楊荷雨， 王招娣， 趙佳佳， 謝 敏， 朱海麗

（湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧437100）

疼痛是指對實(shí)際或潛在身體傷害的有害刺激的進(jìn)化保護(hù)性感覺，與炎癥發(fā)生的區(qū)域有關(guān)［1］。與生理性疼痛相反，炎癥性疼痛源于組織損傷，它啟動(dòng)了傷害性神經(jīng)纖維末梢的激活。在炎癥反應(yīng)過程中，對有害刺激的反應(yīng)增強(qiáng)（痛覺過敏）或由正常的無害刺激（異常性疼痛）觸發(fā)疼痛［2］。炎癥通路通常由外周創(chuàng)傷或損傷觸發(fā)，疼痛性損傷后大腦中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活增多，表明神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活在神經(jīng)炎癥和痛敏中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。在病理性疼痛狀態(tài)下，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，釋放促炎因子和增強(qiáng)脊髓神經(jīng)元興奮性的生長因子，維持疼痛［3］。

人源 SIRT1（NAD-deperdent protein deacetylase sirtuin 1）是 Sir2（silent information regulator 2）超蛋白家族成員之一，是NAD+依賴型的去乙酰化酶，能夠催化組蛋白底物和非組蛋白底物的乙酰賴氨酸進(jìn)行去乙?；?，在染色質(zhì)重塑、基因調(diào)控、代謝和腫瘤等相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用［4］。SIRT1 的表達(dá)和活性在炎癥性疼痛、神經(jīng)病理性疼痛及骨癌痛模型的動(dòng)物脊髓中均下調(diào)［5］。SIRT1 激活劑白藜蘆醇、SRT1720和NAD 鞘內(nèi)處理可顯著減輕動(dòng)物機(jī)械痛過敏和熱痛過敏，而抑制SIRT1 活性或下調(diào)其表達(dá)可阻斷其抗傷害效應(yīng)［6］。

為了明確并闡明SIRT1 在病理性疼痛中的作用及機(jī)制，運(yùn)用SRT1720 作用于腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及完全弗氏佐劑（complete Freund′s adjuvant，CFA）-誘導(dǎo)的疼痛模型大鼠，檢測SIRT1活性上調(diào)對大鼠痛覺行為學(xué)的影響，并探討其病理機(jī)制，為病理性疼痛小分子鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)提供理論支持。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)中使用的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠購于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，180～200 g，6～8 周齡，合格證編號為 42000600041944。將大鼠飼養(yǎng)在（22±2）℃環(huán)境中，以12/12 h光/暗循環(huán)并提供充足的水和食物。

1.2 主要試劑 蛋白酶抑制劑、加強(qiáng)型放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）buffer、SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒和BCA 蛋白濃度測定試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗離子鈣接頭蛋白1（ionized calcium binding adaptor molecule 1，Iba1；ab5076）和抗 SIRT1（ab110304）抗體購自Abcam；抗p-SIRT1-S47（AP0976）、抗白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β；A11370）和抗NLRP3（A12694）抗體購自ABclonal；HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG購自ABclonal；辣根過氧化物酶標(biāo)記驢抗山羊IgG（H+L）購自碧云天。

2 主要方法

2.1 模型建立及分組處理 構(gòu)建TNF-α-急性痛大鼠模型：剔除大鼠背部注射部位毛發(fā)并進(jìn)行皮膚表面消毒，用無菌微量注射器于L5和L6脊椎棘突間隙垂直進(jìn)針，進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，緩慢傾斜45°注入10 μL（10 ng）TNF-α；對照組注射相同劑量的生理鹽水。藥物處理：大鼠隨機(jī)分為溶劑對照組（control 組）和SRT1720給藥組。TNF-α注入30 min后，溶劑對照組鞘內(nèi)注射 10 μL DMSO+生理鹽水，SRT1720 組鞘內(nèi)注射 10 μL（200 μg）SRT1720 溶液。SRT1720 溶解在DMSO 中，使用前用生理鹽水按體積比1：1 進(jìn)行稀釋。構(gòu)建CFA-慢性炎癥痛大鼠模型：大鼠左后肢注射50 μL完全弗氏佐劑，對照組注射同劑量的生理鹽水［7］。藥物處理：CFA模型構(gòu)建7 d后，溶劑對照組鞘 內(nèi) 注 射 10 μL DMSO+生 理 鹽 水（v/v=1∶1），SRT1720組鞘內(nèi)注射10 μL（200 μg）體積的SRT1720溶液。

