賀璐璐， 韓佳瑞， 計樹靈， 左振魁△， 段曉宇， 范 颯， ?？到?/p>

［1河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州450000；2河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院），河南鄭州450000］

克羅恩病（crohn disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的主要形式，屬于胃腸道慢性非特發(fā)性炎性疾病，給患者生理及心理造成終生負(fù)擔(dān)［1］。目前IBD 已成為一種全球性疾病，在新興工業(yè)化國家中其發(fā)病率不斷上升，在發(fā)達(dá)國家中IBD 的患病率也已上升到人口的0.3%以上［2］。到目前為止，IBD尚未有特異性的治療方法。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，松果菊苷（echinacoside，ECH）具有抗氧化［3］、抗凋亡［4］、抗炎［5］及改善血流微循環(huán)［6］等藥理作用。在動物模型中，ECH 可促進(jìn)如皮膚［7］、肺臟［8］和肝臟［9］等多種組織損傷的修復(fù)。在IBD相關(guān)研究中顯示，炎癥反應(yīng)和腸屏障破壞伴隨著IBD 整個發(fā)病和進(jìn)展過程［10］。鑒于此，推測 ECH 可能具有抗IBD 的潛力。為驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）誘導(dǎo)的大鼠急性結(jié)腸炎模型，觀察ECH 對DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸炎癥的調(diào)節(jié)作用，用以評估ECH 作為抗IBD潛在藥物的可能性。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 40 只 6～7 周齡雄性 SPF 級 SD 大鼠（220～240 g）購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK（豫）2017-0001，大鼠飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心屏障環(huán)境動物房［SYXK（豫）2016-0009］，其可自由飲食飲水。本實(shí)驗(yàn)已獲得河南省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)均符合動物福利的要求。

1.2 試劑與抗體 ECH（純度98%）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；DSS（分子量36 000～50 000）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；大鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；HE 染色試劑盒和Bradford 蛋白濃度測定試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；RIPA 試劑、DAPI 試劑和 ECL 發(fā)光底物購自上海碧云天生物科技有限公司；IL-6、TNF-α和Toll 樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）兔單克隆抗體及Alexa Fluor?647 標(biāo)記的驢抗兔IgG（H+L）購自Abcam；TLR4 和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）兔單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）、生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）、HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素及GAPDH兔單克隆抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司。

2 方法

2.1 急性結(jié)腸炎大鼠模型建立與分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，將大鼠隨機(jī)分為對照（control）組、模型組（DSS 組）、DSS+低劑量ECH（low-dose ECH，ECHL）組和DSS+高劑量ECH（high-dose ECH，ECH-H）組，每組10 只大鼠。根據(jù)文獻(xiàn)［11］方法，大鼠連續(xù)7 d給予飲用4%DSS（飲用水配制），然后正常飲水3 d，以誘導(dǎo)急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠。對照組大鼠在整個實(shí)驗(yàn)過程中飲用普通水。為評價ECH 對DSS誘導(dǎo)的大鼠急性結(jié)腸炎的防護(hù)作用，于實(shí)驗(yàn)第1～10 天（實(shí)驗(yàn)結(jié)束），對照組和模型組每天給予生理鹽水1 mL灌胃，DSS+ECH-L組及DSS+ECH-H 組每天分別給予20和50 mg/kg ECH灌胃。

2.2 疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）的評估 大鼠每天稱重并檢查腹瀉和便血情況。按照文獻(xiàn)［12］評分系統(tǒng)計算 DAI。DAI 為體重減輕率積分（體重減輕率＜5%，計0 分；5%≤體重減輕率≤10%，計1分；10%＜體重減輕率≤15%，計2分；15%＜體重減輕率≤20%，計3 分；體重減輕率＞20%，計4 分）、腹瀉積分（無腹瀉，計0 分；輕度腹瀉，計2 分；水樣便，計4分）及便血程度積分（無血，計0 分；輕微出血，計2分；大量出血，計4分）之和。

