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        低鉀條件下TWIK-1雙孔鉀通道對(duì)小鼠心肌細(xì)胞膜電位的影響及其機(jī)制研究*

        2021-12-06 05:16:50李東梅楊雅雯黨喜同左東川
        中國(guó)病理生理雜志 2021年11期
        關(guān)鍵詞:小鼠

        李東梅, 楊雅雯, 黨喜同, 左東川

        (西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所,醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川瀘州646000)

        低鉀血癥(血清鉀濃度低于3.5 mmol/L)是常見(jiàn)的電解質(zhì)紊亂之一,可導(dǎo)致心律失常,危及生命[1-3]。心肌細(xì)胞靜息狀態(tài)下的膜電位呈現(xiàn)超極化,是維持心肌細(xì)胞正常興奮性和傳導(dǎo)性的必要條件。心肌細(xì)胞在靜息狀態(tài)下主要開(kāi)放背景鉀離子通道,因此心肌細(xì)胞的靜息膜電位接近鉀離子平衡電位(約-80 mV)。根據(jù)Nernst 方程,當(dāng)細(xì)胞外鉀離子濃度(extracellular K+concentration,[K+]e)降低時(shí),細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流增強(qiáng),心肌細(xì)胞靜息膜電位應(yīng)處于超極化狀態(tài),例如小鼠和大鼠的心肌細(xì)胞[4-5]。但以往在成人心肌細(xì)胞及羊和狗浦肯野纖維的研究表明,當(dāng)[K+]e降低時(shí),心肌細(xì)胞靜息膜電位呈現(xiàn)異常去極化(約為-40 mV)[6-10]。盡管這一異常的電生理現(xiàn)象與低鉀血癥誘發(fā)的心律失常密切相關(guān),但其具體分子機(jī)制仍不明確。

        雙孔鉀通道是近年發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)新型鉀離子通道超家族,包含15 個(gè)亞型。雙孔鉀通道屬于背景鉀離子通道,參與細(xì)胞靜息膜電位的維持[11-14]。TWIK-1雙孔鉀通道屬于雙孔鉀通道家族,是從人類(lèi)腎組織中克隆出的第一個(gè)雙孔鉀通道亞型[15]。盡管TWIK-1通道在心肌細(xì)胞高度表達(dá),但其調(diào)控心肌細(xì)胞電生理特性的病理生理意義尚不明確。雙孔鉀通道在結(jié)構(gòu)上與其它類(lèi)型鉀通道不同,屬于二聚體而不是四聚體,其功能性亞基含有4個(gè)跨膜片段、2個(gè)孔區(qū)(P1和P2)及位于孔區(qū)的選擇性過(guò)濾器。TWIK-1通道的離子選擇過(guò)濾器是位于P1孔區(qū)的一段高度保守的非對(duì)稱(chēng)性氨基酸序列(TxGYG)[16]。我們的前期研究表明,在低[K+]e條件下,TWIK-1通道的離子選擇性發(fā)生改變而介導(dǎo)內(nèi)向鈉離子電流,而位于通道P1 孔區(qū)選擇性過(guò)濾器的第118 位蘇氨酸(T118)在這一過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[17]。這說(shuō)明,在低[K+]e條件下,TWIK-1通道的功能不再是維持細(xì)胞靜息膜電位超極化,而是使靜息膜電位去極化。我們推測(cè),TWIK-1 通道功能的異??赡茉诘外浾T發(fā)心肌細(xì)胞靜息膜電位異常去極化的過(guò)程中起到了重要作用。本實(shí)驗(yàn)以小鼠HL-1細(xì)胞為心肌細(xì)胞模型,探討在低[K+]e條件下TWIK-1通道功能的改變對(duì)心肌細(xì)胞靜息膜電位的影響及其機(jī)制。

        材料和方法

        1 主要試劑

        DMEM 培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素和胰酶細(xì)胞消化液(Gibco);胎牛血清(HyClone);河鲀毒素(tetrodotoxin,TTX)和CoCl2(Sigma)。

        2 主要方法

        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 攜帶人TWIK-1和TWIK-1-T118i突變體基因序列的慢病毒載體(滴度1×1011TU/L)由賽業(yè)生物科技包裝。載有各基因序列及綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒預(yù)先用DMEM 培養(yǎng)液以1∶1 000的比例稀釋?zhuān)盅b于EP管中,保存于-80 ℃冰箱中備用。

        中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞與HL-1 小鼠心肌細(xì)胞均來(lái)自西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所(醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)。2 種細(xì)胞均培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液。細(xì)胞接種于含有玻片的培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),轉(zhuǎn)染組細(xì)胞加入預(yù)先稀釋好的病毒,放入孵育箱共同培養(yǎng)48 h 后,用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)。所轉(zhuǎn)染病毒均攜帶GFP,用于檢測(cè)細(xì)胞是否轉(zhuǎn)染成功。

