劉芳遠(yuǎn)，蘇麗婭

0 引言

作為調(diào)控表觀遺傳機(jī)制的重要成員之一，翻譯后修飾（protein translational modification,PTM）在多種生物學(xué)過程中都發(fā)揮了重要的作用，包括DNA復(fù)制[1]、細(xì)胞分化[2]、胚胎發(fā)育[3]和疾病發(fā)生[4-5]等。隨著質(zhì)譜檢測技術(shù)的升級和發(fā)展，越來越多的PTM得以鑒定，其中包括了一系列的短鏈賴氨酸?；揎棧缍□；揎梉6]、丙?；揎梉6]、琥珀?；揎梉7]、丙二?；揎梉7]、巴豆酰化修飾[8]和苯甲?；揎梉9]等。這些PTM能夠通過影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和生物活性。

2011年Tan等通過一種基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在組蛋白中的賴氨酸殘基中首次發(fā)現(xiàn)并鑒定了巴豆?；揎棧瑫r證實(shí)了巴豆?；揎椖軌蛲ㄟ^調(diào)控染色體活性影響精子的發(fā)生過程[8]。在接下來的研究中，研究人員在一些非組蛋白上也發(fā)現(xiàn)了大量巴豆?；揎椢稽c(diǎn)，這些發(fā)生修飾的非組蛋白參與了多種生物學(xué)過程的調(diào)控[10]。隨著研究的不斷深入，巴豆?；揎椧驯蛔C實(shí)在人類疾病中發(fā)揮了重要的作用，比如急性腎損傷[11]、抑郁癥[12]、HIV感染[13]和惡性腫瘤[14]等。本文將對巴豆?；揎椩趷盒阅[瘤領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并討論巴豆?；揎椩趷盒阅[瘤中的研究前景。

1 巴豆?；揎椀陌l(fā)現(xiàn)與功能

隨著人們對甲基化、磷酸化、糖基化、乙?；妊芯康牟粩嗌钊?，通過高精度的檢測技術(shù)鑒定出了越來越多的新型翻譯后修飾。2011年，Tan等通過高分辨率質(zhì)譜技術(shù)在組蛋白的28個賴氨酸殘基中，首次證明了巴豆酰化修飾的存在。與乙?；揎棽煌投辊；艘粋€獨(dú)特的、四碳長度的π-鍵，從而產(chǎn)生了獨(dú)特的剛性平面構(gòu)象，導(dǎo)致了其在蛋白活性調(diào)控方面具有與乙?；揎棽煌墓δ芴卣鱗8]，見圖1A～B。此外，在人類HeLa細(xì)胞、小鼠、酵母菌、果蠅和線蟲等不同類型的真核生物細(xì)胞中，通過使用巴豆?；揎椃嚎贵w進(jìn)行檢測后，均可以在組蛋白上鑒定到發(fā)生修飾的位點(diǎn)。除了組蛋白，在許多非組蛋白上同樣存在大量的巴豆?；揎棧琗u等在1 024個非組蛋白上鑒定了2 696個賴氨酸巴豆?；揎椢稽c(diǎn)[10]，Yu等則使用SILAC標(biāo)記定量蛋白質(zhì)檢測技術(shù)在3 734個蛋白上鑒定到了14 311個巴豆?；揎椢稽c(diǎn)[15]。這些非組蛋白中修飾位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，證實(shí)了巴豆酰化修飾能夠通過不同途徑在生物體內(nèi)參與調(diào)控，表明其在生物學(xué)過程調(diào)控方面存在潛在的研究價值。

圖1 巴豆?；揎椀幕瘜W(xué)分子式(A)、構(gòu)象(B)和調(diào)節(jié)因子(C)Figure 1 Chemical formula(A),conformation(B),and regulatory factor of crotonylation(C)

