付似鳳， 馬曉春， 李 旭

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧沈陽110001）

膿毒癥是宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)引起的多器官功能障礙，是一種危及生命的臨床綜合征［1］。盡管醫(yī)學(xué)水平不斷提高，仍缺乏有效的治療方法。研究表明，組蛋白是促進(jìn)膿毒癥發(fā)生發(fā)展的主要介質(zhì)［2］，尤其是導(dǎo)致急性肺損傷的主要因素［3］。然而，組蛋白在膿毒癥中具體的作用機(jī)制仍未明了。

近年來，多糖包被（glycocalyx）在膿毒癥中的意義受到廣泛關(guān)注。多糖包被是一層富含硫酸肝素的糖胺聚糖和蛋白聚糖，排列在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定性［4］。多糖包被和內(nèi)皮細(xì)胞是隔離血液和組織的第一道屏障，也是機(jī)體在膿毒癥時(shí)最先受累的部位。膿毒癥時(shí)，多糖包被大量降解，內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致凝血活化，血管通透性增加，組織水腫，白細(xì)胞游走到血管外等，進(jìn)而發(fā)生器官功能障礙，甚至導(dǎo)致患者死亡。黏結(jié)蛋白聚糖1（syndecan-1）是多糖包被的主要成分，膿毒癥時(shí)被釋放到血液中［5］。研究表明syndecan-1 水平能夠預(yù)測(cè)感染性休克患者90 d 病死率［6］。由此可見，多糖包被結(jié)構(gòu)與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

普通肝素（unfractionated heparin，UFH）是一種以抗凝血特性而聞名的糖胺聚糖。在膿毒癥中除了抗凝作用外，還具有多種生物學(xué)活性，包括抑制炎癥因子的產(chǎn)生和釋放、保護(hù)多糖包被、降低血管通透性等［7-8］。本課題組前期研究表明，組蛋白能造成小鼠類似膿毒癥樣改變，普通肝素減輕組蛋白造成的肺損傷和凝血活化，進(jìn)而抑制組蛋白的毒性［9］。然而，具體的作用機(jī)制尚不清楚。鑒于多糖包被破壞在膿毒癥過程中的意義，及其在膿毒癥凝血活化中的關(guān)鍵作用，組蛋白是膿毒癥過程中重要的介質(zhì)，但組蛋白是否破壞多糖包被進(jìn)而影響凝血功能，目前尚未見報(bào)道。因此，本研究旨在探討組蛋白對(duì)小鼠肺組織多糖包被的破壞及對(duì)肺凝血活化的影響，并探討普通肝素的保護(hù)作用及機(jī)制，從而為其在膿毒癥中的應(yīng)用提供參考資料。

材料和方法

1 動(dòng)物

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 32 只健康雄性 SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠，質(zhì)量20～25 g，8～12 周齡，均購于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（遼）2015-0001。實(shí)驗(yàn)前于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)1 周，常規(guī)飼料及飲水，晝夜交替12 h。將32 只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對(duì)照（control）組、普通肝素（UFH）組、組蛋白（histone）組及組蛋白+普通肝素（histone+UFH）組，每組8 只。所有的實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，按照中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。（審批號(hào)：CMU2021066）

1.2 模型制備及處理 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛥⒄涨捌谘芯浚?］。組蛋白組經(jīng)小鼠尾靜脈注射組蛋白（H9250）50 mg/kg；組蛋白+普通肝素組在注射組蛋白1 h 后經(jīng)小鼠尾靜脈注射普通肝素400 U/kg；普通肝素組給予普通肝素400 U/kg；對(duì)照組均給予等量生理鹽水。

1.3 標(biāo)本采集及處理 組蛋白注射4 h 后麻醉小鼠并迅速開胸取雙肺，左肺測(cè)定檢測(cè)組織因子（tissue factor，TF）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）和syndecan-1 的mRNA 表達(dá)水平。取右肺上葉測(cè)定syndecan-1 的熒光表達(dá)水平；取右肺中葉立即置4%多聚甲醛中固定72 h，待病理學(xué)觀察；取右肺下葉測(cè)定syndecan-1的蛋白表達(dá)水平；余肺葉立即置于無酶小離心管中，液氮保存24 h 后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱留存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 肺組織病理學(xué)觀察 將充分固定的右肺經(jīng)梯度乙醇（70%、80%、90%、95%、100%及100%）脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后制片。將組織用切片機(jī)切成5 μm 連續(xù)切片以備染色。之后二甲苯脫蠟，蘇木素核染色3 min，自來水清洗，1%的鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，伊紅染色2 min，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，晾干后中性樹膠封片。蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，于光鏡下觀察小鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變，并選取6～8 個(gè)隨機(jī)視野分別就肺泡和間質(zhì)炎癥（白細(xì)胞浸潤(rùn)）、肺泡和間質(zhì)水腫、肺泡壁增厚以及透明膜形成進(jìn)行0～2 分半定量分析，累計(jì)各項(xiàng)評(píng)分的總分作為肺組織病理學(xué)評(píng)分［10］。

