江振濤， 魏讀輝， 馬小峰， 李招兵

（南華大學附屬南華醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南衡陽421002）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是一種前期由病毒感染引起的心肌局限性或彌漫性病變，可導致心肌損傷，影響心肌細胞能量代謝［1］。近年來VMC 的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢，感染的急性和慢性階段均對患者構(gòu)成致命威脅。目前VMC 的確切機制并不清楚且缺少特異的治療藥物，治療方案常以減少心肌負擔、改善心肌營養(yǎng)和消除炎癥為主［2］。炎癥反應的激活及炎性細胞的浸潤在VMC 的心肌損傷過程中發(fā)揮著重要作用，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其信號通路的激活能夠誘導細胞因子、炎癥介質(zhì)等多種基因轉(zhuǎn)錄，參與炎癥反應和細胞凋亡等病理生理過程［3-4］。既往研究表明［5-7］，VMC 模型小鼠的 NF-κB 信號通路被激活，而抑制其激活可減輕病毒感染導致的心肌損傷和心肌細胞凋亡。重樓為百合科重樓屬植物根莖，主要化學成分為甾體皂苷。重樓皂苷I（polyphyllin I，PPI）是重樓中的主要活性成分［8］，大量研究表明PPI 可通過NF-κB 介導的炎癥通路發(fā)揮抗炎作用［9-10］，但 PPI 對 VMC 的治療作用及其作用機制鮮有研究報道。本研究擬采用柯薩奇病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3）感染構(gòu)建VMC 小鼠模型，探討PPI在VMC 小鼠體內(nèi)發(fā)揮的抗炎作用和具體調(diào)控機制，為PPI的研發(fā)和臨床應用提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 75 只雄性BALB/c 小鼠，無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級別，4～5 周齡，體重16～18 g，由南華大學動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證編號為SCXK（湘）2015-0002。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～25 ℃，相對濕度為45～65%，日光燈采光，12 h明暗交替。

1.2 主要藥物及試劑 PPI（純度≥98%）購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；利巴韋林片購自江西匯仁藥業(yè)有限公司；CVB3 嗜心肌Nancy 標準株購自美國標準菌種保存中心；BCA（bicinchonininc acid）蛋白濃度測定試劑盒和蘇木素伊紅（hematoxylineosin，HE）染色試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；白細胞介素 6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、心肌肌鈣蛋白 I（cardiac troponin I，cTnI）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）和肌紅蛋白（myoglobin，Mb）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、IκBα、p-IκBα（Ser32）、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）和GAPDH抗體購于Abcam。

2 方法

2.1 動物造模與實驗分組 75 只BALB/c 小鼠隨機分成正常對照（control）組、VMC 模型（VMC）組、陽性藥物利巴韋林（RBV，0.02 g·kg-1·d-1）組、重樓皂苷Ⅰ低劑量（L-PPI，75 mg·kg-1·d-1）組和重樓皂苷Ⅰ高劑量（H-PPI，300 mg·kg-1·d-1）組，每組 15 只。采用腹腔注射 0.15 mL 1×10-8TCID50/mL CVB3 病毒液建立病毒性心肌炎小鼠模型［11］。造模后2 h 通過腹腔注射給藥，給藥體積0.25 mL，每天1 次，連續(xù)給藥1周，其中對照組和模型組注射等量生理鹽水。

2.2 HE 染色觀察心肌損傷情況 收集各組小鼠心肌組織，生理鹽水漂洗后置于4%多聚甲醛中固定24 h，乙醇逐級脫水后石蠟包埋，切成5 μm 的薄片。按照HE染色試劑盒說明書對切片進行染色，于顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。隨機在每張切片上取5 個視野，計算每個視野區(qū)域炎癥細胞浸潤、壞死的面積占整個視野面積的百分比，0 分：無病變；1 分：≤25%；2分：25～50%；3分：50～75%；4分：＞75%。

2.3 ELISA 法檢測心肌損傷標志物和炎癥因子含量 收集各組小鼠血清和心肌組織，心肌組織剪碎后勻漿離心，收集上清液，按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀在450 nm 波長處測定各孔的吸光度（A）值，根據(jù)標準曲線計算血清中心肌損傷標志物 cTnI、CK-MB 和 Mb 及心肌組織中 IL-6、TNF-α和IL-1β含量。

2.4 RT-qPCR 檢測CVB3 mRNA 表達量 取各組小鼠心肌組織，采用Trizol 法提取各樣本的總RNA 并測定總RNA 濃度和純度。取2 μg 總RNA 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA 為模板進行RT-qPCR擴增。CVB3 正向引物序列為5’-CGGTACCTTTGTGCGCCTGT-3’，反向引物序列為 5’-CAGGCCGCCAACGCAGCC-3’；GAPDH 正向引物序列為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，反向引物序列為5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’。反應條件為 95 ℃預變性60 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共 40 個循環(huán)。以 GAPDH 為內(nèi)參照，采用 2-△△Ct法計算CVB3 mRNA相對表達量。