由于修飾位點(diǎn)上的差異，巴豆?；揎椫饕越M蛋白巴豆酰化修飾和非組蛋白巴豆?；揎梼煞N形式發(fā)揮作用。在組蛋白中，巴豆?；揎棻蛔C實(shí)與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、精子活性、干細(xì)胞分化、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期等生物學(xué)過程密切相關(guān)。在Tan等的報道中，組蛋白巴豆?；揎椄叨确植加谛∈缶蛹?xì)胞中性染色體上活性基因的啟動子區(qū)域和增強(qiáng)子區(qū)域，提示巴豆?；揎椏赡苊芮袇⑴c了雄性生殖細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄活性以及性染色體活性的調(diào)控[8]。Fang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cell,mESC）中，由組蛋白脫乙酰酶1（histone deacetylase 1,Hdac1）介導(dǎo)的組蛋白巴豆酰化修飾可以影響核心多能性調(diào)控因子基因Sox2、Oct4和Nanog的表達(dá)，并調(diào)控胚層譜系基因的表達(dá)，促進(jìn)mESC分化。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，在組蛋白H4K77和H4K91上的巴豆?；揎椗c人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell,hESC）向內(nèi)胚層方向分化密切相關(guān)，使用巴豆酸鹽對hESC進(jìn)行誘導(dǎo)處理后，多能性基因Oct4和Sox2的表達(dá)明顯受到抑制，內(nèi)胚層標(biāo)記基因Cxcr4、Sox17和Gata6的表達(dá)顯著上調(diào)[16]。DNA損傷和修復(fù)是近年來研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。已有的研究結(jié)果表明，巴豆?；揎椗cDNA損傷機(jī)制存在密切的聯(lián)系。Abu-Zhayia等經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，通過電離輻射、紫外輻射或使用依托泊苷對人骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行處理后，組蛋白H3K9上的巴豆?；揎椝匠霈F(xiàn)短暫下降，進(jìn)一步使用HDAC抑制劑曲古抑素A（trichostatin A,TSA）對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)后，H3K9上的巴豆酰化修飾水平會迅速回升[17]。在最近的一項研究中，Abu-Zhayia等又發(fā)現(xiàn)DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)附近的組蛋白賴氨酸巴豆酰化修飾水平顯著降低，通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗和目的基因敲除進(jìn)行鑒定，染色質(zhì)域Y蛋白1（chromodomain Y-like,CDYL1）在DNA雙鏈斷裂過程中，會募集到斷裂位點(diǎn)并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄沉默，同時發(fā)揮巴豆酰輔酶A水合酶活性，抑制H3K9的巴豆?；揎椝?，但是CDYL1在斷裂后同源重組修復(fù)中卻是非必需的[18]。

在非組蛋白中，巴豆?；揎椡瑯涌梢杂绊懙鞍踪|(zhì)的活性和定位，引起生物學(xué)功能發(fā)生變化。Liao等通過研究證明巴豆酸能夠使p53蛋白中的絲氨酸46發(fā)生修飾，在不影響mRNA水平的條件下，抑制p53蛋白的活性，進(jìn)而增強(qiáng)了細(xì)胞中p53依賴性的糖酵解，提高了腫瘤細(xì)胞在DNA損傷或代謝環(huán)境下的抵抗能力[19]。Wei等研究證實(shí)，使用巴豆酸鹽或TSA處理細(xì)胞后，原本位于異染色質(zhì)的HP1α蛋白出現(xiàn)在了核質(zhì)上，蛋白質(zhì)互作實(shí)驗結(jié)果表明發(fā)生巴豆酰化修飾的HP1α蛋白與H3K9me3殘基的結(jié)合效率顯著下降，這可能是引起HP1α蛋白定位發(fā)生變化的原因之一[20]。此外，Xu等大規(guī)模的巴豆?；揎椊M學(xué)分析結(jié)果表明，發(fā)生修飾的非組蛋白廣泛參與了RNA剪接、蛋白質(zhì)合成、DNA損傷和修復(fù)、細(xì)胞內(nèi)吞以及細(xì)胞間連接等多種生物學(xué)過程[10]。

2 真核生物體內(nèi)巴豆?；揎椀恼{(diào)控

與乙酰化、琥珀酰化、丙二?；鹊鞍踪|(zhì)賴氨酸?；揎楊愃疲婧松矬w內(nèi)的巴豆?；揎椧部梢酝ㄟ^酶促反應(yīng)或非酶促反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)。巴豆酰輔酶A被認(rèn)為是發(fā)生巴豆?；揎椀墓w，其短鏈脂肪酸合成來源于巴豆酸鹽。改變細(xì)胞內(nèi)巴豆酸鹽的濃度，或者調(diào)節(jié)巴豆酰輔酶A的酶都會影響巴豆酰輔酶A的濃度，從而影響巴豆?；揎椝健abari等發(fā)現(xiàn)加入外源性巴豆酸鹽后，會引起細(xì)胞內(nèi)巴豆酰輔酶A的豐度顯著上升，同時組蛋白和非組蛋白上的巴豆酰化修飾水平也顯著上調(diào)，證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)巴豆酰化修飾水平與巴豆酰輔酶A的密切聯(lián)系[21]。酰基輔酶A合成酶短鏈家族成員2（acyl-CoA synthetase short-chain family member 2,ACSS2）能夠?qū)⒓?xì)胞代謝活動產(chǎn)生的巴豆酸轉(zhuǎn)化為巴豆酰輔酶A，當(dāng)ACSS2被敲除后，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)巴豆酰輔酶A豐度和組蛋白巴豆?；揎椝浇档?，表明細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的巴豆酸是巴豆酰輔酶A合成的內(nèi)源性來源[13,21]。Fang等研究結(jié)果表明，酰基輔酶 A 脫氫酶短鏈（acyl Coenzyme A dehydrogenase short-chain,ACADS）和?；o酶A氧化酶（acyl Coenzyme A Oxidase,ACOX3）在mESC分化過程中也會影響巴豆酰輔酶A的產(chǎn)生[16]。作為一種巴豆酰輔酶A水合酶，CDYL1能夠?qū)投辊］o酶A轉(zhuǎn)化為β-羥基丁酰輔酶A，從而完成對H3K9巴豆?；揎椀囊种谱饔肹22]。這一發(fā)現(xiàn)證明巴豆酰輔酶A在生物體內(nèi)具有促進(jìn)和調(diào)節(jié)巴豆酰化修飾的作用，但是針對巴豆酰輔酶A的具體調(diào)控機(jī)制，仍需進(jìn)一步的研究。