2.2 大鼠自發(fā)性縮足反射（Flinches）次數(shù)的記錄大鼠置于長、寬、高均為30 cm的透明有機(jī)玻璃盒內(nèi)，玻璃平板位于實(shí)驗(yàn)平臺高50 cm 的支架上。實(shí)驗(yàn)開始前，將大鼠放置于玻璃盒中適應(yīng)30 min，觀察并記錄每5 min 內(nèi)大鼠自發(fā)性縮足（或舔爪）反射次數(shù)，記錄3次。脊髓鞘內(nèi)注射TNF-α，放回盒內(nèi)30 min后記錄每5 min 內(nèi)縮足（或舔爪）次數(shù)，記錄3 次。進(jìn)而，繼續(xù)鞘內(nèi)注射溶劑對照或SRT1720，30 min后記錄每5 min內(nèi)縮足（或舔爪）次數(shù)，記錄3次。

2.3 50%縮足閾值（paw withdrawal threshold，PWT）的檢測 各組給藥后 0、2、4 和 6 h，根據(jù) up-down 法檢測50% PWT。方法如下：實(shí)驗(yàn)前讓大鼠在玻璃箱中適應(yīng)環(huán)境30 min。用Von Frey 纖維（0.4～26 g）對大鼠后足底正中部進(jìn)行垂直剌激。動(dòng)物受刺激后，若出現(xiàn)舔足或抬足等行為視為陽性反應(yīng)，反之則為陰性反應(yīng)。測定大鼠的力度從2 g 開始，最大力度為26 g，當(dāng)力度超過26 g 時(shí)也計(jì)為26 g。對大鼠進(jìn)行刺激而沒出現(xiàn)任何陽性反應(yīng)時(shí)，應(yīng)該用相鄰高的力度再次刺激；對大鼠進(jìn)行刺激后很快出現(xiàn)陽性反應(yīng)時(shí)，應(yīng)該用相鄰低的力度再次進(jìn)行刺激。記錄6 次數(shù)據(jù)后結(jié)束檢測。50%PWT（g）=10Xf+Kδ/10 000，Xf 為本次行為學(xué)測試中使用的最后一個(gè)Von Frey 纖維的階數(shù)，K 為痛覺閾矯正系數(shù)，δ 為相鄰不同纖維刺激之間的差異。

2.4 Western blot 法檢測脊髓組織中蛋白的表達(dá)行為學(xué)記錄結(jié)束后，動(dòng)物注射過量麻醉劑（10%水合氯醛5 mL/kg），脫頸處死，分離脊柱，暴露脊髓，分離腰段脊髓置于預(yù)冷的RIPA 裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑cocktail）中進(jìn)行勻漿。收集組織裂解液于離心管中，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，收集上清，BCA 法檢測上清中的蛋白濃度。SDS-PAGE 分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉l h，加入Ⅰ抗4℃條件下孵育過夜。加入Ⅱ抗孵育1 h 后，LAS500 凝膠成像系統(tǒng)掃描觀察，ImageJ 軟件分析條帶灰度值。

2.5 免疫熒光法檢測脊髓組織中Iba1 的蛋白表達(dá)和定位 動(dòng)物麻醉后，用4%多聚甲醛灌流固定，剝?nèi)〖顾?，脫水包埋，制作石蠟切片。石蠟切片脫蠟，PBS 漂洗，封閉，加入Ⅰ抗孵育過夜，PBS 洗 3 次，熒光素標(biāo)記Ⅱ抗染色標(biāo)記，漂洗，封片，熒光顯微鏡觀察，ImageJ軟件分析熒光強(qiáng)度值［8］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SRT1720鞘內(nèi)給藥緩解大鼠TNF-α所致急性痛

以大鼠自發(fā)性縮足（或舔爪）反射（Flinches）次數(shù)評估大鼠自發(fā)性疼痛情況。如圖1 所示，與對照組（control組）相比，脊髓鞘內(nèi)注射TNF-α（TNF-α 組）引發(fā)大鼠外周痛覺過敏。為了檢測SRT1720對TNF-α-誘導(dǎo)急性痛的作用，記錄鞘內(nèi)給藥SRT1720 后大鼠自發(fā)性縮足（或舔爪）反射次數(shù)。結(jié)果顯示，SRT1720 給藥（TNF-α+SRT1720 組）大鼠的自發(fā)縮足次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。單獨(dú)注射 SRT1720 后（control+SRT1720組）縮足次數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），表明SRT1720 對正常大鼠的行為學(xué)沒有影響。該結(jié)果表明，鞘內(nèi)注射SRT1720激活SIRT1可有效緩解TNF-α誘導(dǎo)的急性痛覺過敏。

