鄒思艷， 田 田， 吳敏芳， 文曉鵬

1. 貴州大學 生命科學學院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴陽 550025；2. 貴州大學 林學院，貴陽 550025

花紅(Malusasiatica)屬薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)落葉小喬木，既可以作為果實開發(fā)，也可以作為蘋果的良好砧木，同時也是貴州省重要的蘋果種質(zhì)資源[1]，但其繁殖效率較低．高效的離體再生體系對于苗木快繁具有重要意義[2]，也是開展遺傳轉(zhuǎn)化研究的前提[3]．外植體的選擇對于植物離體再生體系的建立至關(guān)重要，葉片是蘋果屬植物離體再生常用的外植體，此外，子葉、莖尖和下胚軸等均可通過組織培養(yǎng)誘導出完整植株[4]．花紅的離體再生研究較早，蔣啟林等[5]利用花紅幼胚成功誘導成苗并建立快繁體系，萬瑩[6]和陳鑫[7]以來安花紅莖段為外植體建立了快繁體系，但易受胚發(fā)育程度和數(shù)量的限制，也會受莖段木質(zhì)化程度所影響，致其繁殖系數(shù)相對較低．由于葉片和子葉不受材料發(fā)育階段及數(shù)量的限制，本研究以花紅葉片和子葉為外植體誘導再生，探究不同因子對其直接再生不定芽頻率的影響，以期建立高效的花紅離體再生體系，為花紅轉(zhuǎn)基因工作奠定理論基礎(chǔ)，也為花紅新品種培育和砧木遺傳改良提供新途徑．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以貴州省黔西縣本地品種花紅的幼胚、子葉(成熟胚)及組培苗葉片為材料．

1.2 研究方法

1.2.1 外植體的獲得

幼胚：取花后40 d的花紅幼果，自來水沖洗1 h，于超凈工作臺上用75%的酒精滅菌30 s，無菌水洗2～3次，再用0.1%的升汞溶液加2滴吐溫20滅菌10 min，無菌水清洗3～4次，吸水紙吸干水分，切除果肉，取出幼胚備用．

子葉：選取成熟飽滿、顆粒均一的花紅種子，用無菌水浸泡10 min后，于超凈工作臺上用75%的酒精消毒30 s，無菌水洗2～3次，再用10%的次氯酸鈉溶液處理10 min，無菌水洗3～4次，吸水紙吸干水分后，剝除種皮，取出兩片子葉，頂端胚芽切除，另一端切去1/3備用．

葉片：取本實驗室繼代保存的花紅組培苗上部幼嫩的葉片，將葉片邊緣和葉柄切除，用手術(shù)刀垂直主葉脈將背面(遠軸面)劃傷備用．

1.2.2 外植體類型對不定芽再生的影響試驗

取上述幼胚和成熟胚的子葉為外植體，正面朝上分別接種于以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、添加2.0 mg/L TDZ和0.1 mg/L NAA的不定芽誘導培養(yǎng)基中；葉片外植體背面朝上接種到葉片不定芽誘導培養(yǎng)基中(MS+3.0 mg/L TDZ+0.20 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA)．暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)，光照時間為12 h/d，培養(yǎng)溫度(25±1) ℃，光照強度 2 000～2 500 lx．每個處理接種20個，重復(fù)3次．

1.2.3 暗培養(yǎng)時間及子葉部位對不定芽再生的影響試驗

將上述成熟胚的子葉斜切近胚芽端，正切另一端，接種于再生培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L NAA)上，分別進行不同時間(0 d，7 d，14 d)的暗培養(yǎng)處理．每個處理接種20個，重復(fù)3次．

1.2.4 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對不定芽再生的影響試驗

為篩選誘導不定芽分化的最佳組合生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(Plant Growth Regulator，PGR)，將上述成熟胚的子葉分別接種于16個含有不同濃度的TDZ(1.0，2.0，3.0，4.0 mg/L)，NAA(0.05，0.10，0.20，0.40 mg/L)，IBA(0，0.05，0.10，0.20 mg/L)不定芽再生培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)50 d．每個處理接種20個子葉，重復(fù)3次．光下培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計各處理下不定芽的誘導率．

