江振濤， 魏讀輝， 馬小峰， 李招兵

（南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南衡陽421002）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是一種前期由病毒感染引起的心肌局限性或彌漫性病變，可導(dǎo)致心肌損傷，影響心肌細(xì)胞能量代謝［1］。近年來VMC 的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢，感染的急性和慢性階段均對患者構(gòu)成致命威脅。目前VMC 的確切機(jī)制并不清楚且缺少特異的治療藥物，治療方案常以減少心肌負(fù)擔(dān)、改善心肌營養(yǎng)和消除炎癥為主［2］。炎癥反應(yīng)的激活及炎性細(xì)胞的浸潤在VMC 的心肌損傷過程中發(fā)揮著重要作用，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其信號通路的激活能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等多種基因轉(zhuǎn)錄，參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等病理生理過程［3-4］。既往研究表明［5-7］，VMC 模型小鼠的 NF-κB 信號通路被激活，而抑制其激活可減輕病毒感染導(dǎo)致的心肌損傷和心肌細(xì)胞凋亡。重樓為百合科重樓屬植物根莖，主要化學(xué)成分為甾體皂苷。重樓皂苷I（polyphyllin I，PPI）是重樓中的主要活性成分［8］，大量研究表明PPI 可通過NF-κB 介導(dǎo)的炎癥通路發(fā)揮抗炎作用［9-10］，但 PPI 對 VMC 的治療作用及其作用機(jī)制鮮有研究報(bào)道。本研究擬采用柯薩奇病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3）感染構(gòu)建VMC 小鼠模型，探討PPI在VMC 小鼠體內(nèi)發(fā)揮的抗炎作用和具體調(diào)控機(jī)制，為PPI的研發(fā)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 75 只雄性BALB/c 小鼠，無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級別，4～5 周齡，體重16～18 g，由南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號為SCXK（湘）2015-0002。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～25 ℃，相對濕度為45～65%，日光燈采光，12 h明暗交替。

1.2 主要藥物及試劑 PPI（純度≥98%）購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；利巴韋林片購自江西匯仁藥業(yè)有限公司；CVB3 嗜心肌Nancy 標(biāo)準(zhǔn)株購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保存中心；BCA（bicinchonininc acid）蛋白濃度測定試劑盒和蘇木素伊紅（hematoxylineosin，HE）染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；白細(xì)胞介素 6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、心肌肌鈣蛋白 I（cardiac troponin I，cTnI）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）和肌紅蛋白（myoglobin，Mb）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、IκBα、p-IκBα（Ser32）、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）和GAPDH抗體購于Abcam。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模與實(shí)驗(yàn)分組 75 只BALB/c 小鼠隨機(jī)分成正常對照（control）組、VMC 模型（VMC）組、陽性藥物利巴韋林（RBV，0.02 g·kg-1·d-1）組、重樓皂苷Ⅰ低劑量（L-PPI，75 mg·kg-1·d-1）組和重樓皂苷Ⅰ高劑量（H-PPI，300 mg·kg-1·d-1）組，每組 15 只。采用腹腔注射 0.15 mL 1×10-8TCID50/mL CVB3 病毒液建立病毒性心肌炎小鼠模型［11］。造模后2 h 通過腹腔注射給藥，給藥體積0.25 mL，每天1 次，連續(xù)給藥1周，其中對照組和模型組注射等量生理鹽水。

2.2 HE 染色觀察心肌損傷情況 收集各組小鼠心肌組織，生理鹽水漂洗后置于4%多聚甲醛中固定24 h，乙醇逐級脫水后石蠟包埋，切成5 μm 的薄片。按照HE染色試劑盒說明書對切片進(jìn)行染色，于顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。隨機(jī)在每張切片上取5 個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野區(qū)域炎癥細(xì)胞浸潤、壞死的面積占整個(gè)視野面積的百分比，0 分：無病變；1 分：≤25%；2分：25～50%；3分：50～75%；4分：＞75%。

2.3 ELISA 法檢測心肌損傷標(biāo)志物和炎癥因子含量 收集各組小鼠血清和心肌組織，心肌組織剪碎后勻漿離心，收集上清液，按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測定各孔的吸光度（A）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中心肌損傷標(biāo)志物 cTnI、CK-MB 和 Mb 及心肌組織中 IL-6、TNF-α和IL-1β含量。

2.4 RT-qPCR 檢測CVB3 mRNA 表達(dá)量 取各組小鼠心肌組織，采用Trizol 法提取各樣本的總RNA 并測定總RNA 濃度和純度。取2 μg 總RNA 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。CVB3 正向引物序列為5’-CGGTACCTTTGTGCGCCTGT-3’，反向引物序列為 5’-CAGGCCGCCAACGCAGCC-3’；GAPDH 正向引物序列為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，反向引物序列為5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’。反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共 40 個(gè)循環(huán)。以 GAPDH 為內(nèi)參照，采用 2-△△Ct法計(jì)算CVB3 mRNA相對表達(dá)量。

