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        EB病毒陽性的不同類型淋巴瘤組織中EBNA1多態(tài)性研究*

        2021-12-06 05:16:58徐海芹馮征遠(yuǎn)徐曉艷孫亮亮
        中國病理生理雜志 2021年11期
        關(guān)鍵詞:陽性細(xì)胞淋巴瘤變異

        徐海芹, 馮征遠(yuǎn), 徐曉艷 , 孫亮亮

        (1內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科,內(nèi)蒙古呼和浩特010059;2內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,內(nèi)蒙古呼和浩特010010;3內(nèi)蒙古自治區(qū)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科,內(nèi)蒙古呼和浩特010010)

        近年來大量研究發(fā)現(xiàn)EB 病毒(Epstein-Barr virus,EBV)在伯基特淋巴瘤、彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤、經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤及NK/T 細(xì)胞淋巴瘤中的檢出率顯著高于其他腫瘤,推測其可能在腫瘤發(fā)病過程中起到重要作用[1]。而Southern印跡(Southern blot)、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、免疫組織化學(xué)染色(IHC)和原位雜交(ISH)等技術(shù)的運(yùn)用,進(jìn)一步推動了對EBV致瘤性基因表達(dá)及其致瘤機(jī)制的深入研究。

        EBV 是一種線性雙鏈DNA 病毒,廣泛存在于人類中的嗜B 淋巴細(xì)胞,在全世界人群中感染非常普遍[2]。大量研究報(bào)道EBV 相關(guān)的腫瘤呈人種和地域分布性,其原因可能與遺傳、環(huán)境和/或病毒因素有關(guān)。由于不同來源的EBV毒株存在基因變異和生物學(xué)功能的差異,因此是否存在高致病EBV 變異毒株一直倍受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)主要通過觀察15 例EBV 陽性的不同類型淋巴瘤病例中EBV 核抗原1(EBV nuclear antigen 1,EBNA1)羧基端的變異情況,探討本地區(qū)EB 病毒與不同淋巴瘤之間的關(guān)系,以及觀察是否存在與其他地區(qū)不同的EBNA1羧基端變異情況。

        材料和方法

        1 一般資料

        選內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2009 年1 月至2013 年1 月間淋巴瘤標(biāo)本共15 例,年齡在12~81歲之間,男11例,女4例。所有病例均經(jīng)兩位以上病理專家復(fù)查后確診。

        2 方法

        采用酚、氯仿-異戊醇法常規(guī)提取EBV 陽性細(xì)胞系 B95-8 和 EBV 陰性細(xì)胞系 Ramos 細(xì)胞 DNA,使用TIANamp FFPE DNA Kit 石蠟包埋組織DNA 提取試劑盒(離心柱型)提取石蠟包埋組織DNA,實(shí)驗(yàn)步驟按照說明書進(jìn)行,試劑購自天根生化科技(北京)有限公司。依據(jù)B95-8 序列(基因序列號:V01555.1),應(yīng)用Primerpremier 5 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增EBNA1基因的引物,采用巢式PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增,試劑購自天根生化科技(北京)有限公司。采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢驗(yàn)PCR 擴(kuò)增是否成功,試劑購自上海玉博生物科技有限公司?;驕y序送北京華大基因有限公司