除了巴豆酰輔酶A外，最近研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)巴豆?；揎椪{(diào)控過程中，存在功能不同的調(diào)節(jié)蛋白使修飾過程處于一種動態(tài)的平衡，其中包括能夠?qū)投辊；鶊F(tuán)添加到底物蛋白上的巴豆酰轉(zhuǎn)移酶（也稱閱讀器，writer），能去除蛋白上巴豆酰基團(tuán)的去巴豆?；福ㄒ卜Q擦除器，eraser），以及能夠識別蛋白上發(fā)生巴豆?；揎椢稽c(diǎn)的巴豆?；R別蛋白（也稱識別器，Cr reader），見圖1C。Writer能夠催化巴豆?；揎椀陌l(fā)生，Sabari等首先報道了組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300同時具有催化組蛋白巴豆酰化修飾的作用[21]；另一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶 KAT8（MOF）也被證明具有writer的活性，能夠催化組蛋白 H3K4、H3K9、H3K18、H3K23、H4K8和H4K12 上的巴豆?；揎梉23]；此外，Kollenstart等發(fā)現(xiàn)Gcn5和Esa1在出芽酵母中能形成Gcn5-Ada2-Ada3（ADA）和Esa1-Yng2-Epl1（Piccolo NuA4）兩種復(fù)合體，分別催化組蛋白H3和H5的N末端的巴豆?；揎梉24]。Eraser能夠去除巴豆?；墓矁r修飾，與writer共同調(diào)控巴豆?；揎椀膭討B(tài)平衡，目前已經(jīng)被報道的eraser包括HDAC家族蛋白（HDAC1、HDAC2、HDAC3）[25]、Sirtuins家族蛋白（SIRT1、SIRT2和SIRT3）[26]，在mESC中，F(xiàn)ang等敲減HDAC1和HDAC2后細(xì)胞內(nèi)整體組蛋白巴豆?；教岣?，去巴豆酰化酶活性大大降低，提示HDAC1和HDAC2可能發(fā)揮了eraser的功能[16]。Reader具有一些特定結(jié)構(gòu)域，能夠識別巴豆?；男揎椢稽c(diǎn)，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。YEATS、Bromodomain和double-PHD（DPF）是識別?；揎椀娜惤?jīng)典結(jié)構(gòu)域，在此基礎(chǔ)上，Andrews首先確認(rèn)了含有YEATS結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄起始因子TFIID14（Taf14）是巴豆?；揎椀膔eader之一[27]。其他幾種含有YEATS 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，包括AF-9同源物（Yaf9）、ENL、AF-9，以及含有DPF結(jié)構(gòu)域的 DPF2也被證實(shí)能夠識別巴豆?；揎梉28-29]。

3 巴豆酰化與惡性腫瘤

作為一種新發(fā)現(xiàn)的翻譯后修飾，巴豆?；呀?jīng)被證實(shí)與多種人類疾病有關(guān)。在惡性腫瘤中，研究人員發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控巴豆?；揎椀幕蛟诙喾N惡性腫瘤組織中均有顯著性的表達(dá)差異，見圖2，這表明巴豆?；揎椩趷盒阅[瘤中具有潛在的影響。

圖2 泛癌中巴豆酰化修飾調(diào)控因子的mRNA表達(dá)情況Figure 2 mRNA expression of regulatory factors of crotonylation in pan-cancer

