丁 蕾，李晨楚，符彩珠，林 旭，戴 芃，Rajaofera Mamy Jayne Nelly*

（1.海南醫(yī)學(xué)院 第二臨床學(xué)院，海南 ?？?571100；2.海南醫(yī)學(xué)院 熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)院 熱帶生物醫(yī)學(xué)技術(shù)實驗室，海南 ?？?571100）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）是引起醫(yī)院感染的多重耐藥菌[1-3]，自首次分離出MRSA以來，其臨床檢出率逐年上升，MRSA能引起心內(nèi)膜炎、腦膜炎和敗血癥等危重的致死性疾病[2-5]，MRSA感染已被公認(rèn)為世界三大最難解決的感染性疾病之一。隨著抗生素的濫用，MRSA耐藥率不斷升高，唐克文等[6]研究表明，MRSA對克林霉素和紅霉素的耐藥率逐漸增高，因此，MRSA的多重耐藥性一直受到密切關(guān)注。雖然不斷有新的抗MRSA感染藥物被發(fā)現(xiàn)和研究，體外藥敏試驗也顯示出較好的抗MRSA活性，但其療效和安全性尚需驗證[7-8]，這使得人類需更加重視抗耐藥菌株的藥物開發(fā)研究。

微生物是藥物先導(dǎo)化合物最重要的來源[9]，有研究從廣西潿洲島礁棲珊瑚、海綿和海藻等樣品中分離獲得5種具有豐富代謝產(chǎn)物及抗MRSA活性的菌株[10]。還有研究篩選到一株對MRSA具有較強(qiáng)的抑制作用且穩(wěn)定性好的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）SC-2，并提取到對耐藥鮑曼不動桿菌、大腸桿菌、幽門螺旋桿菌等常見的致病菌具有抗菌活性的化合物[11]。這些抗菌活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)為本研究提供了理論依據(jù)。紅樹林因其特殊的生態(tài)環(huán)境、周期性的海水侵襲、河口有機(jī)質(zhì)的沉積和落葉的腐敗作用而富含有機(jī)質(zhì)和腐殖質(zhì)，蘊(yùn)含了豐富的微生物資源[12]。有研究從南海海桑根際土壤篩選出一株抗MRSA活性較強(qiáng)的真菌，并追蹤分離到具有顯著抗菌活性的天然產(chǎn)物嗜氮酮[13]。因此，本研究從紅樹林根部土壤中篩選出具有抗MRSA活性的菌株，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗及16S rDNA基因序列分析對其進(jìn)行鑒定，采用不同的培養(yǎng)基優(yōu)選抑菌物質(zhì)生成條件；以有機(jī)溶劑分離純化抑菌物質(zhì)物質(zhì)，采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析抑菌物質(zhì)化學(xué)成分，以期獲得抗MRSA活性物質(zhì)，為開發(fā)治療MRSA感染的藥物提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品和菌株

土壤樣品：海南省紅樹林根部土壤；指示菌株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）：本實驗室提供。

1.1.2 化學(xué)試劑

革蘭氏染色液試劑盒HB8278：青島高科技工業(yè)園海博生物有限公司；細(xì)菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒（D3350-01）、淀粉酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶、蛋白酶K（酶活均為1 mg/mL）：上海古朵生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加瓊脂16 g/L。

淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，可溶性淀粉10 g/L。

緩沖葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，葡萄糖5 g/L，NaCl 5 g/L。

尿素培養(yǎng)基：蛋白胨1 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖1 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，0.4%酚紅溶液3 mL，瓊脂20 g/L，20%尿素溶液100 mL。

克氏雙糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（g/L）：乳糖10 g/L，葡萄糖1 g/L，氯化鈉5 g/L，檸檬酸鐵銨0.5 g/L，硫代硫酸鈉0.5 g/L，瓊脂12 g/L，酚紅0.025 g/L。

營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：牛肉浸膏3g/L，酵母浸膏1 g/L，胰蛋白胨5 g/L，葡萄糖20 g/L。

水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，淀粉1.5 g/L，酪蛋白水解物17.5 g/L。

ZS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，牛肉膏5 g/L。

葡萄糖酵母牛肉膏（ager yeast dextrose，AYDA）培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，牛肉膏80 g/L，酵母粉5 g/L。

Landy培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，L-谷氨酸5 g/L，KH2PO41 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，酵母抽提物1 g/L，MnSO45mg/L，CuSO4·5H2O0.16mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.15mg/L，L-苯丙氨酸2 mg/L。

金氏培養(yǎng)基（Kings Medium B，KMB）：蛋白胨20 g/L，MgSO4·7H2O2.5g/L，K2HPO4·3H2O1.5g/L，甘油20g/L。