        結(jié) 果

        1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和凝膠電泳結(jié)果

        用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)方法對EBV 陽性的淋巴瘤病例進(jìn)行EBNA1基因羧基端的擴(kuò)增,成功擴(kuò)增15 例,并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。15 例中,其中經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤7 例、彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤3 例、NK/T 細(xì)胞淋巴瘤3 例、濾泡性淋巴瘤1例和T 淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤1 例。PCR 擴(kuò)增結(jié)果與EBER 陽性結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),PCR 1、3和13號樣本擴(kuò)增產(chǎn)物較少,其相應(yīng)的EBER 表達(dá)為散在分布,小細(xì)胞(非腫瘤細(xì)胞)陽性,2~3 個(gè)/HPF,兩種檢測結(jié)果一致;PCR 2和4號樣本擴(kuò)增產(chǎn)物較少,EBER 的表達(dá)為彌漫分布,大細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)陽,100個(gè)/HPF,兩種檢測結(jié)果不一致,可能是由于樣本保存問題,導(dǎo)致EBNA1 羧基端部分?jǐn)嗔阉?;PCR 5、6、8~12和15號樣本擴(kuò)增產(chǎn)物較多,其相應(yīng)的EBER 表達(dá)為彌漫分布,大細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)陽,100 個(gè)/HPF,兩種檢測結(jié)果一致;PCR 7號樣本為濾泡性淋巴瘤,擴(kuò)增產(chǎn)物較多,其相應(yīng)的EBER 表達(dá)為散在分布,小、中、大細(xì)胞(非腫瘤細(xì)胞)陽,10~15 個(gè)/HPF,EBER 陽性細(xì)胞數(shù)相對較多,因此認(rèn)為兩種檢測結(jié)果一致;PCR 14號樣本為淋巴細(xì)胞為主型的經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤,擴(kuò)增產(chǎn)物較少,其相應(yīng)的EBER 表達(dá)為散在分布,大細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)陽,陽性的腫瘤細(xì)胞數(shù)整體看并不多,因此兩種檢測結(jié)果一致。綜上所述,EBNA1基因羧基端的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與EBER 表達(dá)情況基本一致,說明EBER 的表達(dá)常伴隨EBNA1 的表達(dá)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物較多的病例主要為彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤、NK/T 細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤,由此說明EBV 感染在不同類型淋巴瘤中的表達(dá)主要與彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤、NK/T 細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的發(fā)病有關(guān),這與其他地區(qū)的研究結(jié)果一致。

        2 上述淋巴瘤(圖1)EBNA1 基因羧基端突變熱點(diǎn)AA487及AA466-527之間的變異情況

        Figure 1. The expression of carboxyl terminal of EBNA1 gene in 15 cases of lymphoma.圖1 15例淋巴瘤中EBNA1基因羧基端的表達(dá)情況

        本實(shí)驗(yàn)對有EBER 陽性細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞)的淋巴瘤病例進(jìn)行EBNA1 基因羧基端的擴(kuò)增,成功擴(kuò)增15 例,并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果顯示(表1),其編碼產(chǎn)物為AA439-555,該段序列包含了以往研究中發(fā)現(xiàn)的突變熱點(diǎn)AA487 及AA466-527 之間的變異。與標(biāo)準(zhǔn)株B95-8相比,15例EBV 陽性淋巴瘤組織標(biāo)本中EBNA1 羧基端均出現(xiàn)序列變異。1號(T)、2號(NK/T)、3 號(NK/T)、4 號(HL)、8 號(HL)、9 號(HL)、11 號(DL)、13 號(DL)、14 號(HL)和15 號(HL)樣本出現(xiàn)了錯義突變AA487 A→V、499 D→E、502 T→N、524 T→I、528 I→V 和 533 L→I,無義突變?yōu)?AA 520 密碼子cat→ctc,與以往研究此段基因變異情況一致;5號(HL)樣本除了出現(xiàn)了共有突變:錯義突變487 A→V(圖 2)、499 D→E、02 T→N、524 T→I、528 I→V 和533 L→I,無義突變?yōu)?AA 520 密碼子 cat→ctc 外,還出現(xiàn)了錯義突變AA462 G→E、466 G→R和無義突變AA466 密碼子 gga→gaa;這與以往研究不同;6 號(DL)、7 號(FL)樣本除了出現(xiàn)了共有突變:錯義突變487 A→V、499 D→E、502 T→N、524 T→I、528 I→V和 533 L→I,無義突變?yōu)?AA 520 密碼子 cat→ctc 外,還出現(xiàn)了無義突變?yōu)锳A 480 密碼子aac→atc 和AA 547 密碼子ccc→cct 突變,這與以往的研究不同;10號(NK/T)樣本只出現(xiàn)了499 D→E,這與以往的研究不同;12 號(HL)樣本出現(xiàn)了與共有突變不同的錯義突變AA 487 A→L、492 S→C、502 T→N 和524 T→I。綜上所述,1 號、3 號和 13 號樣本 EBER 陽性細(xì)胞為非腫瘤細(xì)胞,但是也均出現(xiàn)了共有突變,由此推測,這些EBNA1 羧基端突變是否誘發(fā)非腫瘤細(xì)胞釋放了腫瘤發(fā)生因子,從而促進(jìn)淋巴瘤的發(fā)生,或者這幾例淋巴瘤的發(fā)生與EBV 無關(guān),EBV 感染只是一種潛伏狀態(tài),而是通過其他途徑導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生,又或者EBNA1 基因的變異與疾病無關(guān),只與地區(qū)限制性有關(guān),這有待于進(jìn)一步研究。7 號樣本EBER 陽性細(xì)胞為非腫瘤細(xì)胞,除了出現(xiàn)共有突變外,還出現(xiàn)了非共有突變,這與此樣本EBER 陽性細(xì)胞數(shù)較多并且EBNA1 擴(kuò)增產(chǎn)物也較多是否有關(guān),有待于進(jìn)一步研究。5 號、6 號、10 號和 12 號樣本 EBER 陽性細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞,除了有部分共有突變外,均出現(xiàn)了非共有突變,這些突變可能是偶然事件,但也不能除外與腫瘤的發(fā)生有關(guān)或是由于地域差異導(dǎo)致,有待于進(jìn)一步研究。