3.1 肝細(xì)胞肝癌

作為全球死亡率第三的癌癥類型，肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的惡化與DNA甲基化和翻譯后修飾等表觀遺傳調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)。為了探討巴豆?；揎椩贖CC中的作用機(jī)制，Wan等通過敲除HDAC1和HDAC3，并使用TSA對Huh-7肝癌細(xì)胞系進(jìn)行處理，提高細(xì)胞中整體巴豆?；揎椝?，證實(shí)提高修飾水平可以抑制HCC細(xì)胞的增殖和侵襲能力，表明巴豆酰化能夠作為抑制因素抑制HCC的進(jìn)展[14]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)?；o酶A氧化酶 2（Acox2）的缺失可以通過下調(diào)幾種代謝酶和過氧化物酶的巴豆?；揎椝?，從而破壞代謝穩(wěn)態(tài)，最終誘發(fā)小鼠肝癌的發(fā)生[30]。盡管還沒有其他研究可以進(jìn)一步證明巴豆酰化能夠直接影響肝細(xì)胞癌，但是一些參與修飾調(diào)控的關(guān)鍵蛋白被證實(shí)在HCC的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。Cai等的研究中，p300被證實(shí)能夠通過促進(jìn)乙?；揎?，進(jìn)而調(diào)節(jié)糖酵解來影響HCC的進(jìn)展[31]。作為eraser之一的SIRT3，也被證實(shí)能夠降低HCC的抗藥性，從而提高索拉非尼的治療效果[32]?？紤]到p300等參與調(diào)控修飾的蛋白同時對乙?；揎椌哂姓{(diào)控作用，所以這些蛋白在HCC中的功能還需要進(jìn)一步研究來驗證。

3.2 結(jié)直腸癌

巴豆?；揎椩谌梭w內(nèi)小腸上皮組織中異常豐富，尤其在小腸和結(jié)腸的隱窩部分，這可能是由于人體腸道中的微生物群落對食物發(fā)酵降解后產(chǎn)生巴豆酸導(dǎo)致。在使用抗生素消耗小鼠腸道中的細(xì)菌群落后，腸腔內(nèi)和血清內(nèi)的巴豆酸會出現(xiàn)顯著性的下降，并導(dǎo)致結(jié)腸中HDAC2表達(dá)上調(diào)及組蛋白巴豆?；降慕档?。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在組蛋白H3K18的巴豆?；揎検悄c道中最豐富的巴豆酰化修飾類型，發(fā)生修飾的位點(diǎn)大多富集于癌癥相關(guān)的信號通路，提示巴豆酰化修飾的異常水平可能與結(jié)直腸癌有關(guān)[33]。在體外細(xì)胞實(shí)驗中，Liao等使用巴豆酸對結(jié)直腸癌細(xì)胞系進(jìn)行處理后，證實(shí)了巴豆酸能夠抑制p53活性，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[19]。Hou等的研究結(jié)果表明，在結(jié)直腸癌組織中ENO1的K420Q位點(diǎn)會發(fā)生高頻率的巴豆?；揎?，進(jìn)一步的研究表明ENO1的K420Q修飾與結(jié)直腸癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[34]。Huang等通過對p300敲除的結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞系進(jìn)行全局定量分析后，發(fā)現(xiàn)32個發(fā)生巴豆?；揎椀牡鞍着c癌基因相關(guān)，其中6種p300靶向修飾的蛋白均為癌基因編碼蛋白，這些發(fā)現(xiàn)證明p300及其調(diào)控的巴豆酰化修飾在結(jié)直腸癌中具有潛在的研究意義[35]。這些研究成果證明巴豆酰化修飾對結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展具有重要的調(diào)控意義，為研究人員進(jìn)一步開發(fā)靶向巴豆酰化修飾的治療藥物提供了基礎(chǔ)。

3.3 宮頸癌

巴豆?；瘜m頸癌的調(diào)控作用在最近的研究中也得到了的證實(shí)。在干擾p300的表達(dá)后，Han等通過研究發(fā)現(xiàn)，HNRNPA1蛋白的巴豆?；揎椇捅磉_(dá)水平均出現(xiàn)顯著下降，加入巴豆酸鹽后能夠恢復(fù)修飾水平并促進(jìn)HNRNPA1蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了Hela細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[36]。其他巴豆?；{(diào)控蛋白，SIRT1[37]、SIRT2[38]和SIRT3[39]均被證實(shí)在宮頸癌中具有調(diào)控作用，但尚未證實(shí)巴豆?；揎椩谶@些蛋白調(diào)控過程中的具體作用機(jī)制，因此需要更多的實(shí)驗驗證巴豆?；揎椩趯m頸癌中的調(diào)控機(jī)制。