2.2 RT-qPCR 測(cè)定 TF、FIB 和 syndecan-1 的 mRNA表達(dá)水平 按照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，DEPC 水溶解，NanoDrop 進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟將所提RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，4 ℃保存，用于qPCR 反應(yīng)。每個(gè)樣本最少重復(fù)3 次，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 45 s，40 個(gè)循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)步驟均遵循TB Green Premix Ex TapII 試劑盒（TaKaRa）。內(nèi)參選用3-磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde Phosphate Dehydrogenase ，GAPDH），引物設(shè)計(jì)及合成由上海生工生物工程公司完成（表1）。使用2-ΔΔCT法計(jì)算TF、FIB和syndecan-1 mRNA 的表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

2.3 Western blot 檢測(cè)syndecan-1 在肺組織的蛋白水平 采用異氟烷吸入麻醉小鼠，取右肺下葉。采用蛋白提取試劑盒（Beyotime）提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白，采用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒（Beyotime）測(cè)定其濃度。將等量的蛋白質(zhì)裝入每孔（每孔30 μg），通過8%SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。PVDF 膜用 TBST 洗滌（10 min ×3），然后用5%脫脂牛奶孵育2 h。PVDF 膜與稀釋的Ⅰ抗（syndecan-1 和GAPDH）4°孵育過夜。用TBST 再次洗滌PVDF 膜，與酶標(biāo)山羊抗兔IgG 在37 ℃孵育 2 h，ECL 化學(xué)液（Beyotime）顯示 PVDF 膜上的蛋白帶。成像儀掃描，應(yīng)用圖像分析軟件（IamgeJ）進(jìn)行分析。以GAPDH 蛋白表達(dá)為內(nèi)參照，以目的蛋白和GAPDH 條帶密度的比值表示目的蛋白的相對(duì)含量（灰度值比值=syndecan-1灰度值/GAPDH灰度值）。

2.4 免疫熒光檢測(cè)肺組織中syndecan-1的表達(dá) 我們?cè)? μm 肺冰凍切片上進(jìn)行處理，先用丙酮固定，在用PBS 洗滌切片，然后用抗syndecan-1 抗體37°恒溫箱孵1 h。然后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗切片，用FITC 結(jié)合的Ⅱ抗室溫孵育30 min。最后用DAPI染色細(xì)胞核。圖像由熒光顯微鏡（Olympus BX53）獲得。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Graph-Pad Prism 8 軟件作圖。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間均數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析或單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較方差齊時(shí)采用最小顯著性差異法（LSD-t檢驗(yàn)），方差不齊時(shí)采用Brown-Forsythe 和Welch ANOVE檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 普通肝素對(duì)組蛋白誘導(dǎo)的肺組織病理學(xué)改變的影響

HE 染色顯示，對(duì)照組和普通肝素組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡及毛細(xì)血管壁薄，肺泡腔無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，兩組肺組織病理學(xué)評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而組蛋白表現(xiàn)為肺泡間隔增寬，肺泡壁增厚，肺間質(zhì)和肺泡腔出現(xiàn)炎癥細(xì)胞，透明膜形成和紅細(xì)胞大量滲出，肺組織病理學(xué)評(píng)分顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；與組蛋白組相比，組蛋白+普通肝素組肺組織的肺泡結(jié)構(gòu)可以辨認(rèn)，肺泡間隔增寬、肺泡壁增厚和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均有所減輕，肺組織病理學(xué)評(píng)分顯著降低（P＜0.01），見圖1。

Figure 1. Representative photomicrograph of lung tissues（HE staining，scale bar=20 μm）and the histopathological scores of lung tissues in each group. The lung tissue showed complete alveolar structure in control group and unfractionated heparin（UFH）group. The lung tissue was significantly damaged in histone group，while the lung damage was significantly alleviated in histone+UFH group.圖1 光鏡下觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)改變

