蘇凱悅， 車麗娜， 李鳳嬌， 段曉昶， 李 棟， 何紅鵬， 張同存， 王 楠△

（1天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院低溫醫(yī)學(xué)研究室，山東濟南250000）

血管內(nèi)皮損傷見于動脈粥樣硬化、高血壓和糖尿病血管病變等多種心腦血管疾病，被認為是這些疾病的始動環(huán)節(jié)，因此人們努力探索損傷內(nèi)皮的因素及機制，以及研究受損內(nèi)皮分泌的活性物質(zhì)（有害的或/和有益的）變化在疾病中的作用及機制［1］。然而血管內(nèi)皮細胞損傷修復(fù)的機制尚未完全明了。內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是歸巢于血管新生組織并能分化增殖為成熟內(nèi)皮細胞的干細胞，在內(nèi)皮修復(fù)以及血管新生中具有重要作用［2］。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在體內(nèi)外具有向骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等組織及內(nèi)皮細胞分化的潛能，是治療血管生成的理想候選細胞。文獻中證實出生后的血管新生與內(nèi)皮損傷后修復(fù)過程主要由骨髓中的EPCs 來完成，在正常的情況下，骨髓中的細胞（主要是EPCs，也包括MSCs）處于休眠狀態(tài)，在眾多刺激因素作用下激活體循環(huán)，并遷移到特定的位點進行分化和增生，形成內(nèi)皮細胞并促進血管損傷修復(fù)與生成［3］。當(dāng)內(nèi)皮受損時，骨髓MSC/EPC 被動員進入外周血并進一步遷移到損傷組織［4］。MSCs 通過多種機制參與成體血管新生。MSCs 可以通過免疫調(diào)節(jié)促進血管生成，也能直接分泌血管生成因子，例如 VEGF 和 FGF2 等［5］，這些因子能影響血管內(nèi)皮細胞存活、增殖和遷移并調(diào)節(jié)血管形成。另外MSCs 還可以分泌具有調(diào)節(jié)血管生成活性的微囊泡和外泌體［6］。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果也證實了人MSCs外泌體包含許多與血管生成相關(guān)的蛋白質(zhì)，當(dāng)MSCs 暴露于缺血部位時，這些蛋白質(zhì)表達會上調(diào)［7］并促進血管生成。

目前已知間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞分化可由許多刺激觸發(fā)，如生長因子、支架性質(zhì)和機械應(yīng)力等。2007 年，Pasquinelli 等［8］從胸主動脈中膜與外膜交界處分離出了表達間充質(zhì)細胞標(biāo)志CD44、CD90和CD105 的祖細胞，這些細胞可在體外分化為ECs。而大量研究已經(jīng)證實骨髓或其他來源的MSCs 可以在體外和體內(nèi)分化為內(nèi)皮細胞，有助于新血管的形成［9-13］。我們前期也證實抑制DNA 甲基化有助于MSCs向動脈內(nèi)皮細胞分化［14］。

細胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E2F1（E2F transcription factor 1）是細胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E2F 家族成員之一，在全身多種腫瘤組織和細胞中呈高表達，起著促癌基因的作用。E2F 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多種細胞過程，許多參與血管生成的基因啟動子中都有潛在的E2F1 結(jié)合位點，E2F1 可與這些啟動子結(jié)合，血管內(nèi)皮 生 長 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）刺激后E2F1 的募集增強，伴隨Rb 的解離，導(dǎo)致這些啟動子的轉(zhuǎn)錄激活，這些啟動子被E2F1 誘導(dǎo)并被 Rb 抑制，而 E2F1 的缺失降低了它們的表達［15］。E2F1/SNHG7/miR-186-5p/MMP2 信號通路在內(nèi)皮細胞增殖和遷移中的重要作用［16］。我們之前的研究結(jié)果證實在間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞分化過程中E2F1 水平升高，并介導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞中ephrin-B2 和 HEY2 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［14］，但 E2F1 過表達是否有助于間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞分化、抑制DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A 是否能促進E2F1 誘導(dǎo)的MSCs 向內(nèi)皮細胞分化，這些目前尚不清楚。本課題探究在誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUCMSCs）向內(nèi)皮細胞分化的過程中，敲減DNMT3A同時過表達E2F1 在體內(nèi)和體外對間充質(zhì)干細胞血管形成的作用，從而為血管組織工程與干細胞療法提供新的依據(jù)。