2.5 Western blot 檢測心肌組織中相關蛋白表達水平 取各組小鼠心肌組織，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液進行裂解提取總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，取30 μg總蛋白上樣進行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），5%脫脂奶粉溶液室溫封閉3 h，后加入相應的I 抗稀釋液［cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、IκBα、p-IκBα（Ser32）、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）和 GAPDH，1：1 000］，4 ℃過夜孵育，次日以TBST 洗滌后加入相應的辣根酶標記的II 抗，室溫孵育1 h，充分洗滌后加入ECL 發(fā)光液于凝膠成像儀進行曝光拍照，利用ImageJ 圖像分析軟件進行分析，以目的條帶與GAPDH 的灰度值比值作為目的蛋白表達的相對水平。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠心肌組織損傷情況

如圖1 所示，control 組小鼠心肌纖維排列整齊，心肌細胞結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)未見炎癥細胞浸潤；VMC組和L-PPI組小鼠心肌細胞排列紊亂，有明顯的出血和水腫現(xiàn)象，伴有大量炎癥細胞浸潤；H-PPI 和RBV 組小鼠心肌細胞排列趨于規(guī)則，組織中炎癥細胞減少，病理損傷程度顯著減輕。Control 組、VMC 組、RBV組、L-PPI 組和H-PPI 組小鼠心肌組織病理損傷評分分 別 為 0、3.56±0.33、1.44±0.12、3.32±0.20 和1.67±0.16。與control組比較，VMC組小鼠心肌組織病理損傷評分顯著增加（P＜0.01）；與VMC 組比較，H-PPI 和RBV 組小鼠心肌組織病理損傷評分顯著降低（P＜0.01），L-PPI組無顯著變化（P＞0.05）。

Figure 1. Histopathological observation of myocardium in each group（HE staining，scare bar=100 μm）. A：control group；B：VMC group；C：RBV group；D：L-PPI group；E：H-PPI group.圖1 各組小鼠心肌組織病理學觀察

2 各組小鼠心肌組織中CVB3 mRNA表達水平

control 組、VMC 組、RBV 組、L-PPI 組和 H-PPI 組小鼠心肌組織中CVB3 mRNA 相對表達量分別為0、14.07±0.12、2.75±0.06、6.89±0.11 和 13.47±0.10。與control 組比較，VMC 組小鼠心肌組織中CVB3 mRNA 表達量顯著增加（P＜0.01）；與VMC 組比較，H-PPI 和RBV 組小鼠心肌組織中CVB3 mRNA 表達量顯著減少（P＜0.01），而L-PPI 組CVB3 mRNA 表達量無顯著變化（P＞0.05）。

3 各組小鼠血清中心肌損傷標志物含量

如表 1 所示，與 control 組比較，VMC 組小鼠血清中 cTnI、CK-MB 和 Mb 含量顯著增加（P＜0.01）；與VMC 組比較，H-PPI 和 RBV 組小鼠血清中 cTnI、CKMB和Mb含量顯著減少（P＜0.01），L-PPI組無顯著變化（P＞0.05）。

表1 各組小鼠血清中cTnI、CK-MB和Mb含量比較Table 1. Comparison of the serum levels of cTnI，CK-MB and Mb in each group（Mean±SD. n=15）

4 各組小鼠心肌組織中炎癥因子含量

如表 2 所示，與 control 組比較，VMC 組小鼠心肌組織中 IL-6、TNF-α 和 IL-1β 含量顯著增加（P＜0.01）；與 VMC 組比較，H-PPI 和 RBV 組小鼠心肌組織中IL-6、TNF-α 和IL-1β 含量顯著減少（P＜0.01），L-PPI組無顯著變化（P＞0.05）。

表2 各組小鼠心肌組織中IL-6、TNF-α和IL-1β含量比較Table 2. Comparison of the contents of IL-6，TNF-α and IL-1β in myocardium of each group（ng/L. Mean±SD. n=10）

5 各組小鼠心肌組織中凋亡相關蛋白表達水平

如圖 2 和表 3 所示，與 control 組比較，VMC 組小鼠心肌組織中凋亡蛋白cleaved caspase-3和Bax表達水平均顯著上升（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平顯著降低（P＜0.01）；與VMC組比較，H-PPI和RBV組小鼠心肌組織中凋亡蛋白cleaved caspase-3 和Bax表達水平顯著下降（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平顯著增加（P＜0.01），L-PPI 組無顯著變化（P＞0.05）。

Figure 2. The protein levels of cleaved caspase-3，Bax，Bcl-2 in myocardial tissue detected by Western blot.圖2 Western blot 檢測心肌組織中cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達

表3 各組小鼠心肌組織中cleaved caspase-3、Bax 和Bcl-2蛋白表達水平比較Table 3. Comparison of the protein expression levels of cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 in myocardium（Mean±SD.n=10）

6 各組小鼠心肌組織中NF-κB 信號通路相關蛋白表達水平

如圖 3 和表 4 所示，與 control 組比較，VMC 組小鼠心肌組織中p-IκBα（Ser32）和p-NF-κB（Ser536）蛋白表達水平顯著上升（P＜0.01）；與VMC 組比較，HPPI 和 RBV 組小鼠心肌組織中 p-IκBα（Ser32）和 p-NF-κB（Ser536）蛋白表達水平顯著下降（P＜0.01），LPPI組無顯著變化（P＞0.05）。

