侯瑞英， 吳冬梅， 焦偉杰， 汪 坤， 杜 蕾， 吳桂月， 韓 競， 趙 旭

（河南省中醫(yī)院藥學部，河南鄭州450002）

近些年，由營養(yǎng)過剩造成的代謝相關疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)急劇上升趨勢［1］。2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）和非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）均是常見的代謝性疾病，且二者關系密切。二者通常共存，約60%～70%的T2DM 患者中發(fā)生肝脂肪變性，特別是腹型肥胖T2DM 患者可高達 100%［2］；約 40% 的 NAFLD 患者同時患有 T2DM［3］。T2DM 不僅是導致 NAFLD 發(fā)病的危險因素之一，且其能加快NAFLD 進展至非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），并增加發(fā)生肝硬化和肝細胞癌的患病風險［4］；另外，在發(fā)生肝脂肪變性的T2DM 患者中，加劇的胰島素抵抗（insulin resistance，IR）使得T2DM 患者的血糖更難控制，從而增加糖尿病并發(fā)癥的患病風險［5］。目前，關于T2DM 和NAFLD 的管理策略均包含降糖、降脂、胰島素增敏劑、減肥、控制飲食和有氧運動等［6-7］。但，二者共存使的疾病的進展更加復雜，造成這些策略的有效性明顯降低。因此，研究T2DM 和NAFLD特別是二者合并癥的治療策略尤為緊迫。

毛蕊異黃酮（calycosin，CAL）是黃芪中一種具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和調(diào)節(jié)糖脂代謝等藥理活性的異黃酮化合物［8］。已有研究表明，CAL能通過抑制炎癥并增強胰島β 細胞功能，來減輕妊娠糖尿?。?］。而，CAL 在T2DM/NAFLD 合并癥模型大鼠中的作用及其機制尚不清楚。因此，本研究通過高糖-高脂飲食誘導并聯(lián)合鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）注射的方法建立T2DM 模型大鼠，觀察CAL 干預對NAFLD的影響，并探討其潛在的作用機制。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 45 只 6 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠（180～190 g）購于河南省動物實驗中心［（生產(chǎn)許可證號為SCXK（豫）2017－0001］，飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院SPF 級動物房。動物實驗的所有相關過程均得到本單位動物倫理委員會批準。

1.2 實驗試劑（盒）與抗體 STZ 和CAL 購自Sigma；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒及大鼠 IL-6、IL-1β 和 TNF-α ELISA 試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；大鼠血糖和胰島素ELISA 試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司；HE 試劑盒、油紅O試劑盒和HRP 偶聯(lián)的山羊抗兔IgG II 抗購自北京索萊寶生物科技有限公司；Lamin B1 和β-actin 購自武漢博士德生物工程有限公司；Trizol 試劑、RIPA 緩沖液、細胞核/質(zhì)蛋白分離試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒和ECL 試劑均購自上海碧云天生物科技有限公司；核因子 κB p65（nuclear factor-kappa B p65，NF-κB p65）、胰島素受體底物 1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）、p-IRS-1（Ser307）、AKT 和 p-AKT（Ser473）抗體均購自CST。

2 實驗方法

2.1 模型構(gòu)建和實驗方案 SD 大鼠在給予特殊飲食之前，先用普通飼料（normal chow diet，NCD）適應性飼養(yǎng)3 d。按照文獻［10-12］方法，通過高脂高糖飲食（high fat-high sugar diet，HFSD）持續(xù)喂養(yǎng)方案聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）法構(gòu)建T2DM大鼠。方法描述：先將大鼠先分為NCD 飼養(yǎng)（n=14）組和高脂-高糖飼料（high fat-high sugar diet，HFSD組；HFSD 由66.5%NCD、10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇和1%膽酸鈉組成）飼養(yǎng)組（n=31），飼養(yǎng)5 周后，HFSD 組大鼠給予腹腔注射50 mg/kg STZ（0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液配置，pH 4.3），NCD 組大鼠給予等體積檸檬酸緩沖液注射；注射后3 d，將空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）水平＞200 mg/dL 的HFSD組大鼠進一步隨機分為模型（model）組及model+低、中和高劑量CAL 組，每組7 只大鼠，用HFSD 飼養(yǎng)16周；其中model+低、中和高劑量CAL組大鼠通過灌胃方式分別給藥10、20 和 40 mg/kg CAL（CAL 劑量參考文獻［13-14］），每天 1 次，持續(xù) 16 周；NCD 組大鼠分為正常對照（normal control，NC）組（n=7）和NC+高劑量（40 mg/kg）CAL組（n=7），用NCD飼料飼養(yǎng)16周。

