王重陽 ， 金海南 ， 劉思奇 ， 張雅琳 ， 宋藝蘭 ， 延光海 △， 金永德 △

（1延邊大學(xué)吉林省過敏性常見疾病免疫與靶向研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林延吉133002；2延邊大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科，吉林延吉133002；3延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，吉林延吉133002）

慢性鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是最常見的慢性炎癥性疾病之一，我國的患病率約為8%［1］，歐美國家的患病率更高，約為 10.9%～11.9%［2］。CRS 不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，同時(shí)也消耗了大量的醫(yī)療資源。CRS 目前分為有鼻息肉的CRS（CRS with nasal polyps，CRSwNP）和無鼻息肉的CRS（CRS without nasal polyps，CRSsNP）。CRSwNP 的主要特征是基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）水平升高及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中顯著水腫形成［3］。MMPs 構(gòu)成鋅和鈣依賴性蛋白酶家族，在蛋白質(zhì)降解中起關(guān)鍵作用。MMPs與其金屬蛋白酶組織抑制物之間的不平衡可導(dǎo)致水腫形成，是CRSwNP 組織重塑的主要機(jī)制之一［4］。以往的研究表明，MMPs 可能是腫瘤的重要潛在治療靶點(diǎn)［5］。目前，CRSwNP 的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。因此，進(jìn)一步研究CRSwNP 的病理機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其潛在治療靶點(diǎn)十分有必要。

白細(xì)胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）是一種主要由輔助性T 細(xì)胞17（T helper 17 cells，Th17 細(xì)胞）產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，已被證明與各種慢性炎癥和自身免疫疾病有關(guān)［6-7］。據(jù)報(bào)道，使用抗IL-17A 或IL-17 受體A（IL-17 receptor A，IL-17RA）抗體可抑制TRAF6/NF-κB 信號(hào)通路，從而緩解廣州血管圓線蟲誘導(dǎo)小鼠的嗜酸性腦膜炎［8］。Krueger 等［9］證實(shí)Secukinumab（一種選擇性抑制IL-17A 的人類抗體）治療減少了銀屑病的面積和嚴(yán)重程度。然而，抗IL-17A治療在CRSwNP中是否有效的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究旨在探討IL-17A 在CRSwNP 中的表達(dá)及其作用機(jī)制。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)通路是一種蛋白質(zhì)-絲氨酸/蘇氨酸激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括激活效應(yīng)激酶ERK1/2 的雙特異性 MAPK 激酶 1/2（MAPK kinase 1/2，MEK1/2）。該通路參與多種核轉(zhuǎn)錄因子，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、炎癥反應(yīng)和其他生物學(xué)過程［10］。此外，線粒體膜電位、線粒體氧化應(yīng)激和線粒體能量代謝也受到 p38 MAPK/ERK 通路的調(diào)節(jié)［11］。MAPK由于其在不同細(xì)胞類型、特定時(shí)間點(diǎn)和特定微環(huán)境中的差異，在CRSwNP 組織重塑過程中的作用比較復(fù)雜，有待進(jìn)一步闡明。此外，我們對(duì)IL-17A 和MAPK 在CRS 反應(yīng)過程中的相關(guān)性知之甚少。因此，我們探討IL-17A 是否通過p38 MAPK/ERK1/2 信號(hào)通路增加慢性鼻竇炎中MMP-9 的異常表達(dá)，以期為臨床CRSwNP的治療尋找新的方向。

材料和方法

1 臨床標(biāo)本的采集

該研究取得延邊大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（No. 2020AP019）?；颊咴陔[私被保護(hù)的前提下被告知：切除的標(biāo)本由醫(yī)院保存并有可能用于科學(xué)研究。本實(shí)驗(yàn)所用的鼻息肉組織均采集于2020 年5月～2021 年5 月招募的患有CRSwNP 的成年患者。以鼻中隔成形術(shù)矯正鼻中隔偏曲病人15 名為對(duì)照，取其鉤突組織。

2 方法

2.1 鼻息肉成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng) 將取出的鼻息肉組織用滅菌加雙抗PBS洗3次，然后將組織剪碎并使用消化液在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3 h，1 350 r/min 離心5 min 后棄上清液，余下細(xì)胞液置入10 cm 培養(yǎng)皿中并加入10 mL RPMI-1640培養(yǎng)液，最后將培養(yǎng)皿置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

2.2 人鼻黏膜上皮細(xì)胞（human nasal epithelial cells，HNEpCs）的培養(yǎng) HNEpCs 購自豐暉生物（湖南），置于盛有RPMI-1640（Thermo）和10% FBS（Biowest）的培養(yǎng)皿，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入p38 MAPK 抑制劑 SB203580（SB）或 ERK1/2 抑制劑PD98059（PD），濃度均為1 μmol/L，處理12 h。