材料和方法

1 動物

SPF 級 BALB/c 裸鼠，均為雌性，4～6 周齡，15～17 g，由山東斯克貝斯生物科技股份有限公司提供，許可證號為SCXK（魯）2016-0001。

2 主要試劑

DMEM/F12 培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清購自AusGeneX；抗 CD44-APC、CD90-FITC 和 CD34-PE 抗體購自BioLegend；抗CD45-PerCP 抗體購自BD；內(nèi)皮誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基購自Lonza；pCMV-HA-E2F1 過表達質(zhì)粒購自Addgene；轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Reagent 購自 Thermo；鼠抗 E2F1、DNMT3A 和 ephrin-B2 多克隆抗體購自Santa Cruz；兔抗HEY2 多克隆抗體購自北京博奧森公司；IRDye-800-conjugated antimouse 和 IRDye-680-conjugated anti-rabbit 購 自 LICOR Biosciences；Matrigel 購自 BD Biosciences；Trizol購自 Invitrogen；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購自 Promega；Bestar SYBR Green qPCR Master Mix 購自DBI Bioscience；其他生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司根據(jù)設(shè)計合成。

3 主要方法

3.1 hUCMSCs 的表面標(biāo)記檢測 hUCMSCs 由本實驗室保存［14］，在含10%胎牛血清、100 mg/L 鏈霉素和100 IU/mL 青霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。收集第3 代hUCMSCs，待細胞長到80%～90%融合后，0.25%胰酶消化并離心收集細胞，加入1 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細胞，并調(diào)整細胞密度為1×109/L，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管，每個流式管加入100 μL細胞懸液。分別加入抗CD44-APC、CD90-FITC、CD34-PE 和CD45-PerCP 抗體充分振蕩細胞懸液，避光 4 ℃孵育 30 min 后，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清。加入200 μL PBS 緩沖液，吹打混勻后1 000 r/min 離心5 min，棄上清，重復(fù)1 次，洗去細胞懸液中未結(jié)合的抗體。每管加入200 μL PBS，輕吹重懸細胞液。經(jīng)流式細胞儀（BD）檢測，采用FlowJo-V10.7軟件分析結(jié)果。

3.2 hUCMSCs 的培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化 采取第3～6 代hUCMSCs 接種于實驗所需孔板中，待細胞生長融合達到 50% 時，將細胞分為 4 組：對照（control）組［DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)1 周后，轉(zhuǎn)染空載pCMV-HA和隨機 siRNA（siControl）48 h］、E2F1 過表達（E2F1）組（EDM 內(nèi)皮誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)1 周后，轉(zhuǎn)染E2F1-pCMV-HA 質(zhì)粒 48 h）、敲減DNMT3A組（EDM內(nèi)皮誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后，轉(zhuǎn)染靶標(biāo)DNMT3A的siRNA 48 h）和聯(lián)合誘導(dǎo)組（EDM 內(nèi)皮誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)1 周后，轉(zhuǎn)染E2F1-pCMV-HA 質(zhì)粒和靶標(biāo)DNMT3A 的 siRNA 48 h），持續(xù)誘導(dǎo) 1 周后，倒置顯微鏡下對細胞形態(tài)學(xué)進行觀察，并進行后續(xù)實驗。

3.3 總RNA 提取與RT-qPCR 每孔1×105個接種hUCMSCs 細胞于6 孔板，生長至50% 匯合后進行誘導(dǎo)，各組細胞誘導(dǎo)結(jié)束后，使用Trizol 試劑從hUCMSCs 中分離總 RNA，每管 RNA 樣品中加入 200 μL氯仿進行抽提，提取結(jié)束后加入20 μL 的DEPC 水進行溶解并定量，取2 μg的RNA樣品使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，最后以cDNA 為模板，采用Bestar Sybr Green qPCR Master Mix 進行實時 PCR 系統(tǒng)進行擴增和監(jiān)測，反應(yīng)條件為 95 ℃10 s、60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。GAPDH 作為內(nèi)參照，結(jié)果采用 2-ΔΔCt法進行相對定量分析。引物序列如表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3.4 Western blot 以每孔1×105個接種hUCMSCs于6 孔板，生長至50%匯合后進行誘導(dǎo)，各組細胞誘導(dǎo)結(jié)束后，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白；經(jīng)BCA 法測定濃度后行聚丙烯酰胺凝膠電泳；按照半干轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)印到NC 膜上；5%脫脂奶粉溶液37 ℃孵育2 h；Ⅰ抗4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜后Ⅱ抗37 ℃孵育2 h；再次洗膜，使用Odyssey Infrared Imaging System 顯色。用 ImageJ 圖像分析軟件進行半定量分析，GAPDH 作為內(nèi)參照。