牛肉蛋白胨酵母（beef peptone yeast，BPY）培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸膏5 g/L，葡萄糖5 g/L，NaCl 5 g/L。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（trypcasein soy agar，TSA）：胰蛋白胨17 g/L，大豆蛋白胨3 g/L，NaCl 5g/L，K2HPO4·3H2O 2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L。

上述培養(yǎng)基滅菌條件均為121 ℃、20 min。

明膠培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液100 mL，明膠15 g/L。112.6 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

GI54DS型全自動高壓滅菌鍋：南京傲然生物科技有限公司；Microfuge 20R型高速離心機(jī)：美國Beckman Coulter Inc公司；HF-safe-1500LC（A2）型生物安全柜：上海力申科學(xué)儀器有限公司；JAN-26臺式高速冷凍離心機(jī)：美國BECKMAN COULTER公司；Core ML型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph Hei-VAP公司；ME204E型電子分析天平：METTLER TOLEDO集團(tuán)；TONE 96G型梯度聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國耶拿Biomentra公司；BSD-YX 2400型溫控回旋立式雙層搖床：上海博訊實業(yè)有限公司；JY04S-3E型凝膠成像分析系統(tǒng)：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Ni-U+DS-Ri2型正置熒光顯微鏡：日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 抗MRSA活性菌株的篩選

從平板挑取一環(huán)指示菌MRSA接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)18～24 h，采用平板傾注法[14]，將MRSA病原菌種子液接種至LB 固體培養(yǎng)基中，倒平板，晾干備用。

從海南省紅樹林根部土壤隨機(jī)取9份樣品，每份土樣分別取11 g與10 mL無菌水混合，37 ℃、180 r/min條件下振蕩15 min，靜置5 min后，吸取上層清液按10倍梯度稀釋法稀釋至10-2、10-3、10-4倍濃度，各取100 μL涂布于上述混有MRSA菌液的培養(yǎng)皿中，37 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察各土壤樣品菌株有無抑菌圈，測量并比較抑菌圈大小，以抑菌圈直徑大小評判抑菌活性強(qiáng)弱，篩選出抑菌圈最大即抗MRSA活性強(qiáng)的菌株。

1.3.2 篩選菌株鑒定

形態(tài)學(xué)觀察及生理生化反應(yīng)測定：參考東秀珠等[15]編著的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，觀察、分析菌落形態(tài)、生長特性，通過革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色和各生化試驗對菌株進(jìn)行檢測、鑒定，方法參考《微生物學(xué)實驗》[16]。

分子生物學(xué)鑒定：利用16S rDNA基因序列分析的方法對篩選菌株進(jìn)一步鑒定。以篩選菌株基因組DNA為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）擴(kuò)增16S rDNA。PCR擴(kuò)增體系：EXTaq酶0.25 μL，10×Buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）4 μL，MgCl24 μL，模板DNA 2 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，雙蒸水（ddH2O）32.75 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃5 min；94 ℃60 s；55 ℃60 s；72 ℃90 s；循環(huán)30次，延伸72 ℃10 min。PCR擴(kuò)增完成后通過1%瓊脂糖凝膠檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，將獲得的特異性DNA送往華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序，提交序列至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列號。將測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，使用Mega7.0建立發(fā)育樹獲得親緣遠(yuǎn)近關(guān)系。

1.3.3 篩選菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)培養(yǎng)基的優(yōu)選

配制LB、MH、NA、Landy、ZS、KMB、BPY、AYDA、YPD、TSA培養(yǎng)基，從平板挑取篩選抗MRSA活性菌株分別接種至裝液量為50 mL/250 mL的上述培養(yǎng)基中，每組設(shè)3個重復(fù)，37 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液于12 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm膜過濾，收集濾液備用。采用平板傾注法，將MRSA病原菌種子液接種至LB 固體培養(yǎng)基中，在上述平板上分別均勻打孔，孔徑為8 mm，每孔分別接入200 μL的上述各種備用濾液，每組設(shè)3個重復(fù)，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，以上述培養(yǎng)基作為相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株NEL-002后發(fā)酵液濾液為抑菌對照組，利用抑菌物質(zhì)不斷溶解經(jīng)瓊脂擴(kuò)散形成不同濃度梯度，在擴(kuò)散過程中濃度逐漸減少，直到抑菌物質(zhì)濃度與細(xì)菌對該種抑菌物質(zhì)的最高耐受濃度相同，此時抑菌物質(zhì)不再擴(kuò)散，即形成抑菌圈，以顯示其抑菌作用[17-18]，通過抑菌圈大小以判斷其是否具有抑菌能力，判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈≤7 mm為無抑菌作用，抑菌圈直徑＞7 mm為有抑菌作用，抑菌圈直徑7～10 mm為鈍敏，抑菌圈直徑11～20 mm為中敏，抑菌圈直徑＞20 mm為高敏。比較不同孔徑中濾液抗MRSA活性的敏感性差異，確定篩選抗MRSA活性菌株的最適發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3.4 抑菌物質(zhì)的分離純化

