王雷，余德濤，邢禎全

(三亞市人民醫(yī)院 脊柱關(guān)節(jié)外科，三亞 572000)

骨關(guān)節(jié)炎是臨床常見的一種關(guān)節(jié)軟骨退行性病變，主要癥狀為關(guān)節(jié)畸形、關(guān)節(jié)疼痛等，常發(fā)生于老年人群。研究發(fā)現(xiàn)，炎性因子分泌量增加可影響滑膜細(xì)胞及軟骨細(xì)胞釋放其他介質(zhì)而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡，軟骨細(xì)胞增殖、凋亡異常可促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[1-4]。依托考昔具有消炎鎮(zhèn)痛的功效，可治療骨關(guān)節(jié)炎[5]。但關(guān)于依托考昔治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制尚未完全闡明?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1，SDF-1)/CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)信號(hào)通路在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路或許能作為治療骨關(guān)節(jié)炎的新方向[6]。但依托考昔是否可通過調(diào)控SDF-1/CXCR4信號(hào)通路而影響骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生尚未闡明。因此，本研究主要探討依托考昔對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡和炎性因子表達(dá)的影響及其對(duì)SDF-1/CXCR4信號(hào)通路的調(diào)控作用，以期為研究依托考昔治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 研究對(duì)象 選取2018年1—12月于三亞市人民醫(yī)院進(jìn)行全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的骨關(guān)節(jié)炎患者12例為研究對(duì)象，其中男性8例、女性4例，年齡(56.35±6.35)歲，取出患者關(guān)節(jié)軟骨片置于含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)保存。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意。

1.1.2 試劑 依托考昔購(gòu)自湖北鴻鑫瑞宇精細(xì)化工有限公司；DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司；FBS購(gòu)自杭州仟諾生物科技有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自廣州達(dá)暉生物技術(shù)股份有限公司；Ⅱ型膠原酶購(gòu)自Sigma公司；MTT購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京群曉科苑生物技術(shù)有限公司；TNF-α、IL-1β檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；兔抗人未剪切的Caspase-3(pro-Caspase-3)、活化的Caspase-3(cleaved Caspase-3)抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng) 采用PBS洗滌骨關(guān)節(jié)軟骨組織，剪碎(體積1 cm3)，加入0.25%胰蛋白酶室溫消化30 min，棄胰蛋白酶消化液，加入0.2%Ⅱ型膠原酶室溫消化18 h，每隔8 h收集1次細(xì)胞，使用200目濾網(wǎng)過濾，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，在4 ℃條件下以111.9×g離心10 min，棄上清液，加入含有20%FBS的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，換液(每天3 次)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)使用0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞傳代，收集第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[7]。

1.2.2 藥物處理及試驗(yàn) 分組取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后加入DMEM培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104個(gè)/mL，并將其接種于96孔板(100 μL/孔)，分別加入濃度為12.5、25.0和50.0 ng/mL的依托考昔處理24 h[8]，分別記作依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.3 細(xì)胞增殖的MTT檢測(cè) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，按照“1.2.2”分組處理，加入MTT溶液20 μL培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜150 μL，室溫避光孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的光密度[D(490 nm)]值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(各試驗(yàn)組D值-空白對(duì)照組D值)/(正常對(duì)照組D值-空白對(duì)照組D值)×100%。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率的FACS檢測(cè) 收集各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌，在4 ℃條件下以111.9×g離心5 min，棄上清液，向細(xì)胞沉淀中加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，分別加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，充分混勻，室溫避光孵育20 min，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 TNF-α、IL-1β水平的ELISA檢測(cè) 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-1β的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.6SDF-1、CXCR4 mRNA表達(dá)水平的qRT-PCR檢測(cè) 收集各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞中的總RNA。應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成(表1)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算SDF-1、CXCR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.2.7 pro-Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的Western blotting檢測(cè) 收集各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，加入適量RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白。用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入pro-Caspase-3(1∶800)、cleaved Caspase-3(1∶800)與內(nèi)參GAPDH一抗稀釋液(1∶1 000)，在4 ℃條件下孵育24 h，用TBST洗滌，分別加入二抗稀釋液(1∶2 000)，滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯影，應(yīng)用ImageJ v 1.8.0軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 依托考昔對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖及凋亡的影響與對(duì)照組比較，依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，且依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組間細(xì)胞存活率及細(xì)胞凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、圖2和表2。