2.5 Western blot 檢測心肌組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取各組小鼠心肌組織，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液進(jìn)行裂解提取總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，取30 μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），5%脫脂奶粉溶液室溫封閉3 h，后加入相應(yīng)的I 抗稀釋液［cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、IκBα、p-IκBα（Ser32）、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）和 GAPDH，1：1 000］，4 ℃過夜孵育，次日以TBST 洗滌后加入相應(yīng)的辣根酶標(biāo)記的II 抗，室溫孵育1 h，充分洗滌后加入ECL 發(fā)光液于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，利用ImageJ 圖像分析軟件進(jìn)行分析，以目的條帶與GAPDH 的灰度值比值作為目的蛋白表達(dá)的相對水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠心肌組織損傷情況

如圖1 所示，control 組小鼠心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤；VMC組和L-PPI組小鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，有明顯的出血和水腫現(xiàn)象，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤；H-PPI 和RBV 組小鼠心肌細(xì)胞排列趨于規(guī)則，組織中炎癥細(xì)胞減少，病理損傷程度顯著減輕。Control 組、VMC 組、RBV組、L-PPI 組和H-PPI 組小鼠心肌組織病理損傷評分分 別 為 0、3.56±0.33、1.44±0.12、3.32±0.20 和1.67±0.16。與control組比較，VMC組小鼠心肌組織病理損傷評分顯著增加（P＜0.01）；與VMC 組比較，H-PPI 和RBV 組小鼠心肌組織病理損傷評分顯著降低（P＜0.01），L-PPI組無顯著變化（P＞0.05）。

Figure 1. Histopathological observation of myocardium in each group（HE staining，scare bar=100 μm）. A：control group；B：VMC group；C：RBV group；D：L-PPI group；E：H-PPI group.圖1 各組小鼠心肌組織病理學(xué)觀察

2 各組小鼠心肌組織中CVB3 mRNA表達(dá)水平

control 組、VMC 組、RBV 組、L-PPI 組和 H-PPI 組小鼠心肌組織中CVB3 mRNA 相對表達(dá)量分別為0、14.07±0.12、2.75±0.06、6.89±0.11 和 13.47±0.10。與control 組比較，VMC 組小鼠心肌組織中CVB3 mRNA 表達(dá)量顯著增加（P＜0.01）；與VMC 組比較，H-PPI 和RBV 組小鼠心肌組織中CVB3 mRNA 表達(dá)量顯著減少（P＜0.01），而L-PPI 組CVB3 mRNA 表達(dá)量無顯著變化（P＞0.05）。

3 各組小鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物含量

如表 1 所示，與 control 組比較，VMC 組小鼠血清中 cTnI、CK-MB 和 Mb 含量顯著增加（P＜0.01）；與VMC 組比較，H-PPI 和 RBV 組小鼠血清中 cTnI、CKMB和Mb含量顯著減少（P＜0.01），L-PPI組無顯著變化（P＞0.05）。

表1 各組小鼠血清中cTnI、CK-MB和Mb含量比較Table 1. Comparison of the serum levels of cTnI，CK-MB and Mb in each group（Mean±SD. n=15）

4 各組小鼠心肌組織中炎癥因子含量

如表 2 所示，與 control 組比較，VMC 組小鼠心肌組織中 IL-6、TNF-α 和 IL-1β 含量顯著增加（P＜0.01）；與 VMC 組比較，H-PPI 和 RBV 組小鼠心肌組織中IL-6、TNF-α 和IL-1β 含量顯著減少（P＜0.01），L-PPI組無顯著變化（P＞0.05）。

表2 各組小鼠心肌組織中IL-6、TNF-α和IL-1β含量比較Table 2. Comparison of the contents of IL-6，TNF-α and IL-1β in myocardium of each group（ng/L. Mean±SD. n=10）

5 各組小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

如圖 2 和表 3 所示，與 control 組比較，VMC 組小鼠心肌組織中凋亡蛋白cleaved caspase-3和Bax表達(dá)水平均顯著上升（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與VMC組比較，H-PPI和RBV組小鼠心肌組織中凋亡蛋白cleaved caspase-3 和Bax表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01），L-PPI 組無顯著變化（P＞0.05）。

Figure 2. The protein levels of cleaved caspase-3，Bax，Bcl-2 in myocardial tissue detected by Western blot.圖2 Western blot 檢測心肌組織中cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

表3 各組小鼠心肌組織中cleaved caspase-3、Bax 和Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較Table 3. Comparison of the protein expression levels of cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 in myocardium（Mean±SD.n=10）

6 各組小鼠心肌組織中NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

如圖 3 和表 4 所示，與 control 組比較，VMC 組小鼠心肌組織中p-IκBα（Ser32）和p-NF-κB（Ser536）蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01）；與VMC 組比較，HPPI 和 RBV 組小鼠心肌組織中 p-IκBα（Ser32）和 p-NF-κB（Ser536）蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），LPPI組無顯著變化（P＞0.05）。