從平板挑取1環(huán)篩選抗MRSA活性菌株接種至裝液量為50 mL/250 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液于12 000 r/min 離心10 min，取上清液，分別用乙酸乙酯、石油醚、正丁醇對上清液進(jìn)行反復(fù)3次的萃取，分別將得到的有機(jī)相減壓蒸干，得到的沉淀1 mL加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）充分溶解，通過0.22 μm細(xì)菌過濾器除菌，收集濾液備用。采用平板傾注法，將MRSA病原菌種子液接種至LB 固體培養(yǎng)基中，倒平板，晾干備用，再在上述平板上分別均勻打孔，孔徑為8 mm，每孔分別接入200 μL的上述各種備用濾液，每組設(shè)3個重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)24 h，以乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、DMSO為對照組，測量抑菌圈大小，比較不同孔徑中濾液抗MRSA活性的差異，確定篩選抗MRSA活性菌株抑菌物質(zhì)的分離純化方法，并以此方法粗提發(fā)酵液，用二甲基亞砜充分溶解，作為樣液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 抑菌物質(zhì)的化學(xué)成分分析

抗MRSA活性菌株抑菌物質(zhì)GC-MS分析[19-20]。GC條件：DB25 交聯(lián)石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm），柱溫為40 ℃，進(jìn)樣溫度為250 ℃，柱壓為49.7 kPa，載氣為高純度氦氣（He），柱流量為1 mL/min，載氣流量3 mL/min，進(jìn)樣量0.5 μL，分流比20∶1。MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，傳輸線溫度250 ℃，掃描質(zhì)量范圍為20～500 amu。定性定量方法：將各組分的相對保留指數(shù)與文獻(xiàn)[21-22]中真實化合物的相對保留指數(shù)進(jìn)行比較，并與美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）98文獻(xiàn)數(shù)據(jù)中的相對保留指數(shù)進(jìn)行比較進(jìn)行定性，采用面積歸一法對各組分進(jìn)行定量。

1.3.6 抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性研究

熱穩(wěn)定性：將1.3.4中制備的抑菌物質(zhì)粗提液，在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃、121 ℃的不同溫度下處理20 min，對照組在37℃溫度下處理20 min，每處設(shè)置3個重復(fù)，過濾后用圓盤擴(kuò)散法[23]測定其抑菌活性，37 ℃避光恒溫培養(yǎng)48 h后測量抑菌圈直徑，以對照組（CK）的抑菌圈大小為活性100%，計算各溫度下的相對活性。

酸堿穩(wěn)定性：將1.3.4中制備的抑菌物質(zhì)粗提液，調(diào)節(jié)pH值至1～12，對照組為原液pH值，每處設(shè)置3個重復(fù)，過濾后采用圓盤擴(kuò)散法測定其抑菌活性，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后測量抑菌圈大小，以對照組（CK）的抑菌圈大小為活性100%，計算各pH組的相對活性。

蛋白酶穩(wěn)定性：將1.3.4中制備的抑菌物質(zhì)粗提液，分別加入淀粉酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶、蛋白酶K，酶的終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，對照組不加任何蛋白酶，每處設(shè)置3個重復(fù)，過濾后采用圓盤擴(kuò)散法測定其活性，37 ℃的恒溫培養(yǎng)48 h后測量抑菌圈大小。以對照組的抑菌圈大小為活性100%，計算各蛋白酶處理組的相對活性，通過對蛋白酶敏感性判斷抑菌物質(zhì)是否含有蛋白類化合物，其活性是否容易被蛋白酶破壞[24]。

1.3.7 最低抑菌濃和最低殺菌濃度測定

最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）測定：將1.3.4中制備的抑菌物質(zhì)粗提液，用LB液體培養(yǎng)基稀釋至質(zhì)量濃度為2 000 μg/mL，再依次稀釋為1 000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、15.62 μg/mL、7.81 μg/mL。采用96孔板法，設(shè)置3個重復(fù)，以含等量DMSO（5%）的LB液體培養(yǎng)基作對照，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h后，觀察并統(tǒng)計結(jié)果，陰性孔顯示清亮，陽性孔顯示混濁，MIC值為96孔板上橫排中未有混濁的最后一孔所對應(yīng)的濃度。