2 普通肝素對(duì)組蛋白誘導(dǎo)的肺組織TF、FIB 和syndecan-1 mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示（表2），組蛋白組肺組織TF的mRNA 表達(dá)量較對(duì)照組的顯著升高（P＜0.01）；組蛋白+普通肝素組TFmRNA 表達(dá)量約為對(duì)照組的3.57 倍（P＜0.01），但較組蛋白組顯著降低（P＜0.01）。組蛋白組肺組織FIB的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）；組蛋白+普通肝素組FIB 的mRNA 表達(dá)量約為對(duì)照組的9.72 倍（P＜0.01），但較組蛋白組顯著降低（P＜0.01）。為進(jìn)一步明確多糖包被的參與，我們檢測(cè)syndecan-1 mRNA 水平的變化。結(jié)果組蛋白組肺組織syndecan-1 的mRNA 表達(dá)量較對(duì)照組的降低（P＜0.01）；組蛋白+普通肝素組syndecan-1 的 mRNA 表達(dá)量約為對(duì)照組的 0.74 倍（P＜0.01），但較組蛋白組顯著升高（P＜0.01）。

表2 各組小鼠RT-qPCR結(jié)果Table 2. The results of RT-qPCR（Mean±SD. n=8）

3 普通肝素對(duì)組蛋白誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠syndecan-1蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，組蛋白刺激后肺組織syndecan-1 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；而普通肝素處理后，組蛋白刺激的肺組織syndecan-1的表達(dá)顯著升高（P＜0.01），見圖2。

Figure 2. The protein expression of syndecan-1 in each group was detected by Western blot. UFH：unfractionated heparin. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；##P＜0.01 vs histone group.圖2 Western blot檢測(cè)各組小鼠肺組織syndecan-1蛋白表達(dá)

4 免疫熒光染色檢測(cè)普通肝素對(duì)組蛋白誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠syndecan-1表達(dá)的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，對(duì)照組肺組織可見syndecan-1陽性表達(dá)；組蛋白組多處血管內(nèi)皮細(xì)胞有少量syndecan-1 陽性表達(dá)，組蛋白刺激后syndecan-1明顯脫落，syndecan-1蛋白在肺組織中表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；而組蛋白+普通肝素組部分血管內(nèi)皮細(xì)胞syndecan-1陽性表達(dá)較組蛋白組增多，普通肝素減少了組蛋白刺激的syndecan-1 脫落，syndecan-1的表達(dá)水平較組蛋白組顯著升高（P＜0.01），見圖3。

討 論

通過對(duì)組蛋白損傷小鼠模型的研究，我們證實(shí)組蛋白可導(dǎo)致小鼠肺損傷和肺凝血活化，表現(xiàn)為肺組織TF 和FIB 的mRNA 水平增高，進(jìn)一步研究組蛋白毒性的機(jī)制，證實(shí)組蛋白增加多糖包被降解，表現(xiàn)為肺組織syndecan-1 mRNA 水平和蛋白水平及其在肺組織的表達(dá)均減少。組蛋白已經(jīng)導(dǎo)致?lián)p傷后，普通肝素仍能發(fā)揮保護(hù)作用，抑制肺組織syndecan-1的降解，進(jìn)而抑制肺凝血活化，減輕肺損傷嚴(yán)重程度，發(fā)揮保護(hù)作用。

膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）患者常見的臨床綜合征，發(fā)病率及病死率高，存活患者也因各種并發(fā)癥導(dǎo)致生存質(zhì)量顯著下降［11-12］。因此，深入了解膿毒癥的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療方法至關(guān)重要。包括炎癥、免疫和凝血功能障礙等多系統(tǒng)參與，涉及細(xì)胞功能、代謝和微循環(huán)的改變［13-15］，內(nèi)皮細(xì)胞損傷和微血栓形成是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的兩個(gè)主要部分［16］。組蛋白是存在于所有真核細(xì)胞中的陽離子蛋白，是核染色質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)組成部分。細(xì)胞外組蛋白具有細(xì)胞毒性，可導(dǎo)致免疫損傷［17］。據(jù)報(bào)道，膿毒癥患者循環(huán)中組蛋白濃度與病死率正相關(guān)［18］。組蛋白還能夠造成小鼠發(fā)生類似膿毒癥樣改變，直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，活化凝血［19］。在急性肺損傷中，細(xì)胞外組蛋白是組織損傷和炎癥的重要效應(yīng)物，且組織損傷的程度與血栓形成的數(shù)量和時(shí)間呈正相關(guān)［20］。因此，組蛋白被認(rèn)為是膿毒癥過程中的關(guān)鍵介質(zhì)［2］，可能成為膿毒癥新的生物標(biāo)記物以及治療的干預(yù)靶點(diǎn)。TF 和FIB 是參與機(jī)體凝血反應(yīng)的重要因子，TF作為膿毒癥凝血活化的始動(dòng)因素，促進(jìn)凝血酶的生成，進(jìn)而導(dǎo)致FIB 轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，加速血液凝固，形成血栓。本研究首先檢測(cè)組蛋白刺激下肺組織TF 和FIB mRNA 的表達(dá)情況，以明確組蛋白對(duì)凝血的活化的影響。結(jié)果表明，在給予組蛋白刺激后，小鼠發(fā)生了明顯的肺損傷、肺凝血活化，與前期報(bào)道一致。我們進(jìn)一步研究了組蛋白導(dǎo)致肺損傷及凝血活化的機(jī)制。