2.3 結(jié)腸標(biāo)本的收集 在結(jié)腸炎誘導(dǎo)后第10 天，過量麻醉處死各組大鼠。取每只大鼠的整個結(jié)腸進(jìn)行長度測量，并縱向打開結(jié)腸標(biāo)本，用生理鹽水沖洗。取離遠(yuǎn)端結(jié)腸0.5 cm 的節(jié)段，立即置于1.5 mL低溫管中，保存于-80 ℃。

2.4 HE 染色 用常規(guī)法用石蠟包埋大鼠結(jié)腸組織，并將其切為5 μm 厚的切片。切片經(jīng)脫蠟至水后，根據(jù)試劑盒操作步驟進(jìn)行HE 染色。200 倍光學(xué)顯微鏡下觀察并采集結(jié)腸組織HE 染色圖像。按照文獻(xiàn)［13］方法，根據(jù)結(jié)腸形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)評分以評估結(jié)腸損傷。

2.5 免疫組織化學(xué)染色 取大鼠結(jié)腸組織切片（5 μm 厚），脫蠟至水后，用0.3%雙氧水處理10 min 以封閉內(nèi)源性過氧化氫酶，10%山羊血清封閉30 min，室溫分別孵育 1∶200 稀釋比例的 IL-6 和 TNF-α 兔單克隆抗體2 h，PBS 洗滌后，室溫孵育1∶200 稀釋比例的生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）1 h，再次PBS洗滌后，室溫孵育1∶200 稀釋比例的HRP 標(biāo)記的鏈酶親和素 45 min，PBS 洗滌后，DAB 顯色 5 min，自來水沖洗，蘇木素染核，依次常規(guī)分化、藍(lán)化和脫水后，用中性樹脂封片，在200 倍光學(xué)顯微鏡觀察染色情況并采集結(jié)腸組織免疫組化染色圖像。

2.6 ELISA 檢測 取大鼠結(jié)腸組織，用RIPA 勻漿，并用Bradford 蛋白濃度測定試劑盒檢測勻漿液中蛋白含量。根據(jù)ELISA 試劑盒說明書操作步驟，檢測勻漿液中 IL-1β、IL-6、IL-10 和 TNF-α 含量。結(jié)腸組織中 IL-1β、IL-6、IL-10 和 TNF-α 水平表示為勻漿液中 IL-1β、IL-6、IL-10 和 TNF-α 含量/勻漿液中蛋白含量。

2.7 免疫熒光染色 取大鼠結(jié)腸組織切片（5 μm厚），脫蠟至水后，用0.3%雙氧水處理10 min以封閉內(nèi)源性過氧化氫酶，10%驢血清封閉30 min，加入1∶400 稀釋比例的TLR2 兔單克隆抗體，4 ℃下孵育過夜；PBS 洗滌后，室溫避光孵育1∶400 稀釋比例的Alexa Fluor?647 標(biāo)記的驢抗兔IgG（H+L）1 h，PBS 再次洗滌后，DAPI 試劑染核，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.8 Western blot 法檢測蛋白水平 RIPA 萃取結(jié)腸組織全蛋白，用Bradford蛋白濃度測定試劑盒將各組蛋白樣品定量至相同濃度后，取20 μg蛋白進(jìn)行SDSPAGE。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)活化的PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫下封閉膜1 h，4℃孵育1∶1 000 的稀釋比例的兔單克隆抗體（TLR2、TLR4 和NF-κB和GAPDH）過夜。次日，以TBST洗滌后，室溫孵育1∶1 000 的稀釋比例的HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）1 h，以TBST 洗滌后，用ECL 發(fā)光底物和化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。用IPP6.0軟件檢測蛋白的灰度值。蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值×100%。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，并利用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)在滿足正態(tài)分布和方差齊的條件下，多組比較采用單因素方差分析法，組間兩兩比較采用Bonferroni校正。當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠結(jié)腸炎DAI評分及結(jié)腸長度比較