Figure 1. The effect of SRT1720 treatment on TNF-α-induced painful behavior in the animals with acute pain.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group.圖1 SRT1720處理對TNF-α誘導(dǎo)的急性痛動(dòng)物痛覺行為的影響

2 SRT1720 鞘內(nèi)給藥緩解大鼠CFA 所致慢性炎癥痛

足底注射CFA 后，大鼠同側(cè)后爪機(jī)械痛閾值降低（P＜0.05，圖2A）；SRT1720 給藥后2～6 h 機(jī)械痛閾值增加（P＜0.05，圖2A）。大鼠對側(cè)后爪機(jī)械痛閾值變化在給藥前后沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2B）。上述結(jié)果表明SRT1720鞘內(nèi)給藥可以緩解CFA 誘導(dǎo)的慢性炎癥痛。

Figure 2. The effect of SRT1720 treatment on the pain behavior of the animals with chronic inflammatory pain induced by CFA. A：PWT values of ipsilateral hind paw in control group，CFA group，and CFA+SRT1720 group；B：PWT values of contralateral hind paw in control group，CFA group，and CFA+SRT1720 group. Mean±SD. n=6 .*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CFA group.圖2 SRT1720處理對CFA誘導(dǎo)的慢性炎癥痛動(dòng)物痛覺行為的影響

3 SRT1720鞘內(nèi)給藥激活SIRT1信號

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α 和 CFA 誘導(dǎo)后脊髓組織中SIRT1 在S47 位點(diǎn)的磷酸化水平顯著降低；經(jīng) SRT1720 處理后 TNF-α 組和 CFA 組 SIRT1磷酸化水平均顯著升高（圖3A、B）。以磷酸化SIRT1和總SIRT1表達(dá)水平的比值表示SIRT1的活性，如圖3C、D 所示，SRT1720 處理可顯著增加 TNF-α 和 CFA誘導(dǎo)的SIRT1活性下調(diào)（P＜0.05）。

Figure 3. SRT1720 treatment restored the decreased SIRT1 activity-induced by TNF-α and CFA. A and B：Western blot analysis of SIRT1 protein expression and phosphorylation level at Ser47 in different groups；C and D：ImageJ software was used to quantify the gray degree values. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group；△P＜0.05 vs CFA group.圖3 SRT1720處理恢復(fù)TNF-α和CFA誘導(dǎo)的SIRT1活性降低

4 SRT1720 抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化并降低脊髓炎癥反應(yīng)

為了闡明SRT1720 緩解病理性疼痛的機(jī)制，用Western blot分析檢測脊髓腰段組織中小膠質(zhì)細(xì)胞活化的程度及炎癥因子的表達(dá)水平。本研究用小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物Iba1的表達(dá)水平表征小膠質(zhì)細(xì)胞的活化水平，以NLRP3 炎癥小體和IL-1β 的表達(dá)水平表征炎癥反應(yīng)的程度。如圖4 所示，TNF-α 和CFA 誘導(dǎo)后脊髓組織中 Iba1、NLRP3 和 IL-1β 表達(dá)均上調(diào)，表明小膠質(zhì)細(xì)胞激活同時(shí)伴隨促炎癥因子表達(dá)增加；SRT1720 鞘內(nèi)給藥后，Iba1、NLRP3 和 IL-1β水平均下調(diào)（P＜0.05）。如圖5 所示，CFA 誘導(dǎo)后脊髓組織中Iba1 熒光強(qiáng)度增加。該結(jié)果表明SRT1720鞘內(nèi)給藥可降低小膠質(zhì)細(xì)胞激活介導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