血管內(nèi)皮表面覆蓋一層絨毛樣結(jié)構(gòu)叫做多糖包被［21-22］。生理情況下，多糖包被保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與調(diào)節(jié)凝血穩(wěn)態(tài)和血管通透性等過程［23］。Wiesinger 等通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在膿毒癥模型中，多糖包被的厚度明顯降低［24］。膿毒癥時(shí)，多糖包被首先被破壞脫落入血。研究報(bào)道，膿毒癥患者血漿中可檢測(cè)到脫落的多糖包被成分，如syndecan-1和透明質(zhì)酸，且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)［25-26］。因此，多糖包被參與膿毒癥發(fā)生發(fā)展，然而組蛋白是否能夠破壞多糖包被，進(jìn)而活化凝血，至今未見報(bào)道。本研究證實(shí)組蛋白造成小鼠肺組織syndecan-1降解，影響其mRNA 和蛋白表達(dá)，提示組蛋白可能通過破壞多糖包被進(jìn)而活化凝血。普通肝素減少組蛋白造成的多糖包被破壞，減輕凝血活化，抑制組蛋白的毒性。

普通肝素不僅僅是一種抗凝劑［8］。多項(xiàng)臨床研究、膿毒癥動(dòng)物模型和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)都證明了普通肝素在膿毒癥過程中發(fā)揮多種生物學(xué)活性［27-28］。本課題組前期研究表明普通肝素具有抗炎、改善內(nèi)皮細(xì)胞通透性、減輕組蛋白毒性等多種生物學(xué)活性［29］。本研究中普通肝素可以減輕組蛋白介導(dǎo)的多糖包被損傷，抑制凝血活化，其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能是多方面的：第一，組蛋白帶有正電荷，普通肝素帶有負(fù)電荷，組蛋白能與帶有10 個(gè)以上的硫酸肝素側(cè)鏈的分子結(jié)合［30］。因此，普通肝素可能通過與胞外組蛋白直接結(jié)合，拮抗蛋白毒性，減輕其對(duì)多糖包被和內(nèi)皮細(xì)胞的損傷；第二，膿毒癥時(shí)肝素酶等生成增加，介導(dǎo)多糖包被成分硫酸乙酰肝素（HS）重構(gòu)，促進(jìn)多糖包被降解，普通肝素和HS 結(jié)構(gòu)相似，對(duì)肝素酶有抑制作用［31］，因此，普通肝素可能通過抑制肝素酶保護(hù)多糖包被；第三，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9可以直接破壞多糖包被，普通肝素抑制MMP 活性，可能通過抑制MMP-9 進(jìn)而保護(hù)多糖包被［32］。因此，普通肝素對(duì)組蛋白介導(dǎo)的多糖包被的保護(hù)作用機(jī)制還有待深入研究。

組蛋白是膿毒癥的重要介質(zhì)之一，本研究在組蛋白作用1 h 后給予普通肝素，更接近臨床過程，以往的研究大多普通肝素預(yù)處理或與組蛋白同時(shí)注射［33-34］。多糖包被在膿毒癥中的作用越來越受到關(guān)注，本研究證實(shí)普通肝素可以抑制組蛋白造成的多糖包被降解，發(fā)揮保護(hù)作用，因此可能為普通肝素的膿毒癥中的應(yīng)用提供參考資料。本項(xiàng)工作的局限之處：研究證實(shí)組蛋白能造成小鼠多糖包被損傷，普通肝素能夠有效抑制組蛋白的毒性作用，但普通肝素對(duì)多糖包被的保護(hù)作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究；本項(xiàng)工作僅觀察了組蛋白損傷的單一時(shí)點(diǎn)（4 h），對(duì)于不同時(shí)間點(diǎn)多糖包被的動(dòng)態(tài)變化以及普通肝素的保護(hù)作用值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本項(xiàng)工作證實(shí)組蛋白可導(dǎo)致小鼠肺損傷、凝血活化及肺組織多糖包被破壞；普通肝素能有效減輕組蛋白誘導(dǎo)的小鼠肺損傷、凝血活化和肺組織多糖包被破壞。