3.5 Matrigel管狀結(jié)構(gòu)形成實驗 將96孔板放置在冰上，每孔加入40 μL 基質(zhì)膠，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)1 h，待基質(zhì)膠凝固備用。各組細胞處理結(jié)束后，向鋪有基質(zhì)膠的96 孔板中加入50 μL（2×104）細胞懸液，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2～4 h。倒置顯微鏡下觀察拍照，使用ImageJ 軟件對管狀結(jié)構(gòu)的長度進行分析統(tǒng)計。

3.6 基質(zhì)膠塞實驗 將處理結(jié)束后的各組細胞與Matrigel 基質(zhì)膠1∶1 混合，注入免疫缺陷鼠背部皮下14 d 后，取出形成的Matrigel plug，進行組織切片，利用免疫組化CD31染色來觀察血管形成。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用 Bonferroni 校正的t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 定向誘導(dǎo)hUCMSCs分化為血管內(nèi)皮細胞

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，本實驗分離得到的hUCMSCs 高表達基質(zhì)細胞表面標(biāo)記CD44 和CD90，不表達造血干細胞的特異性標(biāo)記CD34 和CD45（圖1）。將hUCMSCs置于EDM 內(nèi)皮誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，同時轉(zhuǎn)染E2F1 過表達質(zhì)粒與靶標(biāo)DNMT3A 的siRNA，培養(yǎng)一周后，倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，control組的細胞體積較大，形態(tài)完整，細胞呈梭形或紡錘形；誘導(dǎo)分化后 ，E2F1 組、siDNMT3A 組和E2F1+siDNMT3A 組的細胞出現(xiàn)內(nèi)皮樣形態(tài)改變，細胞體積縮小，形態(tài)趨于卵圓形或多角形，呈大小不一的鋪路石樣排列（圖2）。

Figure 1. The hUC-MSCs were analyzed by flow cytometry for expression of cell surface markers associated with MSCs phenotype.圖1 hUCMSCs免疫表型的流式鑒定

Figure 2. Morphological changes of hUCMSCs differentiating into vascular endothelial cells. The scale bar=50 μm.圖2 hUCMSCs向血管內(nèi)皮細胞分化的形態(tài)變化

2 動脈標(biāo)志性基因、間充質(zhì)干細胞標(biāo)記基因、DNMT3A和E2F1的mRNA水平檢測

利用RT-qPCR 實驗檢測動脈標(biāo)志物（ephrin-B2和HEY2）、間充質(zhì)干細胞標(biāo)記基因（CD44和OCT4）、DNMT3A 和E2F1 的mRNA 水平表達情況。結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，單獨過表達E2F1（E2F1）組E2F1 的mRNA 水平顯著升高（P＜0.01），ephrin-B2（P＜0.05）與 HEY2（P＜0.01）的 mRNA 水平均升高，而CD44 與 OCT4 的 mRNA 水平均降低（P＜0.01）；敲減DNMT3A（siDNMT3A）組DNMT3A（P＜0.01）的mRNA水平顯著降低，ephrin-B2（P＜0.05）與 HEY2（P＜0.05）的 mRNA 水 平 均 升 高 ，而 CD44 與 OCT4 的mRNA 水平均降低（P＜0.01）；與單獨過表達E2F1 組和siDNMT3A 組相比，聯(lián)合誘導(dǎo)（E2F1+siDNMT3A）組 ephrin-B2（P＜0.01）與HEY2（P＜0.01）的mRNA 水平均升高，而 CD44（P＜0.05）與 OCT4（P＜0.01）的mRNA水平均降低。