        2.2 電生理 采用HEKA膜片鉗系統(tǒng)(EPC10)在電流鉗模式下記錄細(xì)胞靜息膜電位;在電壓鉗模式下記錄全細(xì)胞電流,斜坡刺激方案為電壓從-140 mV去極化到100 mV,跨度為2 200 ms[17-18]。采用電阻為2~3 歐姆的玻璃電極,形成封接,破膜后進(jìn)行記錄。記錄CHO 細(xì)胞的電極內(nèi)液組成為(mmol/L):140 KCl,1 MgCl2,10 EGTA,1 K2-ATP,5 HEPES(pH 7.4)。電極外液組成為(mmol/L):135 NaCl,5 KCl,2 CaCl2,1 MgCl2,15 glucose,10 HEPES(pH 7.4)。記錄HL-1 心肌細(xì)胞的電極內(nèi)液組成為(mmol/L):20 KCl,120 potassium aspartate,1 MgCl2,5 Na2-ATP,0.5 Na2-GTP,10 EGTA,5 HEPES(pH 7.4)。電極外液組成為(mmol/L):140 NaCl,5.4KCl,1.8 CaCl2,1 MgCl2,10 glucose,10 HEPES(pH 7.4)。

        為了檢測(cè)低[K+]e對(duì)細(xì)胞膜電位及全細(xì)胞電流的影響,細(xì)胞外液中鉀離子濃度降低至2.7 mmol/L,同時(shí),相應(yīng)提高外液中NaCl 的濃度,以維持外液總滲透壓不變。為了記錄低[K+]e條件下TWIK-1 通道介導(dǎo)的內(nèi)向鈉電流,低鉀外液中加入2 mmol/L CoCl2及500 μmol/L TTX 以阻斷心肌細(xì)胞電壓門(mén)控鈣通道及鈉通道電流[18]。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        所記錄電生理數(shù)據(jù)采用IGOR Pro軟件進(jìn)行制圖和統(tǒng)計(jì)分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

        結(jié) 果

        1 低[K+]e時(shí),表達(dá)人 TWIK-1 通道的 CHO 細(xì)胞靜息膜電位發(fā)生去極化

        CHO 細(xì)胞經(jīng)載有TWIK-1基因序列的慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后,膜片鉗可記錄到典型的TWIK-1通道全細(xì)胞電流(圖1A)。當(dāng)[K+]e為5.4 mmol/L 時(shí),CHO 細(xì)胞的靜息膜電位為(-77.0±0.9)mV,當(dāng)[K+]e降為2.7 mmol/L 時(shí),CHO 細(xì)胞的靜息膜電位首先呈現(xiàn)超極化,隨著細(xì)胞外低鉀溶液灌流時(shí)間的延長(zhǎng),靜息膜電位緩慢去極化到(-58.0±1.2)mV,當(dāng)[K+]e恢復(fù)到5.4 mmol/L 時(shí),靜息膜電位恢復(fù)到靜息水平(圖1B)。此外,當(dāng)[K+]e從 5.4 mmol/L 降為 2.7 mmol/L 時(shí),TWIK-1 通道全細(xì)胞電流的反轉(zhuǎn)電位由(-77.0±0.9)mV去極化到(-59.0±1.3)mV(圖1C)。

        2 低[K+]e時(shí),TWIK-1通道介導(dǎo)的內(nèi)向鈉離子電流引起CHO細(xì)胞靜息膜電位去極化

        為了進(jìn)一步驗(yàn)證TWIK-1通道介導(dǎo)的內(nèi)向鈉離子電流是低[K+]e引起CHO細(xì)胞靜息膜電位去極化的關(guān)鍵,我們將細(xì)胞外低鉀溶液的鈉離子替換為N-甲基-D-葡萄糖胺(N-methyl-D-glucamine,NMDG)。膜片鉗結(jié)果顯示,當(dāng)[K+]e從5.4 mmol/L 降為2.7 mmol/L 時(shí),表達(dá)人TWIK-1 通道的CHO 細(xì)胞的靜息膜電位維持在(-93.0±2.5)mV,去極化現(xiàn)象消失(圖2A),且全細(xì)胞電流的反轉(zhuǎn)電位維持在(-90.0±3.5)mV(圖2B)。在表達(dá)人TWIK-1-T118i 突變體通道的CHO 細(xì)胞,當(dāng)[K+]e從 5.4 mmol/L 降為 2.7 mmol/L 時(shí),靜息膜電位維持在(-94.0±3.5)mV,去極化現(xiàn)象消失(圖2C)。