2.3 ELISA 根據(jù)ELISA 試劑盒說明書的步驟，檢測患者鉤突和鼻息肉組織中IL-17A 和MMP-9 的含量，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

2.4 RT-qPCR 通過Trizol 試劑（上海生工生物公司）從患者鉤突和鼻息肉組織中提取總RNA。使用Quant cDNA合成試劑盒（北京天根生物技術(shù)公司）合成cDNA。使用SYBR Green 實(shí)時(shí)PCR 檢測系統(tǒng)和特異性引物序列測定細(xì)胞因子IL-17及MMP-9的水平。采用 2-ΔΔCt法［12］計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。

2.5 免疫組織化學(xué)染色 對(duì)烤好的片子進(jìn)行脫蠟、脫水，再予以抗體修復(fù)液中修復(fù)0.5 h，然后用抗IL-17A 和MMP-9 的Ⅰ抗和相對(duì)應(yīng)的Ⅱ抗進(jìn)行孵育。DAB 顯色、蘇木精復(fù)染并封片。并于顯微鏡下觀察，Cytantion5微孔成像儀進(jìn)行拍片。

2.6 HE 染色 取出患者鉤突和鼻息肉組織固定好，包埋后進(jìn)行貼片、烤片、脫蠟、水洗、脫水后予以蘇木素和伊紅染色，再次脫水后封片，并于顯微鏡下觀察，Cytantion5微孔成像儀進(jìn)行拍片。

2.7 Western blot 將組織蛋白裂解或細(xì)胞蛋白收集后測定其樣品蛋白濃度。配好的電泳膠上每個(gè)泳道加等量的蛋白開始電泳。將分離后的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，封閉后加入稀釋的Ⅰ抗（MMP-9、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38和β-actin）4 ℃過夜。洗膜，相應(yīng)Ⅱ抗再孵育2 h。再次洗膜后加入發(fā)光劑，利用AI 600凝膠成像儀采集圖像。

2.8 細(xì)胞免疫熒光染色 將細(xì)胞以1×105均勻鋪于6 孔板中，予以50 μg/L IL-17A 處理后，用4%多聚甲醛固定，用1%牛血清白蛋白（albumin）封閉30 min，然后首先用抗MMP-9 抗體在4 ℃下染色過夜。隨后，將HNEpCs 與AlexaFluor 488 偶聯(lián)的Ⅱ抗在室溫下孵育2 h。最后，染DAPI并在顯微鏡下觀察拍照。

2.9 明膠酶譜實(shí)驗(yàn) 將組織裂解后離心取上清液，提取總蛋白并測定蛋白含量，按照MMP-9 明膠酶譜試劑盒進(jìn)行操作，蛋白上樣后進(jìn)行SDS-PAGE 分離，電泳結(jié)束后將凝膠置于洗脫液中洗去SDS，常溫下孵育過夜，再經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色，最后凝膠成像。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 9.1.2 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間對(duì)比使用t檢驗(yàn)，多組間比較使用方差分析和Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 鼻竇炎患者IL-17A表達(dá)水平

從CRSwNP 患者和對(duì)照組受試者中獲得相應(yīng)組織，并采用ELISA以及RT-PCR方法對(duì)IL-17A的表達(dá)水平進(jìn)行分析。從圖1A 中我們可以看出，與對(duì)照組相比，CRSsNP 患者的IL-17A 表達(dá)水平呈上升趨勢（P＜0.01）。同樣在CRSsNP 患者的鼻息肉組織中也發(fā)現(xiàn)IL-17A 的mRNA 較對(duì)照組表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），見圖1B。與ELISA 和RT-qPCR 的研究結(jié)果一致，免疫組織化學(xué)染色顯示，與對(duì)照組相比，CRswNP 患者中IL-17A 陽性表達(dá)在鼻息肉組織中明顯增加，見圖1C。

2 鼻竇炎患者M(jìn)MP-9表達(dá)水平

Figure 1. The expression of Il-17A in control patients and CRSwNP patients. A：the concentration of IL-17A in tissue supernatant was determined by ELISA；B：the mRNA expression of IL-17A was detected by RTPCR；C：immunohistochemical staining results of IL-17A in different groups（×200）. Mean±SD. n=15.**P＜0.01 vs control group.圖1 對(duì)照組患者和CRSwNP患者中IL-17A的表達(dá)