表4 各組小鼠心肌組織中p-IκBα（Ser32）和p-NF-κB（Ser536）蛋白表達(dá)水平比較Table 4. Comparison of the protein expression levels of p-IκBα（Ser32）and p-NF-κB（Ser536）in myocardium（Mean±SD. n=10）

Figure 3. The protein levels of p-IκBα（Ser32）and p-NF-κB（Ser536）in myocardial tissue detected by Western blot.圖3 Western blot 檢測心肌組織中 p-IκBα（Ser32）和 p-NF-κB（Ser536）蛋白表達(dá)

討 論

目前臨床上治療VMC 的主要方法有輔助支持療法、免疫療法和抗病毒治療法，但治療效果并不理想。VMC 的發(fā)病機(jī)制雖然十分復(fù)雜，但已有研究顯示炎癥反應(yīng)為心肌炎心肌損傷的機(jī)制之一［12-13］。研究顯示［14］，許多天然產(chǎn)物在改善心肌損傷及減輕炎癥反應(yīng)方面具有積極的作用。PPI 是從中藥重樓中提取的甾體皂苷，可通過NF-κB 介導(dǎo)的炎癥通路發(fā)揮抗炎作用［9-10］，但其對VMC的治療作用及其作用機(jī)制鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，PPI 能夠顯著減少VMC 小鼠心肌組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤，下調(diào)心肌組織炎癥因子含量，抑制心肌組織細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過抑制NF-κB信號通路的激活來實(shí)現(xiàn)的。

VMC過程中典型的病理變化是心肌組織出現(xiàn)彌散性壞死和炎癥細(xì)胞浸潤，同時(shí)由于病毒入侵導(dǎo)致心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞通透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的酶類進(jìn)入血液循環(huán)中，CK-MB、Mb 和cTnI 是心肌損傷特異性標(biāo)志物，當(dāng)心肌出現(xiàn)損傷時(shí)其在血液中的含量會(huì)迅速增加［15-16］。本研究結(jié)果顯示，VMC小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)破壞，出血和水腫現(xiàn)象明顯，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤，血清中CK-MB、Mb 和cTnI 含量顯著增加，與前人研究一致［17-18］，說明 CVB3 誘導(dǎo)的VMC 小鼠模型構(gòu)建成功。PPI 高劑量組小鼠心肌細(xì)胞排列趨于規(guī)則，炎癥細(xì)胞浸潤范圍局限，壞死區(qū)域小，同時(shí)血清中CK-MB、Mb和cTnI含量明顯下降，提示PPI能緩解CVB3誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷。

機(jī)體免疫功能紊亂是VMC 的重要特征，炎癥是機(jī)體抵抗病原入侵、修復(fù)組織細(xì)胞損傷的重要防御機(jī)制，若炎癥反應(yīng)持續(xù)維持在較高水平則會(huì)對細(xì)胞造成損傷［19］。IL-6、TNF-α 和 IL-1β 是 VMC 心肌損傷中重要的細(xì)胞因子，病毒感染心肌后其表達(dá)水平增加，促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤心肌組織從而加重心肌細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡［20］。本研究結(jié)果顯示，VMC 小鼠心肌組織中 IL-6、TNF-α 和 IL-1β 含量顯著增加，凋亡蛋白cleaved caspase-3 和Bax 表達(dá)水平增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達(dá)水平降低，與魏傲等［21］研究一致。而PPI 高劑量組小鼠心肌組織中炎癥因子含量和凋亡蛋白表達(dá)水平均明顯回落，說明PPI能抑制VMC 小鼠心肌組織炎癥反應(yīng)，減少心肌組織細(xì)胞凋亡。

為了進(jìn)一步闡明PPI 在VMC 小鼠體內(nèi)發(fā)揮抗炎作用的具體機(jī)制，本研究通過檢測炎癥相關(guān)通路蛋白磷酸化水平來探究PPI發(fā)揮抗炎作用的主要靶點(diǎn)。既往研究表明［5-7］，NF-κB 炎癥通路參與了 VMC 的發(fā)生發(fā)展過程：當(dāng)細(xì)胞感染病毒后，NF-κB 與其抑制蛋白IκBα 解離后激活轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)趨化因子、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等多種基因轉(zhuǎn)錄，參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等病理生理過程。本研究結(jié)果顯示，VMC 小鼠心肌組織中p-IκBα（Ser32）和p-NF-κB（Ser536）蛋白表達(dá)水平明顯增加，PPI高劑量組小鼠心肌組織中p-IκBα（Ser32）和p-NF-κB（Ser536）蛋白表達(dá)被顯著抑制，表明PPI可通過抑制NF-κB通路改善VMC小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，PPI可通過抑制NF-κB 信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少心肌組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤、下調(diào)炎癥因子表達(dá)，降低心肌組織細(xì)胞凋亡，進(jìn)而起到保護(hù)VMC 小鼠心肌組織的作用。