        3 低[K+]e時(shí),表達(dá)人TWIK-1 通道的HL-1 小鼠心肌細(xì)胞靜息膜電位發(fā)生去極化

        我們采用HL-1 小鼠心肌細(xì)胞系作為心肌細(xì)胞模型,觀察2.7 mmol/L[K+]e對(duì)其膜電位及全細(xì)胞電流的影響。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在對(duì)照組HL-1 細(xì)胞,當(dāng)[K+]e從5.4 mmol/L降為2.7 mmol/L時(shí),靜息膜電位發(fā)生超極化,維持在(-88.0±2.0)mV(圖3A),并且全細(xì)胞電流的反轉(zhuǎn)電位維持在(-83.0±3.5)mV(圖3B)。而在表達(dá)TWIK-1 通道的HL-1 細(xì)胞,當(dāng)[K+]e從 5.4 mmol/L 降為 2.7 mmol/L 時(shí),靜息膜電位首先呈現(xiàn)超極化,隨著細(xì)胞外低鉀溶液灌流時(shí)間的延長(zhǎng),靜息膜電位發(fā)生緩慢去極化,維持在(-43.0±3.0)mV,且全細(xì)胞電流的反轉(zhuǎn)電位維持在(-41.0±2.5)mV(圖3C、D)。此外,用表達(dá)人TWIK-1-T118i突變體通道的HL-1 細(xì)胞作為陰性對(duì)照,當(dāng)[K+]e從5.4 mmol/L 降為 2.7 mmol/L 時(shí),HL-1 細(xì)胞靜息膜電位維持在(-88.0±3.0)mV,去極化現(xiàn)象消失,且全細(xì)胞電流的反轉(zhuǎn)電位維持在(-84.0±3.5)mV(圖4)。

        Figure 2. The inward Na+currents conducted by TWIK1 channel contributed to membrane potential depolarization of the CHO cells at 2.7 mmol/L[K+]e(2.7K). A:representative resting membrane potential of the CHO cells expressing human TWIK-1 channel was shown when N-methyl-D-glucamine(NMDG)-based bath solution was reversibly changed from 5.4 mmol/L[K+]e(5.4K)to 2.7K;B:representative whole-cell ramp currents in the CHO cells engineered to express human TWIK-1 channel before and after Na+-based bath solution was changed from 5.4K(black line)to 2.7K(red line)or changed to NMDG-based bath solution containing 2.7K(blue line);C:representative resting membrane potential of the CHO cells expressing human TWIK-1-T118i channel was shown when NMDG-based bath solution was reversibly changed from 5.4K to 2.7K. Mean±SD. n=7.圖2 細(xì)胞外低鉀條件下,TWIK-1通道介導(dǎo)的內(nèi)向鈉離子電流引起CHO細(xì)胞靜息膜電位去極化

        討 論

        TWIK-1 雙孔鉀通道在心肌細(xì)胞高度表達(dá),但其調(diào)控心肌細(xì)胞電生理特性的病理生理意義尚不明確。Christensen 等[19]將斑馬魚(yú)心臟的TWIK-1基因敲除,發(fā)現(xiàn)心跳速率明顯變緩,說(shuō)明TWIK-1 通道參與了心肌細(xì)胞自律性的調(diào)控。我們的前期研究結(jié)果表明,在細(xì)胞外低鉀條件下,TWIK-1 通道離子選擇性發(fā)生改變并介導(dǎo)內(nèi)向鈉離子電流[17-18]。心肌細(xì)胞靜息膜電位的維持依靠背景鉀離子通道,TWIK-1 通道屬于背景鉀離子通道。我們推測(cè),在低[K+]e條件下,TWIK-1 通道功能的改變可能會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞靜息膜電位產(chǎn)生影響。因此,我們首先在異源表達(dá)系統(tǒng)CHO細(xì)胞,觀察了TWIK-1通道功能的改變對(duì)靜息膜電位的影響。本研究結(jié)果表明,在低[K+]e條件下,轉(zhuǎn)染TWIK-1 通道的CHO 細(xì)胞的靜息膜電位呈現(xiàn)去極化。這一結(jié)果說(shuō)明,在低[K+]e條件下TWIK-1通道功能的改變能夠引起靜息膜電位去極化。以往研究表明,小鼠心肌細(xì)胞的靜息膜電位在低[K+]e條件下呈現(xiàn)超極化而不是去極化,并且小鼠心肌細(xì)胞不表達(dá)TWIK-1 通道[20-22]。因此,我們采用 HL-1 小鼠心肌細(xì)胞作為心肌細(xì)胞模型,觀察TWIK-1通道功能的改變對(duì)心肌細(xì)胞靜息膜電位的影響。本研究結(jié)果表明,在低[K+]e條件下,轉(zhuǎn)染 TWIK-1 通道的 HL-1 小鼠心肌細(xì)胞靜息膜電位發(fā)生去極化(約-40 mV)。這一結(jié)果與以往在成人心肌細(xì)胞觀察到實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[4-6]。上述研究結(jié)果表明,在低[K+]e條件下,TWIK-1 通道功能的改變能夠引起心肌細(xì)胞靜息膜電位去極化。