用ELISA 法和RT-qPCR 法檢測不同患者對(duì)應(yīng)組織中MMP-9 的表達(dá)，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，CRSwNP 患者鼻息肉組織中MMP-9濃度及MMP-9的mRNA 表達(dá)明顯升高（P＜0.01），見圖2A、B。明膠酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，與對(duì)照組相比，CRSwNP 患者M(jìn)MP-9 活性也明顯升高，見圖2C。我們?cè)贑RSwNP患者鼻息肉及對(duì)照組患者鉤突組織HE 染色中發(fā)現(xiàn)CRSwNP 較對(duì)照組炎癥細(xì)胞表達(dá)明顯增多，見圖2D。同時(shí)，我們還在兩組患者的組織化學(xué)染色中發(fā)現(xiàn)CRSwNP 患者較對(duì)照組患者的MMP-9 表達(dá)顯著增加，見圖2E。

3 鼻竇炎患者M(jìn)APK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

Figure 2. Expression of MMP-9 in control and CRSwNP patients. A：the concentration of MMP-9 in tissue supernatant was measured by ELISA；B：the mRNA expression of MMP-9 was detected by RT-qPCR；C：the activity of MMP-9 in different groups；D：HE staining was used to observe the infiltration of inflammatory cells in different groups（×200）；E：immunohistochemical staining results of MMP-9（×200）. Mean±SD. n=15.**P＜0.01 vs control group.圖2 對(duì)照組患者和CRSwNP患者中MMP-9的表達(dá)

通過Western blot 檢測了對(duì)照組鉤突和CRSwNP患者鼻息肉中ERK1/2、JNK 和p38 的磷酸化水平，結(jié)果顯示，CRSwNP 患者鼻息肉中 ERK1/2 和 p38 的磷酸化水平較對(duì)照組均上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），見圖3A。隨后我們將鼻息肉組織進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，在分離出的鼻息肉成纖維細(xì)胞中分別加入p38 MAPK的抑制劑SB（SB203580）及ERK1/2 的抑制劑PD（PD98059），處理 12 h 后用 Western blot 檢測 MMP-9的表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)SB 或PD 處理后MMP-9 的表達(dá)明顯降低（P＜0.01），見圖3B。

Figure 3. MAPK expression in control and CRSwNP patients.A：the phosphorylation of MAPK pathway in different groups was determined by Western blot；B：the expression of MMP-9 in nasal polyp fibroblasts treated with SB or PD. Mean±SD. n=15.**P＜0.01 vs control group.圖3 對(duì)照組患者和CRSwNP患者中MAPK的表達(dá)

4 IL-17A誘導(dǎo)HNEpCs中MMP-9蛋白的表達(dá)

為探索IL-17A 是否可以提高HNEpCs 中MMP-9的分泌。我們用 IL-17A（0～50 μg/L）處理 HNEpCs 24 h，然后采用Western blot 和免疫熒光檢測MMP-9蛋白表達(dá)。結(jié)果與我們的預(yù)期相同，MMP-9 的蛋白表達(dá)在IL-17A 作用下均升高，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，50 μg/L或許是IL-17A的最佳濃度（P＜0.01），見圖4。

Figure 4. Expression of MMP-9 protein in IL-17A-treated HNEpCs. A：the expression of MMP-9 protein in HNEpCs treated with IL-17A was determined by Western blot；B：immunofluorescence staining was performed to detect MMP-9 protein. Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖4 IL-17A處理的HNEpCs中MMP-9蛋白的表達(dá)

5 IL-17A通過p38 MAPK/ERK途徑上調(diào)HNEpCs中MMP-9的表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，用 IL-17A 刺激 HNEpCs可誘導(dǎo)ERK1/2 和p38 的有效活化，見圖5A。為了確定p38 MAPK/ERK 信號(hào)的激活是否有助于IL-17A 促進(jìn) MMP-9 的產(chǎn)生，HNEpCs 與 SB 或 PD 預(yù)孵育，然后進(jìn)行IL-17A 刺激。結(jié)果顯示，用SB 或PD 預(yù)孵育可減 弱 HNEpCs 中 IL-17A 促 進(jìn) 的 MMP-9 表 達(dá)（P＜0.01），見圖5B。這表明p38 MAPK/ERK 信號(hào)參與了HNEpCs中IL-17A誘導(dǎo)的MMP-9生成。

討 論

慢性鼻竇炎是一種復(fù)雜的上氣道疾病，與各種細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子有關(guān)。目前，CRSwNP 的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其在標(biāo)準(zhǔn)化治療后的復(fù)發(fā)傾向仍是臨床上無法攻克的難題。CRSwNP 影響生活質(zhì)量，需要大量的醫(yī)療資源［13］。因此，為了進(jìn)一步研究CRSwNP的發(fā)病機(jī)制，探索可能的治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

Figure 5. Expression of MAPK pathway-related proteins in IL-17A-treated HNEpCs. A：the phosphorylation of MAPK pathway in HNEpCs treated with IL-17A was determined by Western blot；B：the expression of MMP-9 protein in HNEpCs pretreated with SB or PD. Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs IL-17A treatment alone.圖5 IL-17A處理的HNEpCs中MAPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