與對照組相比，DSS 組大鼠的DAI 顯著升高（P＜0.01，圖1A），結(jié)腸長度顯著縮短（P＜0.01，圖1B）；與DSS 組 比 較 ，DSS+ECH-L 和 DSS+ECH-H 組 大 鼠 的DAI 顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01，圖1A），結(jié)腸長度顯著增長（P＜0.05 或P＜0.01，圖 1B），其中 DSS+ECH-H組尤為顯著（P＜0.01）。

2 各組大鼠結(jié)腸的組織學(xué)表現(xiàn)比較

HE 染色顯示，對照組腸絨毛和腸黏膜正常，固有層腺體正常，基底層正常；DSS 組腸絨毛縮短、排列紊亂且絨毛上皮結(jié)構(gòu)分辨不清甚至消失，腸黏膜和固有層結(jié)構(gòu)破壞（出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤、腺體破壞、嚴(yán)重充血和出血現(xiàn)象），基底層變厚；DSS+ECH-L 組腸絨毛縮短和排列不整齊、絨毛上皮結(jié)構(gòu)可分辨，腸粘膜上皮部分破壞有水腫和出血情況，固有層腺體分辨不清；DSS+ECH-H 組腸絨毛長度、排列和結(jié)構(gòu)趨向正常，但絨毛上皮中細(xì)胞分辨不清，黏膜組織有少量出血點(diǎn)，固有層腺體結(jié)構(gòu)趨向清晰。組織評分結(jié)果顯示，與對照組比較，DSS 組組織評分顯著增加（P＜0.01）；與DSS 組比較，DSS+ECH-L 和DSS+ECHH 組組織評分顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中DSS+ECH-H組尤為顯著（P＜0.01）。見圖2。

3 各組大鼠結(jié)腸組織中炎癥相關(guān)因子表達(dá)情況比較

免疫組織化學(xué)染色（圖3A）顯示，對照組大鼠結(jié)腸組織中IL-6和TNF-α呈陰性表達(dá)；DSS組大鼠結(jié)腸組織中IL-6 和TNF-α 呈彌漫強(qiáng)陽性表達(dá)；DSS+ECHL 和 DSS+ECH-H 組大鼠結(jié)腸組織中 IL-6 和 TNF-α 表達(dá)相對DSS 組明顯減弱。ELISA 結(jié)果（圖3B）顯示，與對照組比較，DSS 組大鼠結(jié)腸組織中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α 水平顯著增加（P＜0.01），抑炎因子IL-10 水平顯著降低（P＜0.01）；與DSS 組比較，DSS+ECH-L和DSS+ECH-H組IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），IL-10 水平顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），其中DSS+ECH-H 組尤為顯著（P＜0.01）。

Figure 1. ECH alleviated DSS-induced colitis in rats. A：DAI score of rats in each group；B：colon length of rats in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs DSS group.圖1 ECH減輕DSS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎

Figure 2. ECH alleviated DSS-induced colonic destruction in rats（HE staining，scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs DSS group.圖2 ECH可減輕DSS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸破壞

4 各組大鼠結(jié)腸組織中TLRs 及NF-κB 表達(dá)情況的比較

TLR2 免疫熒光染色（圖4A）顯示，DSS 組大鼠結(jié)腸組織中TLR2 陽性細(xì)胞明顯多于對照組；DSS+ECH-L 和 DSS+ECH-H 組大鼠結(jié)腸組織中 TLR2 陽性細(xì)胞明顯少于DSS 組，其中DSS+ECH-H 組數(shù)量更少。Western blot 結(jié)果（圖4B～E）顯示，與對照組比較，DSS 組大鼠結(jié)腸組織中 TLR2、TLR4 和 NF-κB 表達(dá)水平均顯著增高（P＜0.01）；與DSS 組比較，DSS+ECH-L 和DSS+ECH-H 組大鼠結(jié)腸組織中TLR2、TLR4 和NF-κB 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），其中DSS+ECH-H組尤為顯著（P＜0.01）。

討 論

Figure 3. ECH attenuated DSS-induced colon inflammation in the rats. A：immunohistochemical staining of IL-6 and TNF-α in colon tissues of the rats in each group（scale bar=100 μm）；B：the levels of IL-1β，IL-6，IL-10 and TNF-α in colon tissues of the rats were measured by ELISA. Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs DSS group.圖3 ECH可減輕DSS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸中炎癥反應(yīng)