        心肌細(xì)胞靜息膜電位異常去極化是低鉀血癥誘發(fā)心律失常的主要病理基礎(chǔ)之一,但其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。靜息膜電位是由細(xì)胞膜離子通道介導(dǎo)的內(nèi)向電流和外向電流的動(dòng)態(tài)平衡決定的。細(xì)胞膜離子通道介導(dǎo)的外向電流減弱或內(nèi)向電流增強(qiáng)均會(huì)引起靜息膜電位發(fā)生去極化[23]。Sheu等[24]和Gadsby等[25]在羊和成人心肌細(xì)胞的研究表明,去除細(xì)胞外液的鈉離子后,低鉀誘發(fā)的心肌細(xì)胞靜息膜電位去極化現(xiàn)象消失。上述研究說(shuō)明鈉離子內(nèi)流是低鉀導(dǎo)致心肌細(xì)胞靜息膜電位異常去極化的關(guān)鍵因素。為了證明TWIK-1 通道介導(dǎo)的鈉離子內(nèi)流能夠引起心肌細(xì)胞靜息膜電位去極化,我們首先在轉(zhuǎn)染TWIK-1通道的CHO 細(xì)胞證明了TWIK-1 通道介導(dǎo)的鈉離子內(nèi)流引起CHO 細(xì)胞靜息膜電位去極化,因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞外液的鈉離子替換為NMDG 時(shí),低鉀誘發(fā)的靜息膜電位去極化現(xiàn)象消失。其次,我們?cè)贖L-1 小鼠心肌細(xì)胞證明了TWIK-1 通道介導(dǎo)的鈉離子內(nèi)流能夠引起心肌細(xì)胞靜息膜電位去極化,因?yàn)檗D(zhuǎn)染TWIK-1-T118i 突變體通道的HL-1 小鼠心肌細(xì)胞的靜息膜電位呈現(xiàn)超級(jí)化,而TWIK-1-T118i 突變體通道在低[K+]e條件下不介導(dǎo)內(nèi)向鈉離子電流[19-20]。

        Figure 3. Membrane potential depolarization occurred in mouse HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of TWIK1 channel at 2.7 mmol/L[K+]e(2.7K). A:representative resting membrane potential of HL-1 cardiomyocytes was shown when Na+-based bath solution was reversibly changed from 5.4 mmol/L[K+]e(5.4K)to 2.7K;B:representative whole-cell ramp currents in HL-1 cardiomyocytes before and after Na+-based bath solution was changed from 5.4K(black line)to 2.7K(red line);C:representative resting membrane potential of HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of human TWIK-1 channel was shown when Na+-based bath solution was reversibly changed from 5.4K to 2.7K;D:representative wholecell ramp currents in HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of human TWIK-1 channel before and after Na+-based bath solution was changed from 5.4K(black line)to 2.7K(red line). Mean±SD. n=5.圖3 表達(dá)人TWIK1通道的HL1小鼠心肌細(xì)胞在細(xì)胞外低鉀條件下膜電位發(fā)生去極化

        Figure 4. Mouse HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of TWIK1-T118i channel showed hyperpolarized membrane potential at 2.7 mmol/L[K+]e(2.7K). A:representative resting membrane potential of HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of human TWIK-1-T118i channel was shown when Na+-based bath solution was reversibly changed from 5.4 mmol/L[K+]e(5.4K)to 2.7K;B:representative whole-cell ramp currents in HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of human TWIK-1-T118i channel before and after Na+-based bath solution was changed from 5.4K(black line)to 2.7K(red line). Reversal potential of TWIK-1 channel currents at 2.7K was(-84.0±1.5)mV. Mean±SD. n=5.圖4 表達(dá)人TWIK1-T118i通道的HL1小鼠心肌細(xì)胞在細(xì)胞外低鉀條件下膜電位發(fā)生超極化

        綜上所述,本研究證明了在低[K+]e條件下TWIK-1 通道介導(dǎo)的內(nèi)向鈉離子電流能夠引起小鼠心肌細(xì)胞靜息膜電位去極化。鑒于TWIK-1 通道在人心肌細(xì)胞高度表達(dá)而在小鼠心肌細(xì)胞不表達(dá),因此,在低[K+]e條件下,TWIK-1 通道功能的改變是否能夠引起人心肌細(xì)胞靜息膜電位異常去極化仍需通過(guò)基因敲除等方法在人心肌細(xì)胞進(jìn)一步驗(yàn)證。

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