圖1 依托考昔對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡率的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與依托考昔低劑量組比較，#P<0.05；與依托考昔中劑量組比較，△P<0.05。圖2 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞活性的比較

表2 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞存活率及凋亡率的比較

2.2 依托考昔對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中Caspase-3的影響與對(duì)照組比較，依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組pro-Caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，cleaved Caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，且依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組pro-Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3、表3。

圖3 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)

表3 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)的比較

2.3 依托考昔對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中炎性因子表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組TNF-α、IL-1β的水平顯著降低(P<0.05)，且依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組TNF-α、IL-1β的水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與依托考昔低劑量組比較，#P<0.05；與依托考昔中劑量組比較，△P<0.05。圖4 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中炎性因子表達(dá)水平的比較

2.4 依托考昔對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞SDF-1/CXCR4的影響與對(duì)照組比較，依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組SDF-1、CXCR4 mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，且依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組SDF-1、CXCR4 mRNA的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4)。

表4 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中SDF-1、CXCR4 mRNA表達(dá)的比較

3 討論

近年來，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率逐年上升，已嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。既往研究顯示，天然藥物、非甾體類抗炎藥等可用于骨關(guān)節(jié)炎的治療，但部分抗炎藥會(huì)對(duì)人體消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等造成一定損害[9-10]。目前，關(guān)于依托考昔治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制尚未闡明，因而本研究主要探討依托考昔在骨關(guān)節(jié)炎治療過程中的作用機(jī)制。

依托考昔是一種臨床常用的高效抗炎藥物，具有抗炎、抗氧化等作用。研究發(fā)現(xiàn)，依托考昔治療關(guān)節(jié)炎具有副作用少、療效好等優(yōu)點(diǎn)[11-13]，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究分離培養(yǎng)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，使用不同濃度的依托考昔處理后，細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，且呈現(xiàn)劑量依賴性。這提示，依托考昔可抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，Caspase是細(xì)胞凋亡的主要通路，Caspase-3是細(xì)胞凋亡反應(yīng)中重要的調(diào)節(jié)因子，線粒體損傷后可促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)而激活Caspase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，用依托考昔處理后pro-Caspase-3蛋白水平顯著升高，cleaved Caspase-3蛋白水平顯著降低，且呈現(xiàn)劑量依賴性。這提示，依托考昔可能通過調(diào)控線粒體途徑抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡。軟骨細(xì)胞損傷后巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β等炎性因子，參與軟骨退變過程，TNF-α、IL-1β相互作用可加重滑膜炎癥及關(guān)節(jié)軟骨的退變程度，還可抑制軟骨細(xì)胞增殖[15]。本研究結(jié)果顯示，用依托考昔處理后TNF-α、IL-1β的水平顯著降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性。這提示，依托考昔可減輕骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的炎癥損傷。

SDF-1/CXCR4信號(hào)通路屬于炎癥反應(yīng)偶聯(lián)分子對(duì)，SDF-1可與其受體CXCR4相互作用參與骨關(guān)節(jié)炎等炎癥反應(yīng)的發(fā)生及發(fā)展過程，抑制SDF-1/CXCR4信號(hào)通路的活化可降低炎癥反應(yīng)[9，16-17]。本研究結(jié)果顯示，依托考昔可抑制SDF-1、CXCR4的表達(dá)，且隨著藥物使用劑量的增加其抑制作用顯著增強(qiáng)。這提示，依托考昔可能通過抑制SDF-1/CXCR4信號(hào)通路減輕骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的損傷。

綜上所述，依托考昔可能通過抑制SDF-1/CXCR4信號(hào)通路促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡及減少炎癥反應(yīng)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。