讀取MIC值結(jié)果后，分別移取各組藥物陰性孔液體50 μL，涂布于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h；讀取菌落個數(shù)，分別計算對應(yīng)孔內(nèi)細(xì)菌數(shù)量，能夠殺死＞99.9%初始細(xì)菌含量（＜100 CFU/mL）的最低藥物濃度為MBC。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗MRSA活性菌株的篩選

37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)5 d后，結(jié)果見圖1。由圖1可知，篩選出5株抗MRSA活性菌株，得到抗MRSA生長能力最強(qiáng)的菌株，編號NEL-002，抑菌圈直徑約為（28.77±0.42）mm，其他4株抗MRSA活性菌株的抑菌圈直徑＜10 mm，抑菌活性較弱，不作為后續(xù)研究對象。

圖1 菌株NEL-002抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性Fig.1 Activity of methicillin-resistant Staphylococcus aureus of strain NEL-002

2.2 菌株NEL-002的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株NEL-002在LB固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)18 h，菌株NEL-002的形態(tài)特征見圖2。

由圖2A可知，菌落生長茂盛，似圓形、乳白色，不透明，邊緣形態(tài)不規(guī)則，表面粗糙、較干燥。由圖2B可知，經(jīng)革蘭染色，在顯微鏡下觀察到菌體呈紫色，為革蘭陽性菌。由圖2C可知，經(jīng)鞭毛染色，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌體端生鞭毛1根。由圖2D可知，經(jīng)芽孢染色，在顯微鏡下觀察到紅色的菌體和綠色的芽孢。

圖2 菌株NEL-002的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strain NEL-002

2.2.2 菌株NEL-002生理生化特征

菌株NEL-002其生理生化特征結(jié)果見表1。由表1可知，V-P試驗陽性、M.R.試驗陰性說明該菌株分解利用葡萄糖產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，過氧化氫酶試驗陽性符合革蘭陽性菌特征，淀粉酶試驗、尿素酶試驗陽性，說明該菌株不產(chǎn)生淀粉酶和尿素酶，不能分解利用淀粉和尿素，明膠液化試驗、硫化氫試驗陰性，說明該菌株不能分解氨基酸。

表1 菌株NEL-002的部分生理生化特征Table 1 Some physiological and biochemical characteristics of strain NEL-002

2.2.3 菌株NEL-002分子生物學(xué)鑒定

菌株NEL-002的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖3所示，擴(kuò)增條帶在1 000～2 000 bp之間，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可回收擴(kuò)增產(chǎn)物，連接轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，進(jìn)行測序和序列分析。經(jīng)基因測序，提交序列數(shù)據(jù)至Genbank，序列號為MN640828。使用Mega 7.0建立發(fā)育樹結(jié)果如圖4所示，綜合NCBI的BLAST搜索，細(xì)菌的16S rDNA 進(jìn)行比對，結(jié)果顯示菌株NEL-002與萎縮芽孢桿菌同源性達(dá)到99%，菌株NEL-002被鑒定為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophiae）。

圖3 菌株NEL-002基于16S rDNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 PCR amplification product electrophoresis results of strain NEL-002 based on 16S rDNA sequence

圖4 菌株NEL-002基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain NEL-002 based on 16S rDNA sequences

2.3 菌株NEL-002活性物質(zhì)研究

2.3.1 最適發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

用不同培養(yǎng)基對菌株NEL-002培養(yǎng)，觀察其抗菌活性，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，菌株NEL-002在TSA、YPD培養(yǎng)基上抑菌圈直徑＜7 mm無抑菌活性，在BPY、AYDA培養(yǎng)基上抑菌圈直徑在7～10 mm，為鈍敏，有微弱抑菌活性，在KMB、ZS、Landy、NA培養(yǎng)基上抑菌圈直徑在11～20 mm，為中敏，抑菌活性較強(qiáng)，在MH、LB培養(yǎng)基上抑菌圈直徑＞20 mm，為高敏，抑菌活性強(qiáng)，其中在LB液體培養(yǎng)基抑菌圈直徑為（25.91±0.38）mm，較其他培養(yǎng)基抗菌活性最強(qiáng)，對照組未出現(xiàn)抑菌圈，無抑菌活性。因此，選用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株NEL-002。

圖5 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對菌株NEL-002抑菌活性的影響Fig.5 Effects of different fermentation media on antibacterial activity of strain NEL-002