表4 各組小鼠心肌組織中p-IκBα（Ser32）和p-NF-κB（Ser536）蛋白表達水平比較Table 4. Comparison of the protein expression levels of p-IκBα（Ser32）and p-NF-κB（Ser536）in myocardium（Mean±SD. n=10）

Figure 3. The protein levels of p-IκBα（Ser32）and p-NF-κB（Ser536）in myocardial tissue detected by Western blot.圖3 Western blot 檢測心肌組織中 p-IκBα（Ser32）和 p-NF-κB（Ser536）蛋白表達

討 論

目前臨床上治療VMC 的主要方法有輔助支持療法、免疫療法和抗病毒治療法，但治療效果并不理想。VMC 的發(fā)病機制雖然十分復雜，但已有研究顯示炎癥反應為心肌炎心肌損傷的機制之一［12-13］。研究顯示［14］，許多天然產(chǎn)物在改善心肌損傷及減輕炎癥反應方面具有積極的作用。PPI 是從中藥重樓中提取的甾體皂苷，可通過NF-κB 介導的炎癥通路發(fā)揮抗炎作用［9-10］，但其對VMC的治療作用及其作用機制鮮見報道。本研究結(jié)果顯示，PPI 能夠顯著減少VMC 小鼠心肌組織內(nèi)炎癥細胞浸潤，下調(diào)心肌組織炎癥因子含量，抑制心肌組織細胞凋亡，其機制可能是通過抑制NF-κB信號通路的激活來實現(xiàn)的。

VMC過程中典型的病理變化是心肌組織出現(xiàn)彌散性壞死和炎癥細胞浸潤，同時由于病毒入侵導致心肌細胞的結(jié)構(gòu)被破壞，細胞通透性增強，細胞內(nèi)產(chǎn)生的酶類進入血液循環(huán)中，CK-MB、Mb 和cTnI 是心肌損傷特異性標志物，當心肌出現(xiàn)損傷時其在血液中的含量會迅速增加［15-16］。本研究結(jié)果顯示，VMC小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)破壞，出血和水腫現(xiàn)象明顯，伴有大量炎癥細胞浸潤，血清中CK-MB、Mb 和cTnI 含量顯著增加，與前人研究一致［17-18］，說明 CVB3 誘導的VMC 小鼠模型構(gòu)建成功。PPI 高劑量組小鼠心肌細胞排列趨于規(guī)則，炎癥細胞浸潤范圍局限，壞死區(qū)域小，同時血清中CK-MB、Mb和cTnI含量明顯下降，提示PPI能緩解CVB3誘導的小鼠心肌損傷。

機體免疫功能紊亂是VMC 的重要特征，炎癥是機體抵抗病原入侵、修復組織細胞損傷的重要防御機制，若炎癥反應持續(xù)維持在較高水平則會對細胞造成損傷［19］。IL-6、TNF-α 和 IL-1β 是 VMC 心肌損傷中重要的細胞因子，病毒感染心肌后其表達水平增加，促進炎性細胞浸潤心肌組織從而加重心肌細胞損傷，誘導心肌細胞的凋亡［20］。本研究結(jié)果顯示，VMC 小鼠心肌組織中 IL-6、TNF-α 和 IL-1β 含量顯著增加，凋亡蛋白cleaved caspase-3 和Bax 表達水平增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達水平降低，與魏傲等［21］研究一致。而PPI 高劑量組小鼠心肌組織中炎癥因子含量和凋亡蛋白表達水平均明顯回落，說明PPI能抑制VMC 小鼠心肌組織炎癥反應，減少心肌組織細胞凋亡。

為了進一步闡明PPI 在VMC 小鼠體內(nèi)發(fā)揮抗炎作用的具體機制，本研究通過檢測炎癥相關通路蛋白磷酸化水平來探究PPI發(fā)揮抗炎作用的主要靶點。既往研究表明［5-7］，NF-κB 炎癥通路參與了 VMC 的發(fā)生發(fā)展過程：當細胞感染病毒后，NF-κB 與其抑制蛋白IκBα 解離后激活轉(zhuǎn)入細胞核，誘導趨化因子、細胞因子、炎癥介質(zhì)等多種基因轉(zhuǎn)錄，參與炎癥反應、免疫反應及細胞凋亡等病理生理過程。本研究結(jié)果顯示，VMC 小鼠心肌組織中p-IκBα（Ser32）和p-NF-κB（Ser536）蛋白表達水平明顯增加，PPI高劑量組小鼠心肌組織中p-IκBα（Ser32）和p-NF-κB（Ser536）蛋白表達被顯著抑制，表明PPI可通過抑制NF-κB通路改善VMC小鼠體內(nèi)的炎癥反應。

綜上所述，PPI可通過抑制NF-κB 信號通路的轉(zhuǎn)導，減少心肌組織內(nèi)炎癥細胞浸潤、下調(diào)炎癥因子表達，降低心肌組織細胞凋亡，進而起到保護VMC 小鼠心肌組織的作用。