3 動脈標(biāo)志性基因的蛋白水平檢測

利用Western blot 實驗檢測動脈標(biāo)志物ephrin-B2與HEY2的蛋白表達水平，結(jié)果如圖4 所示。與control 組 相 比 ，E2F1 組 的 ephrin-B2（P＜0.01）與HEY2（P＜0.05）的蛋白水平均上調(diào)；與 control 組相比，siDNMT3A 組的ephrin-B2與HEY2的蛋白表達上調(diào)（P＜0.01）；分別與 E2F1 組和siDNMT3A 組相比，聯(lián)合誘導(dǎo)組ephrin-B2 與HEY2 的蛋白表達水平顯著性升高（P＜0.01）。

4 體外管狀結(jié)構(gòu)形成的檢測

為研究過表達E2F1 與敲減DNMT3A的hUCMSCs是否具有血管生成的能力，利用Matrigel檢測hUCMSCs的管狀結(jié)構(gòu)形成情況，結(jié)果如圖5所示。對照組中hUCMSCs 的形態(tài)呈長梭形、多角形，少數(shù)細胞形成突起，細胞與細胞之間連接不完整，不能形成管腔樣結(jié)構(gòu)；其他誘導(dǎo)分化的3 組細胞均可形成細胞與細胞之間連接，形成較為完整的管腔樣結(jié)構(gòu)，其中聯(lián)合誘導(dǎo)組形成較多的管腔樣結(jié)構(gòu)，互相交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，見圖5A。使用ImageJ 軟件對誘導(dǎo)后細胞形成管狀結(jié)構(gòu)的總長度進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)E2F1組和siDNMT3A 組形成管狀結(jié)構(gòu)的總長度明顯大于對照組（P＜0.01）；聯(lián)合誘導(dǎo)組形成管狀結(jié)構(gòu)的總長度明顯高于 E2F1 組和 siDNMT3A 組（P＜0.01），見圖5B。

5 體內(nèi)血管生成的檢測

Figure 3. Changes of CD44，OCT4，E2F1，DNMT3A，ephrin-B2 and HEY2 mRNA levels during hUCMSCs differentiation into vascular endothelial cells. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs E2F1 group；▲▲P＜0.01 vs siDNMT3A group.圖3 hUCMSCs向血管內(nèi)皮細胞分化過程中CD44，OCT4，E2F1，DNMT3A，ephrin-B2與HEY2的mRNA水平的變化

Figure 4. Changes of ephrin-B2 and HEY2 protein levels during hUCMSCs differentiation into vascular endothelial cells. Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs E2F1 group；▲▲P＜0.01 vs siDNMT3A group.圖4 hUCMSCs向血管內(nèi)皮細胞分化過程中ephrin-B2與HEY2蛋白水平的變化

為了更深入探究過表達E2F1 與敲減DNMT3A是否能在體內(nèi)誘導(dǎo)hUCMSCs 形成血管樣結(jié)構(gòu)，利用體內(nèi)基質(zhì)膠塞實驗結(jié)合CD31 染色檢測裸鼠體內(nèi)血管生成情況。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，對照組中較少細胞呈現(xiàn)CD31 染色陽性，并且沒有管腔樣結(jié)構(gòu)；E2F1 組與siDNMT3A 組中CD31 的蛋白水平及血管環(huán)數(shù)均顯著升高（P＜0.01）；聯(lián)合誘導(dǎo)組CD31的蛋白水平及血管環(huán)數(shù)最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖6。

討 論

Figure 5. Tube formation assay in vitro. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs E2F1 group; △△P＜0.01 vs siDNMT3A group.圖5 體外管型結(jié)構(gòu)生成實驗

Figure 6. Matrigel plug assay in vivo. The scale bar=100 μm. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs E2F1 group;▲▲P＜0.01 vs siDNMT3A group.圖6 體內(nèi)基質(zhì)膠塞實驗