討 論

炎癥反應(yīng)引起細(xì)胞變化和免疫反應(yīng)從而導(dǎo)致受損組織的修復(fù)和受損組織部位的細(xì)胞增殖（生長）［9］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥疾病和小膠質(zhì)細(xì)胞的功能息息相關(guān)。神經(jīng)炎癥的特征在于激活外周神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，以及脊髓和大腦中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞［10］。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞類型，小膠質(zhì)細(xì)胞不斷地監(jiān)測環(huán)境中外來的（細(xì)菌或病毒）和內(nèi)源性（DNA、RNA 和蛋白質(zhì)）的有害信號［11］。在神經(jīng)未受損傷時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，形態(tài)呈分枝狀；一旦發(fā)生神經(jīng)損傷、外傷或感染，小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)由靜息態(tài)變?yōu)榧せ顟B(tài)，胞體出現(xiàn)肥大和增生，細(xì)胞突起回縮。在損傷的早期，小膠質(zhì)細(xì)胞適度活化，將外來入侵的病原體和死亡的細(xì)胞清除，從而維持突觸發(fā)生、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性以及血腦屏障的完整性［12］。在損傷的后期，持續(xù)性的炎癥痛導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活，分化為M1 型（促炎型）和M2 型（抗炎型）。正常情況下，兩種激活態(tài)細(xì)胞保持動(dòng)態(tài)平衡；神經(jīng)損傷后，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞更傾向于分化為M1 型，小膠質(zhì)細(xì)胞能釋放有神經(jīng)毒性的促炎因子，如腫瘤壞死因子、一氧化氮和白細(xì)胞介素等［13］，觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)。

Figure 4. The effect of SRT1720 treatment on spinal cord microglia and inflammatory signals. A and B：Western blot analysis of Iba1，NLRP3，and IL-1β protein levels in different groups；C and D：ImageJ software was used to quantify the gray degree values. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group；△P＜0.05 vs CFA group.圖4 SRT1720處理對脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥信號的作用

Figure 5. Fluorescence intensity of Iba1 in spinal cord of rats. A：representative images of Iba1 immunofluorescence staining on spinal dorsal horn from control and CFA rats（scale bars：the first line=100 μm；the second line=20 μm）；B：quantitative analysis of Iba1 fluorescence intensity in the spinal cord. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group.圖5 CFA誘導(dǎo)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活

小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，且小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和NLRP3 炎癥小體增加相關(guān)。NLRP3 是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白，被稱為炎癥小體的炎癥信號復(fù)合體。小膠質(zhì)細(xì)胞慢性激活引起NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的釋放［14］。NLRP3炎癥小體由NLRP3、ASC和caspase-1組成，過度激活后釋放 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等促炎細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步損傷神經(jīng)細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，TNF-α 和 CFA 處理均可上調(diào) Iba1、NLRP3 和IL-1β的表達(dá)，表明小膠質(zhì)細(xì)胞激活伴隨NLRP3炎癥小體表達(dá)上調(diào)。因此抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和NLRP3炎癥小體的活性可作為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥等相關(guān)疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

NLRP3炎癥小體激活的啟動(dòng)信號的主要介質(zhì)是NF-κB，該核轉(zhuǎn)錄因子可誘導(dǎo) NLRP3 和 pro-IL-1β 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［15］。SIRT1 能夠調(diào)控 NF-κB p65 亞單位乙?；揎?，上調(diào)NF-κB 活性，調(diào)控炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展［16］。NLRP3炎癥小體組裝活化后導(dǎo)致caspase-1的自我切割和活化，進(jìn)而將pro-IL-1β 和pro-IL-18 加工成成熟的形式，引發(fā)炎癥［17］。

SRT1720是一種特異性SIRT1激活劑，對同系物SIRT2 和SIRT3 的激活作用較弱（弱230 倍以上），我們研究中鞘內(nèi)注射SRT720激活SIRT1并研究其作用機(jī)制［18］。我們發(fā)現(xiàn) SRT1720 特異性激活 SIRT1 可顯著抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞所介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活及炎癥反應(yīng)。本研究表明SIRT1 活性增加可顯著下調(diào) Iba1、NLRP3 和 IL-1β 的表達(dá)同時(shí)伴隨大鼠痛覺敏感性下降。SRT1720 激活SIRT1 能夠減輕小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥及抑制NLRP3 炎癥小體的激活。

綜上所述，SRT1720激活脊髓SIRT1活性可抑制脊髓炎癥信號并緩解炎癥誘導(dǎo)的動(dòng)物痛覺行為，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，該研究結(jié)果的取得為病理性疼痛的治療提供研究依據(jù)，有助于鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)。