3.4 前列腺癌

在前列腺癌中，Xu等的研究發(fā)現(xiàn)癌組織中的巴豆?；揭哂诎┡越M織，并且與前列腺癌的臨床分期相關(guān)。研究人員使用BRD4抑制劑I-BET762對腫瘤細(xì)胞系處理后，I-BET762能夠明顯抑制前列腺癌細(xì)胞系的增殖和遷移。當(dāng)加入巴豆酸鹽后，I-BET762對腫瘤細(xì)胞的抑制作用明顯減弱。通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，BRD4被抑制后，細(xì)胞內(nèi)p300的表達(dá)水平以及整體巴豆?；骄陆?，表明BRD4可能通過p300影響細(xì)胞內(nèi)的巴豆?；揎椝剑{(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，這一研究成果提示了巴豆?；軌蜃鳛榍傲邢侔┑臐撛谥委煱悬c(diǎn)[40]。研究人員使用I-BET762對細(xì)胞進(jìn)行處理時，HDAC家族的蛋白表達(dá)水平并未出現(xiàn)明顯的變化，表明在前列腺癌中巴豆?；⒎鞘峭ㄟ^HDAC影響修飾調(diào)控。

3.5 其他類型癌癥

巴豆?；揎椩谄渌麗盒阅[瘤中的作用還需要更廣泛、更深入的研究來探索。Gao等的研究結(jié)果表明，在急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞模型中，能夠檢測到組蛋白H4K5和H4K8上的巴豆酰化修飾水平發(fā)生了顯著變化，并且這一變化受脂肪酸合成和β-氧化作用的調(diào)節(jié)[41]。作為識別巴豆?；揎椀闹匾Y(jié)構(gòu)域之一，YEATS結(jié)構(gòu)域與多種惡性腫瘤的進(jìn)展有關(guān)[42-43]，目前已有多種靶向結(jié)合YEATS結(jié)構(gòu)域的抑制劑應(yīng)用在惡性腫瘤治療領(lǐng)域[44-45]，這為進(jìn)一步開發(fā)巴豆酰化修飾相關(guān)的腫瘤治療藥物提供了可能。

4 討論和展望

自2011年趙英明教授的團(tuán)隊首次證實(shí)巴豆?；揎棿嬖谝詠韀8]，越來越多的研究表明無論在發(fā)育生物學(xué)還是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，巴豆?；揎椂及l(fā)揮了重要的作用，參與調(diào)節(jié)了從基因表達(dá)到端粒功能維持的多種生物學(xué)功能。然而由于參與巴豆?；揎椀男揎椶D(zhuǎn)移酶、去修飾酶和修飾識別蛋白尚未完全明確，巴豆?；揎椩谏矬w內(nèi)調(diào)節(jié)生理功能的具體機(jī)制仍不清楚。此外，修飾位點(diǎn)的多樣性使巴豆?；粌H能夠發(fā)生在組蛋白上，在其他非組蛋白的賴氨酸殘基中也可以檢測到巴豆?；揎椀男盘?，修飾位點(diǎn)的隨機(jī)性和多樣性增加了研究人員理解巴豆?；揎椬饔脵C(jī)制的難度。令人振奮的是，隨著深度學(xué)習(xí)技術(shù)在蛋白質(zhì)修飾組學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展，不斷有新的預(yù)測工具被開發(fā)出來，能夠幫助尋找巴豆?；揎椢稽c(diǎn)[46-47]。

由于腸道菌群產(chǎn)生的巴豆酸在人體消化系統(tǒng)中廣泛存在，巴豆?；揎椩谙滥[瘤微環(huán)境和腫瘤細(xì)胞中的影響受到越來越多的關(guān)注[33]。消化道內(nèi)高濃度的巴豆酸可以通過巴豆?；揎椪{(diào)控轉(zhuǎn)錄水平和蛋白活性，從而影響惡性腫瘤的進(jìn)展已經(jīng)得到證實(shí)，這表明針對巴豆酸和巴豆?；揎楅_發(fā)腫瘤治療藥物也成為了一種可能。不僅如此，隨著高通量檢測技術(shù)的發(fā)展，相信越來越多的巴豆酰化修飾調(diào)節(jié)酶會被鑒定出來，巴豆?；揎椩诜窍滥[瘤中的作用機(jī)制也將被揭示。因此，接下來的研究應(yīng)當(dāng)更加集中地探索巴豆酰化修飾的調(diào)節(jié)因子，幫助我們?nèi)嫦到y(tǒng)地認(rèn)識巴豆?；趷盒阅[瘤以及其他疾病中的發(fā)生和作用機(jī)制，為開發(fā)新的腫瘤靶向治療藥物提供理論基礎(chǔ)。