        表1 15例淋巴瘤的EBNA1羧基末端基因變異情況Table 1. Variation of EBNA1 carboxyl terminal gene in 15 cases of lymphoma

        討 論

        近年來EBV是研究較多的與腫瘤密切相關(guān)的一種致腫瘤生物因素。EBV 基因組至少有85 個(gè)可編碼基因,這些基因可在EBV 感染的潛伏階段或裂解階段表達(dá)。因?yàn)镋BV潛伏感染和細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力是其致癌的基礎(chǔ),所以目前測序分析主要是針對EBV 潛伏期基因。潛伏期表達(dá)的基因主要包括2 種EBV 編碼小 RNA(EBV-encoded small RNAs,EBERl 和 EBER2);6種核抗原(EBV nuclear antigen,EBNA)家族,包括 EBNAl、2、3A、3B、3C 和主導(dǎo)蛋白(1eader protein,EBNA-LP);潛伏膜蛋白(1atent membrane protein,LMP1)1、2A 和 2B 以及 BamHI-A 右向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(BamHI-A rightward transcripts,BARTs)[3]。 在裂解性感染時(shí),大量的病毒結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因表達(dá),包括即刻早期基因、早期基因和晚期基因[4-5]。

        目前已知EBV多種潛伏期基因編碼產(chǎn)物可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化,其中核抗原家族基因(EBNAs)編碼產(chǎn)物中的EBNA1 是唯一在所有EBV 相關(guān)腫瘤中均表達(dá)的蛋白,近年來研究表明,不同的腫瘤又表現(xiàn)不同的潛伏模式,I 型潛伏感染的有胃癌及Burkitt 淋巴瘤,表達(dá)EBER和EBNA1;II型潛伏感染的有霍奇金淋巴瘤HL、鼻咽癌及NK/T 細(xì)胞淋巴瘤,表達(dá)LMP1、LMP2A、LMP2B、EBNA1 和 EBER;III 型潛伏感染主要見于彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤(DCBCL)及免疫抑制患者的淋巴組織增生性疾病,病毒表達(dá)所有的EBNAs、LMPs、EBERs 和 BARTs;IV 型潛伏感染僅發(fā)生在健康病毒攜帶者的B 細(xì)胞淋巴細(xì)胞中,病毒表達(dá)LMP2A、EBERs 和BARTs。由此可見除了健康病毒攜帶者外,其他EBV 陽性的腫瘤性患者中均可檢測到EBNA1和EBER基因。由于原位雜交的方法(檢測EBER)不需要昂貴的儀器,操作較簡單、不易污染,因此目前臨床病理診斷中常規(guī)是用原位雜交的方法檢測EBV。本研究采用PCR 方法檢測EBNA1,雖然檢測結(jié)果與原位雜交一致,但是PCR 產(chǎn)物可以進(jìn)一步研究EBNA1基因多態(tài)性,而且PCR 方法靈敏度高,更易檢出陽性結(jié)果。當(dāng)病毒潛伏感染時(shí),其在基因組的維持、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用[6]。EBNA1 重復(fù)序列可通過順式作用方式抑制抗原遞呈細(xì)胞對自身的加工處理,使CTL 不能識別自身免疫表位從而逃避機(jī)體免疫應(yīng)答[7]。EBNA1 由N 端(AA1-89)、甘氨酸和丙氨酸重復(fù)序列(AA 90-327)以及C端(AA328-641)組成,對EBNA1基因變異的分析多集中在 C 端[8-9]。因此,本研究對 EBV 陽性淋巴瘤組織中EBNA1編碼基因C端的多態(tài)性進(jìn)行了檢測和分析,旨在探討EBNA1 多態(tài)性在EBV 陽性淋巴瘤發(fā)生中的意義。

