)性細(xì)胞被丟棄，分選速度過(guò)低會(huì)延長(zhǎng)分選時(shí)間，不利于維持細(xì)胞活性。在流式細(xì)胞儀分選設(shè)置上，首先要注意調(diào)節(jié)穩(wěn)定的液流參數(shù)，液流的穩(wěn)定是保證分選準(zhǔn)確進(jìn)行的基礎(chǔ)，分選過(guò)程中開(kāi)啟液流“sweet spot”模式，一旦液流不穩(wěn)定時(shí)分選能夠自動(dòng)中止，防止液滴飛濺影響收集管中細(xì)胞的純度。此外，液滴延遲的調(diào)節(jié)是十分重要，可自動(dòng)結(jié)合手動(dòng)重復(fù)調(diào)節(jié)確定正確的Drop delay數(shù)值，一旦液流參數(shù)發(fā)生變化，需要重新校準(zhǔn)Drop delay。

在制備肝臟單細(xì)胞懸液過(guò)程需要膠原酶的消化，灌注溫度、膠原酶溶液濃度和肝臟灌注膠原酶總劑量對(duì)KCs F4/80抗原表達(dá)存在影響[13]。消化后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)密度梯度離心，可以去除大部分的碎片和肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞，但是處理過(guò)程中不可避免會(huì)產(chǎn)生死細(xì)胞，因此在流式染色方案中需要加入識(shí)別細(xì)胞死活的染料，本實(shí)驗(yàn)中采取的是核酸染料7-AAD，利用561nm激光激發(fā)可良好地排除死細(xì)胞染色，有利于分選后細(xì)胞的純度。

KCs在不同的環(huán)境下具有不同的表型，其中M1 和M2b 型巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)CD86，而M2a 和M2c 型巨噬細(xì)胞表達(dá)CD206 /CD163[14]，CD86是T淋巴細(xì)胞活化抗原，通過(guò)結(jié)合CD28或CTLA-4參與共同刺激信號(hào)傳遞，對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖必不可少，CD206是一種甘露糖受體，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬抗原，啟動(dòng)免疫反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為正常小鼠，肝內(nèi)KCs分選后顯示為CD86+CD206-細(xì)胞。

KCs是機(jī)體防御的主要效應(yīng)細(xì)胞，主要功能是內(nèi)吞，抗原提呈及分泌生物活性物質(zhì)，為從功能學(xué)角度鑒定KCs，采取了吞噬實(shí)驗(yàn)和LPS刺激實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，(84.7±3.6)%的細(xì)胞吞噬了熒光微球，并且經(jīng)LPS刺激后TNF-α、IL-1β分泌顯著提高，提示KCs分選后細(xì)胞功能良好。

本實(shí)驗(yàn)所得的細(xì)胞為高純度的KCs細(xì)胞，由于抗體特異性，分選后細(xì)胞幾乎不存在內(nèi)皮細(xì)胞和星型細(xì)胞混雜的情況，因此分選后接種培養(yǎng)，1 h后細(xì)胞基本貼壁，呈圓形，培養(yǎng)12h后細(xì)胞呈多邊形，呈現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，為后續(xù)與KCs相關(guān)的多種實(shí)驗(yàn)研究奠定了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。