IBD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，遷延難愈，目前傳統(tǒng)的西醫(yī)治療效果尚不十分理想［2］。本研究以DSS 誘導(dǎo)的大鼠急性結(jié)腸炎模型來評估ECH 潛在的抗IBD 的作用，結(jié)果顯示，ECH 可明顯改善結(jié)腸炎大鼠的DAI積分和病理改變等癥狀，提示，ECH 是潛在的治療IBD的候選藥物。

正常情況下，結(jié)腸組織中炎癥因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）與抗炎因子（IL-10）處于平衡狀態(tài)，當(dāng)炎癥出現(xiàn)時，嗜中性粒細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞及其他類型細(xì)胞共同通過分泌促炎因子啟動炎癥反應(yīng)來進(jìn)一步激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)［14］。有研究表明，在IBD 小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 的水平急劇升高［15］，而抗炎因子IL-10 在這一過程中會出現(xiàn)下降［14］。本研究結(jié)果也顯示在DSS 誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎模型中，大鼠結(jié)腸組織中的 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的水平明顯升高，IL-10 水平明顯下降，而ECH 治療可在一定程度上逆轉(zhuǎn)結(jié)腸組織中炎癥因子失衡這一現(xiàn)象，從而減輕IBD過程中炎癥損傷的程度。

Figure 4. ECH inhibited DSS-induced hyperactivation of TLRs/NF-κB signaling pathways in colon tissues of the rats. A：the image of immunofluorescence staining for TLR2 in the colon tissue of rats in each group（scale bar=50 μm）；B，C，D and E：the expression levels of TLR2，TLR4 and NF-κB in colon tissues of the rats in each group were detected by Western blot. Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs DSS group.圖4 ECH可抑制DSS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸組織中TLRs/NF-κB信號通路的過度激活

TLR 是天然免疫的第一道屏障，能識別侵入體內(nèi)的微生物進(jìn)而激活免疫細(xì)胞應(yīng)答的作用，現(xiàn)已被證實(shí)其在IBD 的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［16］。TLR2 和 TLR4 是較早發(fā)現(xiàn)并報道的 TLRs 家族成員，能夠直接介導(dǎo)機(jī)體與病原體之間的反應(yīng)［17-18］。Li 等［19］在 LPS 誘導(dǎo)的大鼠急性腸損傷模型中發(fā)現(xiàn)LPS 能誘導(dǎo)大鼠回腸上皮細(xì)胞凋亡，提高其回腸組織中TLR4 的mRNA 表達(dá)水平，磷酸化NF-κB抑制因子α 并導(dǎo)致其降解，從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性蛋白和回腸髓過氧化物酶的產(chǎn)生。另有研究［12］報道，TLR2 可識別腸道內(nèi)致病菌DNA，并在活化后表達(dá)升高，繼續(xù)激活下游炎癥介質(zhì)，說明TLR2 也可參與腸道免疫反應(yīng)。既往的研究說明TLR2及TLR4在IBD 大鼠腸道的免疫及炎癥穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著不可或缺的作用，本研究結(jié)果也顯示在DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中，大鼠結(jié)腸組織中的TLR2及TLR4均明顯升高，同時其下游因子NF-κB 表達(dá)水平也明顯升高，說明在DSS 誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎模型中結(jié)腸組織存在TLRs/NF-κB 炎癥通路的過度激活，而 ECH 治療后TLR2、TLR4 及 NF-κB 表達(dá)水平均明顯下降，表明ECH 可在一定程度上抑制DSS 誘導(dǎo)的TLRs/NF-κB炎癥通路的激活從而發(fā)揮其抗炎作用。

綜上所述，ECH 能改善DSS 大鼠結(jié)腸炎癥狀（包括結(jié)腸長度、DAI 評分、組織結(jié)構(gòu)形態(tài)、炎癥反應(yīng)等均明顯減輕），且能抑制TLR/NF-κB 通路的活性，說明ECH 對DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型大鼠具有一定的治療作用。