2.2 血清生化測定 給藥方案結(jié)束后，對大鼠禁食過夜，通過眼眶后靜脈叢穿刺采血以收集血液。4 ℃下1 207×g離心15 min 收集血清。用全自動生化儀檢測血清中 TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT 和 AST 水平。用ELISA 法檢測血清中FBG 和胰島素水平，然后計算IR 穩(wěn)態(tài)指數(shù)（homeostasis assessment of insulin resistance index，HOMA-IR），計算公式HOMA-IR=FBG（mmol/L）×胰島素（mU/L）÷22.5。

2.3 組織學分析 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，分離出肝臟。將肝組織用標準程序的梯度乙醇和二甲苯中處理后，用石蠟包埋。將石蠟包埋的肝組織切為6 μm 厚的連續(xù)切片。切片脫蠟水化后，按試劑盒說明書，分別進行HE 和油紅O 染色。并根據(jù)HE 染色情況計算肝脂肪變性程度和NAFLD 活動評分（NAFLD activity score，NAS），根據(jù)油紅O 染色情況計算肝脂沉積程度。

2.4 肝組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平測定 取新鮮的肝組織，在4 ℃下用RIPA 勻漿后，首先，取勻漿液用BCA試劑盒檢測蛋白濃度；其次，取勻漿液，根據(jù)試劑盒說明書，用ELISA 法檢測勻漿液中IL-6、IL-1β和TNF-α 含量，然后根據(jù)測定的肝組織中蛋白濃度，將其換算成肝組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

2.5 Western blot 分析 取新鮮的肝組織，分別用RIPA 和細胞核/質(zhì)蛋白分離試劑盒對組織進行勻漿，并分離總蛋白、細胞核蛋白和細胞質(zhì)蛋白。用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定組織勻漿的蛋白質(zhì)濃度后，將每樣本含等量（50 mg）蛋白的組織勻漿液進行SDS-PAGE，并將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用含5%脫脂奶粉的PBS-T 溶液封閉膜2 h 后，將膜與 I 抗 NF-κB p65（1∶4 000 稀釋）、IRS-1（1∶2 000 稀釋）、p-IRS-1（Ser307）（1∶1 000 稀釋）、AKT（1∶2 500稀釋）、p-AKT（Ser473）（1∶800 稀釋）、β-actin（1∶5 000稀釋）和Lamin B1（1∶3 000稀釋）抗體在室溫下孵育2 h；洗滌后，將膜與HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG（1∶2 000 稀釋）在室溫下孵育1 h，用ECL 試劑曝光顯像，并使用Quantity One軟件分析條帶光密度。

3 統(tǒng)計學處理

計量資料用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0 軟件進行分析。多組之間比較選擇單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較選用LSD 法事后多重比較。P＜0.05為具有統(tǒng)計學差異。

結(jié) 果

1 CAL對T2DM大鼠糖脂代謝參數(shù)的影響

表1 結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠FBG 水平、胰島素水平、HOMA-IR 值、TG 水平、TC 水平和LDL-C 水平均顯著增加（P＜0.01），HDL-C 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，模型+低、中和高劑量CAL組中上述糖脂代謝參數(shù)均發(fā)生明顯改善（P＜0.05，P＜0.01），其中高劑量 CAL 的效果尤為顯著（P＜0.01）。