1.2.5 不定芽增殖培養(yǎng)

待子葉誘導出叢芽之后(50 d)，切除多余子葉，將叢芽分別轉(zhuǎn)入到含有0.05 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2周后，切取長勢一致的單株芽分別接種于9個不同濃度6-BA(1.0，2.0，4.0 mg/L)和NAA(0.1，0.2，0.3 mg/L)的增殖培養(yǎng)基中，每瓶接種4株，重復(fù)5次．光下培養(yǎng)40 d后，觀察記錄不定芽的生長情況，并統(tǒng)計其增殖系數(shù)．

1.2.6 生根培養(yǎng)

待不定芽生長至1.5～2.5 cm時，用解剖刀切取單株的苗接種于含有不同激素濃度的生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基采用 1/2 MS+ 20 mg/L蔗糖+6 mg/L瓊脂作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的IBA(0.5，1.0，2.0 mg/L)和NAA(0，0.1，0.2 mg/L)．每個處理接種4株增殖苗，重復(fù)5次，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計各處理的生根情況．

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均采用Excel軟件進行處理，采用SPSS 21.0 軟件進行Duncan檢驗及差異顯著性分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體類型對不定芽再生的影響

不同外植體對花紅離體再生有很大的影響．結(jié)果表明，花紅子葉與幼胚和葉片在再生培養(yǎng)基上的再生率有差異，幼胚和葉片均無不定芽形成，成熟胚的子葉培養(yǎng)于MS+2.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中，不定芽再生率為11.67%．

2.2 暗培養(yǎng)時間及子葉部位對不定芽再生的影響

前期暗培養(yǎng)對植物再生不定芽有一定的促進作用，暗培養(yǎng)7 d能夠顯著促進子葉再生不定芽．結(jié)果表明，子葉暗培養(yǎng)后變黃，且體積膨大至原來的2倍時，未經(jīng)暗培養(yǎng)的子葉無明顯變化(表1)．暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)13 d，子葉開始產(chǎn)生不定芽(圖1a)；暗培養(yǎng)0 d和暗培養(yǎng)14 d的子葉均無不定芽產(chǎn)生．

暗培養(yǎng)7 d后的子葉轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)，子葉迅速轉(zhuǎn)綠，近軸面近胚芽端切口處出現(xiàn)疑似不定芽雛形，接種20 d后開始出現(xiàn)不定芽，并陸續(xù)發(fā)育成小植株．50 d時不定芽再生率達到最高(圖1b)，子葉再生的不定芽大部分發(fā)生于近軸面近胚端切口處，再生率達36.7%，相較遠胚端增高約11倍(表1)，表現(xiàn)出明顯的極性效應(yīng)．

表1 培養(yǎng)時間及子葉部位對誘導再生不定芽的影響

2.3 PGR濃度對子葉再生不定芽的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑對花紅子葉再生不定芽有很大影響．結(jié)果表明，在添加了1.0 mg/L TDZ和0.05 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上，子葉誘導不定芽的再生率最高達38.9%，再生芽數(shù)最多，平均11.7個(表2)．

表2 PGR濃度對花紅子葉再生不定芽的影響

2.4 6-BA和NAA濃度對花紅不定芽增殖的影響

不同6-BA和NAA濃度配比對花紅不定芽的增殖系數(shù)及增殖效果影響較大(表3)，培養(yǎng)基MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的不定芽增殖系數(shù)最高，為7.73，但芽細弱，長勢差，呈玻璃化狀．從芽的長勢及健康程度來看，培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA中不定芽生長狀態(tài)最好，伸長明顯(圖1c)，增殖系數(shù)較高，為最佳增殖培養(yǎng)基．

表3 6-BA和NAA濃度對不定芽增殖的影響

2.5 生根培養(yǎng)