2.3.2 抗菌活性物質(zhì)的分離純化

分別采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3種有機(jī)溶劑對菌株NEL-002發(fā)酵上清液進(jìn)行萃取，石油醚萃取物抗菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為（25.48±0.01）mm，正丁醇萃取物抑菌圈直徑為（17.70±0.00）mm，乙酸乙酯萃取物抑菌圈直徑為（17.70±0.02）mm抗菌活性較低，對照組各有機(jī)溶劑及DMSO未出現(xiàn)抑菌圈，無抑菌活性。因此，選用石油醚粗提物進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3.3 菌株NEL-002抑菌物質(zhì)化學(xué)成分分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析了該菌株粗提物中可能具有抗MRSA活性的化合物，結(jié)果見表2。由表2可知，在粗提物中共鑒定出3種已知化合物，包括鄰苯二甲酸二丁酯、十甲基環(huán)戊硅氧烷和十二甲基環(huán)六硅氧烷，與文獻(xiàn)[25-26]報道的鄰苯二甲酸二丁酯、十甲基環(huán)戊硅氧烷和十二甲基環(huán)六硅氧烷相關(guān)信息基本一致。

表2 菌株NEL-002抑菌物質(zhì)粗提物主要成分Table 2 Main components of crude extract of antibacterial material from strain NEL-002

2.3.4 菌株NEL-002活性物質(zhì)穩(wěn)定性分析

由圖6可知，粗提物經(jīng)不同溫度處理20 min后，在40～80 ℃的溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高，抑菌活性無明顯差異，抑菌圈直徑均在18.00 mm以上，90 ℃開始抑菌活性隨溫度升高開始降低，加熱至121℃，抑菌圈直徑為（9.26±0.05）mm，相對活性49.34%。說明石油醚粗提物不耐高溫，但在溫度40～80 ℃范圍內(nèi)粗提物熱穩(wěn)定性良好。

圖6 菌株NEL-002粗提活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of the crude extracts from strain NEL-002

由圖7可知，粗提物經(jīng)不同pH值處理后，pH值在5～10時，抑菌圈直徑較大，在堿性條件pH值為8時抑菌圈直徑最大，約為（17.87±0.02）mm，pH值在1～4抑菌圈直徑較小，與對照組相比抑菌活性降低，相對活性均在62.27%以上，而pH值在11～12條件下無抑菌活性，說明提取菌株NEL-002的粗提物在pH值在5～10范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖7 菌株NEL-002粗提活性物質(zhì)酸堿穩(wěn)定性Fig.7 Acid and alkali stability of the crude extracts from strain NEL-002

由圖8可知，分別用淀粉酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶、蛋白酶K處理30 min培養(yǎng)后，抗菌活性均較穩(wěn)定，說明菌株NEL-002產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對上述蛋白酶不敏感，不易被酶破壞其活性。

圖8 不同蛋白酶對菌株NEL-002發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.8 Effect of different protease on antibacterial activity of strain NEL-002

2.4 最低抑菌濃度及殺菌濃度

采用微量稀釋法測定，菌株NEL-002粗提活性物質(zhì)的MIC和MBC，結(jié)果如圖9所示。在96孔板上橫排陰性孔中最后一孔所對應(yīng)的濃度即最低抑菌濃度（MIC）為62.5 μg/mL。菌落計數(shù)為0的平板所對應(yīng)的陰性孔濃度，即菌株NEL-002粗提活性物質(zhì)能夠拮抗MRSA菌生長的最低殺菌濃度（MBC）為500 μg/mL。

圖9 菌株NEL-002粗提活性物質(zhì)最低抑菌濃度及最低殺菌濃度Fig.9 Minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of the crude extracts from strain NEL-002

3 結(jié)論

本研究對紅樹林根部土壤拮抗微生物進(jìn)行研究，對土壤懸浮液處理、分離篩選得到具有抗MRSA活性的菌株NEL-002，經(jīng)細(xì)菌形態(tài)觀察、生理生化特性及16S rDNA 序列分析等方法鑒定該菌株為萎縮芽孢桿菌（Bacillusatrophiae）。菌株NEL-002采用LB液體培養(yǎng)基得到發(fā)酵液經(jīng)石油醚萃取粗體物抗MRSA菌活性最強(qiáng)，且在40～80 ℃、pH在5～10較穩(wěn)定，對多種蛋白酶不敏感；最低抑菌質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL，最低殺菌質(zhì)量濃度為500 μg/mL。GC-MS鑒定出抗菌活性物質(zhì)為十甲基環(huán)戊硅氧烷、十二甲基環(huán)六硅氧烷及鄰苯二甲酸二丁酯。