表1 各組大鼠糖脂代謝參數(shù)的比較Table 1. Comparison of metabolic parameters in each group（Mean±SD. n=7）

2 CAL對T2DM大鼠肝臟的組織學的影響

肉眼觀察結(jié)果（圖1A）顯示，正常對照組和正常對照+高劑量CAL組肝臟光滑鮮亮；模型組肝臟粗糙發(fā)黃有油膩感；模型+低、中和高劑量CAL 組肝臟外觀隨著CAL 劑量增加，逐漸光滑鮮亮。HE 染色觀察結(jié)果（圖1B）顯示，正常對照組和正常對照+高劑量CAL 組肝組織中肝細胞正常；模型組肝組織的肝細胞呈現(xiàn)大量大泡性脂肪變性和氣球樣變；模型+低、中和高劑量CAL組的肝組織的肝細胞隨著CAL劑量增加，脂肪變性和氣球樣變逐漸改善，其中高劑量CAL 組僅存在少量小泡性脂肪變性和氣球樣變。油紅O 染色觀察結(jié)果（圖1C）顯示，正常對照組和正常對照+高劑量CAL組肝組織中僅存在微量紅染；模型組肝組織呈現(xiàn)大面積紅染，且紅色脂滴匯合成大泡性脂滴；模型+低、中和高劑量CAL 組的肝組織隨著CAL劑量增加，紅染程度逐漸降低。統(tǒng)計結(jié)果（表2）顯示，與正常對照組比較，模型組NAS積分以及肝脂肪變性和肝脂沉積程度均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，模型+低、中和高劑量CAL 組肝組織中上述病理形態(tài)參數(shù)均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），其中高劑量CAL的效果尤為顯著（P＜0.01）。

表2 各組肝組織病理形態(tài)參數(shù)的比較Table 2. Comparison of hepatic histopathological parameters in each group（Mean±SD. n=7）

Figure 1. Visual morphology and histological images of livers in each group. A：representative visual morphology of livers；B：representative HE staining images of liver tissues；C：representative Oil red O staining images of liver tissues. The scale bar=100 μm.圖1 各組肝臟的肉眼外觀以及肝組織學圖像

3 CAL對T2DM大鼠肝損傷的影響

結(jié)果（表2）顯示，與正常對照組比較，模型組血清 ALT 和 AST 以及肝組織中 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，模型+低、中和高劑量CAL組肝組織中上述肝損傷參數(shù)均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），其中高劑量CAL 的效果尤為顯著（P＜0.01）。

4 CAL 對 T2DM 大鼠肝組織中 p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）表達及NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的影響

表3 各組肝損傷參數(shù)比較Table 3. Comparison of liver injury parameters in each group（Mean±SD. n=7）

結(jié)果（圖2、表4）顯示，與正常對照組比較，模型組肝組織中p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）及細胞核NF-κB p65 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），細胞質(zhì)NF-κB p65 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，模型+低、中和高劑量CAL 組肝組織中p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）及細胞核NF-κB p65 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），細胞質(zhì)NF-κB p65 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），其中高劑量 CAL 的效果尤為顯著（P＜0.01）。

Figure 2. Expression of p-IRS-1（Ser307）and p-Akt（Ser473）and nuclear translocation of NF-κB p65 in liver tissues were detected by Western blot. A：representative bands of p-IRS-1（Ser307）expression；B：representative bands of p-Akt（Ser473）expression；C：representative bands of nuclear NF-κB p65 and cytopasmic NF-κB p65 expressions.圖2 Western blot檢測肝組織中p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）表達及NF-κB p65核轉(zhuǎn)位

表4 各組肝組織中p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）及細胞核NF-κB p65和細胞質(zhì)NF-κB p65蛋白相對表達水平的比較Table 4. Comparison of the relative expression levels of p-IRS-1（Ser307），p-Akt（Ser473），nuclear NF-κB p65 and cytopasmic NF-κB p65 proteins in liver tissues in each group（Mean±SD. n=7）