增殖后的花紅不定芽在含有不同濃度IBA(0.5，1.0，2.0 mg/L)和不同濃度NAA(0，0.1，0.2 mg/L)的1/2MS生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，一段時間后不同濃度組合的生根率有明顯差異．結(jié)果表明，1/2 MS+1.0 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA生根培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)生根率(60%)最高，且根系粗壯，須根多(圖1f)．

表4 IBA和NAA濃度對花紅不定芽生根的影響

圖1 花紅子葉誘導不定芽再生過程

3 討 論

以往對花紅組織培養(yǎng)的研究中，多以幼胚和帶芽莖段為外植體建立快繁體系，但是繁殖系數(shù)受胚發(fā)育程度和莖段木質(zhì)化影響較大[5-7]．二球懸鈴木再生研究表明，子葉再生體系較葉片再生體系受基因型影響較小、組織肥厚不易褐化、再生效率更加穩(wěn)定[8]，并且子葉具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，作為外植體被廣泛應(yīng)用于不定芽再生體系中[9-10]．幼胚發(fā)育至接近子葉期才有不定芽發(fā)生的能力[11]，且成熟胚子葉作為外植體再生不定芽誘導率較高，再生能力較強[12]．本試驗研究了花紅的幼胚、成熟胚的子葉和葉片離體再生不定芽的能力，結(jié)果僅有花紅成熟胚的子葉作為外植體，成功建立了花紅的離體再生體系．楊海峰[13]認為全光照是獲得高效再生的關(guān)鍵技術(shù)之一，但也有研究指出，前期暗培養(yǎng)有利于不定芽的再生[14-16]．本研究的結(jié)果表明，暗培養(yǎng)7 d比直接光照培養(yǎng)更有利于花紅子葉再生不定芽，且近胚端再生率顯著高于遠胚端，導致該結(jié)果的主要因素可能是與子葉近胚端到遠胚端IAA(吲哚乙酸)信號逐漸減弱、生長素差異分布有關(guān)[17]．

生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和含量對植物離體再生植株的影響極大[18]，其對植物器官直接發(fā)生途徑的影響首先表現(xiàn)在對不定芽的誘導上[19]．前人的研究結(jié)果[20-21]表明，TDZ較6-BA更有利于離體不定芽的再生，TDZ能顯著促進較難誘導分化的植物的離體培養(yǎng)，能有效改善其誘導率[22-23]．有研究證實，適宜濃度的TDZ是誘導西瓜外植體分化的關(guān)鍵，低濃度NAA也有利于西瓜外植體的分化[24]．TDZ與NAA的適宜濃度比能促進花紅不定芽的分化，但高濃度TDZ會明顯抑制不定芽的再生，且誘導出的不定芽失綠，生長緩慢，后期褐化死亡．

當NAA濃度高于1.0 mg/L時會加重組培苗玻璃化效應(yīng)，而低濃度的6-BA能有效降低玻璃化效應(yīng)[25]．在花紅增殖培養(yǎng)過程中，高濃度6-BA和NAA的組合使得組培苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，葉片變脆，叢芽難以分離成單株等問題．宋常美等[26]的研究表明，壯苗培養(yǎng)可適當加入赤霉素(GA)，GA不僅能促進增殖，還能促進生根，縮短了壯苗的時間．萬瑩[6]的研究由于激素用量、基本培養(yǎng)基不適及品種性能等原因，導致在來安花紅離體快繁的研究中未獲得生根試管苗．本試驗綜合“錫金海棠”和“青砧一號”的生根培養(yǎng)基[27]，通過IBA和NAA適宜的濃度配比成功獲得了花紅生根苗．

綜上所述，本研究以花紅成熟子葉作為外植體，接種于含有1.0 mg/L TDZ和0.05 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中，可高效誘導出花紅不定芽．經(jīng)生根培養(yǎng)后可獲得完整再生植株，實現(xiàn)花紅再生體系的優(yōu)化．再生體系的建立為進一步開展花紅的細胞工程及基因工程遺傳育種奠定了技術(shù)基礎(chǔ)．