IL-17A，是IL-17 細(xì)胞因子家族中最重要的成員，其主要生物學(xué)效應(yīng)是促進(jìn)炎癥反應(yīng)［14］。我們的研究表明，通過 ELISA 和 RT-PCR 檢測，CRSwNP 患者鼻粘膜中IL-17A的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，同時(shí)，我們通過免疫組化對(duì)兩組患者的組織進(jìn)行染色，免疫組織染色結(jié)果與ELISA 和RT-qPCR 一致，以上結(jié)果均表明IL-17A 參與了CRSwNP 的發(fā)病機(jī)制。CRSwNP 中組織重塑的主要因素之一是ECM 成分被蛋白水解酶降解，而MMP-9 的抑制不足或異常增高可能導(dǎo)致ECM 降解，從而形成息肉［4］。當(dāng)前的研究中，我們通過發(fā)現(xiàn)CRSwNP 中的MMP-9 表達(dá)比對(duì)照組明顯升高，以上結(jié)果表明MMP-9 可能是慢性鼻竇炎的重要治療靶點(diǎn)。同時(shí)HE 染色結(jié)果中我們還發(fā)現(xiàn)CRSwNP 較對(duì)照組組織炎癥浸潤明顯。作為MMPs抑制劑之一，強(qiáng)力霉素已被證明能有效降低鼻分泌物中MMP-9 的表達(dá)，最終縮小息肉的大?。?5］。研究還表明，功能性內(nèi)窺鏡鼻竇手術(shù)（functional endoscopic sinus surgery，F(xiàn)ESS）后MMP-9的高濃度與不良治療結(jié)果有關(guān)，多西環(huán)素緩釋鼻竇支架已被證明可有效降低鼻MMP-9的濃度，提高FESS后患者的治療效果［16］。此外，MMP-9 與 IL-1、TNF-α、VEGF 關(guān)系密切，IL-1大量存在于炎性組織中，可誘導(dǎo)并與TNF-α 結(jié)合，引起 MMPs 家族產(chǎn)生，同時(shí)，TNF-α、IL-1 和MMP-9彼此之間相互作用、相互影響。而IL-17可以協(xié)同 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等，促進(jìn)炎癥發(fā)生發(fā)展。因此，CRSwNP 中MMP-9 的上游調(diào)節(jié)因子十分值得研究。

P38MAPK/ERK 通路調(diào)控一系列細(xì)胞生物學(xué)行為，但該通路在CRS 中的作用仍然未知。因此我們檢測了兩組患者組織中的ERK1/2、JNK 及p38 磷酸化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRSwNP 較對(duì)照組ERK1/2 和p38磷酸化增加。同時(shí)我們還培養(yǎng)了CRSwNP 鼻息肉成纖維原代細(xì)胞并分別使用ERK1/2 和p38 抑制劑處理，我們的結(jié)果表明，經(jīng)抑制劑處理的鼻息肉成纖維細(xì)胞MMP-9表達(dá)明顯降低。

此外，根據(jù)上述結(jié)果，我們推測IL-17A在CRS粘膜上皮中與MMP-9 共定位，為進(jìn)一步探究鼻上皮細(xì)胞中重塑的機(jī)制。我們用IL-17A 處理HNEpCs 并檢測MMP-9 的產(chǎn)生。正如預(yù)期的那樣，IL-17A 刺激可促進(jìn) HNEpCs 中 MMP-9 的生成，其濃度以 50 μg/L 為宜。作為MAPK通路的一個(gè)亞類，p38和ERK信號(hào)通路也被一系列磷酸化事件激活，以響應(yīng)細(xì)胞外刺激，然后傳遞細(xì)胞外信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化和存活。在我們目前的研究中，我們證明了IL-17A 可有效誘導(dǎo)HNEpCs中p38和ERK1/2的磷酸化以及MMP-9的表達(dá)。此外，有證據(jù)表明MAPK 信號(hào)通路可促進(jìn)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞中MMP-9 的產(chǎn)生［17-18］。我們的結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)在HNEpCs 中這種MMP-9 的過度表達(dá)可通過ERK1/2、p38 途徑特異性抑制劑 SB203580 和 PD98059 消除。以上研究結(jié)果表明，HNEpCs 中由IL-17A 激活的MMP-9表達(dá)異常升高由p38/ERK信號(hào)介導(dǎo)。

總之，本研究的結(jié)果表明，CRSwNP 中的局部炎癥環(huán)境可能會(huì)誘導(dǎo)IL-17A的表達(dá)。IL-17A通過激活鼻上皮細(xì)胞中的p38/ERK通路活化使MMP-9表達(dá)過度增加，阻滯p38/ERK 通路的活化可能會(huì)緩解鼻竇炎伴鼻息肉組織重塑。