討 論

糖脂代謝穩(wěn)態(tài)失衡不僅是NAFLD 的伴發(fā)現(xiàn)象，也是驅(qū)動肝脂肪變性重要的因素。已有報道表明，IR、TC、TG 和 LDL-C 水平持續(xù)異常升高和 HDL-C 水平持續(xù)異常降低能加重T2DM 模型小鼠的肝脂肪變性［15］。此外，肝脂肪變性能增加肝細胞對促炎介質(zhì)的敏感性，且持續(xù)的慢性炎性反應能加劇肝損傷［16-17］。 本 研 究 結(jié) 果 顯 示 ，CAL 對 HFSD 喂 養(yǎng) 的T2DM 模型大鼠具有抑制IR、維持糖脂代謝穩(wěn)態(tài)、改善肝脂肪變性并減輕肝損傷的藥理作用，這些數(shù)據(jù)表明CAL 能減輕T2DM 模型大鼠肝臟的NAFLD 病變，提示CAL 可能是潛在是用于預防T2DM 發(fā)生NAFLD病變的藥物。

為探討CAL 抑制T2DM 模型大鼠肝損傷的機制，本研究進一步分析了影響炎性反應中的經(jīng)典信號 NF-κB 的活性。有報道［18］稱，HFSD 可激活肝組織中 NF-κB 信號，并通過 NF-κB 信號介導的炎性反應而加快NAFLD 的進展。抑制NF-κB 信號活性可減少促炎介質(zhì)的生成和減輕肝損傷，從而達到減緩NAFLD 的進展的作用［19］。本研究結(jié)果表明，CAL 能降低HFSD 喂養(yǎng)的T2DM 模型大鼠肝組織中NF-κB p65核轉(zhuǎn)位，說明CAL能減弱肝組織中NF-κB信號活性，提示CAL 可能通過負調(diào)控NF-κB 信號活性來控制肝臟炎性反應和肝損傷。

此外，IR 是 T2DM 和 NAFLD 共同的起始因素之一，其與胰島素信號轉(zhuǎn)導障礙有關［20］。胰島素在調(diào)節(jié)糖脂穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。IRS-1 是胰島素受體的主要效應器，負責胰島素信號轉(zhuǎn)導。當胰島素與胰島素受體結(jié)合時，IRS-1 的Ser307 位點磷酸化能阻斷胰島素信號轉(zhuǎn)導，導致IR；而降低IRS-1 的Ser307位點磷酸化水平能恢復胰島素信號轉(zhuǎn)導，進而抑制IR［21］。PI3K/Akt 信號是響應胰島素信號的 IRS-1 最重要的下游信號之一［21-25］。當 IRS-1 的 Ser307 位點磷酸化后，活化的IRS-1 能激活PI3K，PI3K 活化能使細胞質(zhì)膜產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3 與磷脂酰肌醇依賴激酶 2（PDK2）結(jié)合磷酸化 Akt 的 Ser473（也稱Akt1），激活 Akt［22］。Akt 活化能通過葡萄糖轉(zhuǎn)運體（GLUTs）轉(zhuǎn)座和GSK3β 等多種途徑調(diào)控糖脂代謝［23-24］。且研究［22-23，25］表明，抑制 Akt 的 Ser473 位點磷酸化后，T2DM 模型大鼠表現(xiàn)為胰島素敏感性增加和肝損傷降低。本研究顯示，CAL能抑制HFSD喂養(yǎng)的T2DM 模型大鼠肝組織中IRS-1 的Ser307 位點磷酸化和Akt 的Ser473 位點磷酸化，提示CAL 可以通過恢復T2DM 大鼠胰島素信號轉(zhuǎn)導來降低IR 和維持糖脂代謝穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，CAL 能抑制 HFSD 喂養(yǎng)的 T2DM 模型大鼠的IR、改善肝脂肪變性和肝脂蓄積并減輕肝損傷，且這些作用可能與其恢復胰島素信號轉(zhuǎn)導和減弱NF-κB信號活性有關。