        本實(shí)驗(yàn)采用PCR 方法對有EBER 陽性細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞)的淋巴瘤病例進(jìn)行EBNA1基因羧基端的擴(kuò)增,成功擴(kuò)增15例,并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,EBNA1基因羧基端的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與EBER 表達(dá)情況基本一致,PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物較多的病例主要為彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤、NK/T 細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤,由此說明EBV感染在不同類型淋巴瘤中的表達(dá)主要與彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤、NK/T 細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤有關(guān),這與其他地區(qū)的研究結(jié)果一致;同時(shí)也說明EBER 與EBNA1 常常伴隨表達(dá)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物較少的幾乎是伴有EBV 潛伏感染的淋巴瘤病例,EBV 在這些淋巴瘤中可能只屬于伴隨情況,為非致瘤性。

        Figure 2. Mutation of aa487 at C-terminal of EBNA1 gene in some lymphomas. A:negative control(wild type);B:mutation of aa487 at the carboxyl end of EBNA1 gene in sample 5 of classical Hodgkin′s lymphoma(GCT→GTT,that was A→V).圖2 部分淋巴瘤中EBNA1基因C端AA487位點(diǎn)的突變情況

        將擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因進(jìn)行測序分析,測序結(jié)果顯示,其編碼產(chǎn)物為AA439-555,該段序列包含了以往研究中發(fā)現(xiàn)的突變熱點(diǎn)AA487 及AA466-527之間的變異。與標(biāo)準(zhǔn)株B95-8 相比,15 例EBV 陽性淋巴瘤組織標(biāo)本中EBNA1 羧基端均出現(xiàn)序列變異。幾例非腫瘤細(xì)胞EBER陽性的淋巴瘤,也均出現(xiàn)了與以往研究相同的共有突變[10],由此推測,這些EBNA1羧基端突變是否誘發(fā)非腫瘤細(xì)胞釋放了腫瘤發(fā)生因子,從而促進(jìn)淋巴瘤的發(fā)生,或者這幾例淋巴瘤的發(fā)生與EBV無關(guān),EBV感染只是一種潛伏狀態(tài),而是通過其他途徑導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生,這有待于進(jìn)一步研究。而腫瘤細(xì)胞EBER 陽性的淋巴瘤樣本中除了有部分共有突變外,均出現(xiàn)了非共有突變,這些突變可能是偶然事件,也可能由于地域差異導(dǎo)致,或是某種類型淋巴瘤的致瘤原因,有待于進(jìn)一步深入研究。

        綜上所述,EBV 基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜,表達(dá)的蛋白及基因產(chǎn)物較多。其與多數(shù)腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),目前針對淋巴瘤的研究較多。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),該地區(qū)淋巴瘤病例中EBNA1 羧基端變異類型與其他地區(qū)除了有部分共有突變外,均出現(xiàn)了非共有突變,這些突變可能是偶然事件,也不可能除外與腫瘤的發(fā)生有關(guān)或由于地域差異導(dǎo)致,為探索EBV 的致病機(jī)制提供了一定價(jià)值。

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