間充質(zhì)干細胞具有重要的組織修復(fù)和再生生物學(xué)特性，其向血管內(nèi)皮細胞分化的能力使其成為構(gòu)建組織工程化血管種子細胞的主要來源，并且可以進一步應(yīng)用于臨床缺血性疾病的治療。早期誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞分化主要依賴于多種生長因子提供的微環(huán)境。例如，VEGF、FGF2、EGF 和IGF 可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞的分化［17-18］，也有在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度VEGF、FGF［13，19-20］。敲減rBP-JK能夠促進骨髓間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞的分化，這一過程可能受aKT/NF-κB 信號的調(diào)節(jié)［11］；5F 肽通過激活ERK1/2 信號通路來促進骨髓干細胞向內(nèi)皮細胞分化［21］；血管內(nèi)皮細胞上清液可能通過VEGF 以外的途徑誘導(dǎo)MSCs 向血管內(nèi)皮細胞分化［22］。我們的研究證實過表達E2F1 同時敲減DNMT3A能夠協(xié)同誘導(dǎo)MSCs 向內(nèi)皮細胞分化，并促進間充質(zhì)干細胞的血管生成。

E2F1 是一種參與細胞周期調(diào)控和凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，在細胞周期進程、DNA 損傷反應(yīng)和細胞凋亡中起著重要作用［23］。E2F1 的轉(zhuǎn)錄激活能力受 pRb 調(diào)控，以低磷酸化形式，pRb 結(jié)合并使E2F1 的DNA 結(jié)合和反式激活功能失活，與細胞因子（IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、TGF-β、G-CSF、LIF）、生長因子（EGF、KGF、VEGF、IGF、FGF、PDGF、HGF、NGF）和干擾素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）都有相關(guān)性［24］。E2F1 能夠結(jié)合并激活人VEGFC 和VEGFR3 基因的啟動子，刺激體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞形成小管樣結(jié)構(gòu)，并促進體內(nèi)新血管的形成［25］。我們前期研究證實E2F1 可以激活動脈內(nèi)皮細胞標(biāo)志性基因ephrin-B2和HEY2的轉(zhuǎn)錄，并促進人臍動脈血管內(nèi)皮細胞的血管生成［26］。ephrin-B2 和 HEY2 在動脈內(nèi)皮細胞中特異性表達［27］。ephrin-B2 是一種Eph 受體酪氨酸激酶的跨膜配體，可促進內(nèi)皮血管生成的發(fā)芽行為和運動［28］。在缺氧條件下，通過ephrin-B2 的去甲基化可以有效地誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細胞分化為血管內(nèi)皮細胞系［29］。ephrin-B2/EphB4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控牙髓干細胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞新生血管生成［30］。HEY1 和 HEY2 在胚胎血管發(fā)育和動脈命運決定中起著關(guān)鍵作用［31］。本研究結(jié)果證實在間充質(zhì)干細胞中過表達E2F1，可以促進間充質(zhì)干細胞向動脈血管內(nèi)皮細胞的分化，并促進體內(nèi)外血管生成。

DNA 甲基化是一個表觀遺傳過程，與發(fā)育、衰老和腫瘤有關(guān)，通常發(fā)生于基因的啟動子，也可以發(fā)生在外顯子、內(nèi)含子、轉(zhuǎn)座子和調(diào)控元件等DNA 序列［32］。DNMT3A，作為一種從頭合成的 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，在表觀遺傳中起著重要的作用。然而，對于DNMT3A 在血管生成中的作用研究較少。Gao 等［33］報道了DNMT3A 在腫瘤血管生成中的作用，DNMT3A缺失促進肺腫瘤的進展和侵襲。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3A 是內(nèi)皮細胞標(biāo)記基因表觀遺傳沉默的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，敲低DNMT3A能促進間充質(zhì)干細胞向動脈內(nèi)皮細胞的分化［14］。本研究發(fā)現(xiàn)敲減DNMT3A同時過表達E2F1 可以促進間充質(zhì)干細胞向動脈血管內(nèi)皮細胞的分化，上調(diào)動脈特異性標(biāo)志物ephrin-B2和HEY2的表達，促進體內(nèi)外血管形成。

綜上所述，我們的研究一方面為間充質(zhì)干細胞向動脈血管內(nèi)皮細胞分化誘導(dǎo)方案提供新的思路，另一方面為動脈血管內(nèi)皮細胞分化過程中特異性標(biāo)志物的表達調(diào)控機制解析方面提供實驗基礎(chǔ)。因此，這些發(fā)現(xiàn)可能為間充質(zhì)干細胞用于“治療性血管新生”的研究提供一個思路，并為血管化組織工程研究提供了新的依據(jù)。