崇顯瑾， 楊歷新

（青海省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，青海西寧810007）

2 型糖尿病性骨質(zhì)疏松（diabetic osteoporosis，DOP）是大多數(shù)糖尿病患者的嚴重并發(fā)癥之一，臨床癥狀以全身性骨顯微結(jié)構(gòu)受損、骨密度降低、骨量減少、骨強度減弱等為主，會大幅增加患者骨折風險［1-2］。高血糖可刺激活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量產(chǎn)生釋放，誘導氧化應(yīng)激水平顯著升高，導致骨組織損傷及骨流失，是DOP的主要致病機制，減輕氧化應(yīng)激，可改善糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松癥狀［3-4］。環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）/cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）是細胞內(nèi)調(diào)控過氧化與應(yīng)激反應(yīng)的經(jīng)典信號途徑，刺激其激活，可降低二氯乙酸誘導的氧化應(yīng)激，起到神經(jīng)保護作用，還可促進成骨細胞增殖和分化，改善骨質(zhì)疏松癥［5-6］，因而刺激cAMP/PKA/CREB 信號轉(zhuǎn)導是一種很有前途的DOP 防治手段。利拉魯肽是經(jīng)典的胰高血糖素樣肽1 類似物，可有效促進胰島素合成分泌，降低血糖，增加DOP大鼠骨密度，改善其骨質(zhì)疏松癥狀［7-8］，但利拉魯肽治療DOP的明確分子機制仍鮮有詳盡報道，本項工作通過構(gòu)建DOP 大鼠模型分析利拉魯肽通過cAMP/PKA/CREB通路干預2型糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松的機制。

材料和方法

1 動物

70 只 SPF 級 SD 雌性大鼠，6～7 周齡，體重 180～220 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號為SCXK（京）2019-0008。所有大鼠在本院動物房中適應(yīng)飼養(yǎng)，房內(nèi)環(huán)境保持通風良好及清潔、安靜，大鼠自由飲水進食，溫度設(shè)定為23～26 ℃，相對濕度設(shè)定為52%～57%，12h/12h明暗循環(huán)照明。

2 主要試劑及儀器

利拉魯肽（國藥準字J20160037）購自諾和諾德公司；PKA 抑制劑N-［2-（對溴甲酰氨基）乙基］-5-異喹啉磺酰胺·2HCl 水合物｛N-［2-（p-bromocinnamylamino）ethyl］-5-isoquinolinesulfonamide·2HCl hydrate，H-89｝購自 MedChemExpress；鏈脲佐霉素（純度HPLC≥99%）購自源葉生物有限公司；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液和青霉素-鏈霉素溶液購自武漢普諾賽生命科技有限公司；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、D-無水葡萄糖和CCK-8 試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；ROS 試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒和cAMP 測試盒購自南京建成生物工程研究所；蛋白提取試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性測定試劑盒、BCA 蛋白檢測試劑盒、羊抗兔Ⅱ抗及兔源β-tubulin、PKA、p-PKA、CREB 和p-CREB 抗體購自Abcam；增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒購自上海碧云天公司。

血糖儀（型號ACCU-CHEK）購自上海羅氏制藥有限公司；微計算機斷層掃描術(shù)（micro-computed to-mography，micro-CT）設(shè)備（型號Skyscan1172）購自北京悠然睿智系統(tǒng)技術(shù)有限公司；骨科生物力學測試儀（型號QX-W600）購自上海企想檢測儀器有限公司；高溫灰化爐（型號HF-2LC）購自鄭州鑫涵儀器設(shè)備有限公司；全波長酶標儀（型號HBS-ScanX）購自南京德鐵實驗設(shè)備有限公司；蛋白電泳儀與轉(zhuǎn)膜儀（型號Mini PROTEAN）購自Bio-Rad；化學發(fā)光掃描儀（型號C-DiGit）購自LI-COR。

3 方法

3.1 DOP 大鼠模型制備及分組給藥 選取51 只大鼠參考文獻［9］建立DOP大鼠模型：以高糖高脂飼料喂養(yǎng)SD 雌性大鼠，8 周后禁食不禁水12 h，腹腔注射30 mg/kg 鏈脲佐菌素，2 周后去除大鼠雙側(cè)卵巢，再過3 d 后測量大鼠空腹血糖水平，當空腹血糖≥16.70 mmol/L 時，表示DOP 大鼠模型建立成功。51只大鼠有3 只死亡，將存活的48 只造模成功大鼠隨機分為模型組、利拉魯肽組、H-89 組和利拉魯肽+H-89 組，每組 12 只。另取 12 只雌性 SD 大鼠以普通飼料喂養(yǎng)，8 周后腹腔注射等劑量生理鹽水，2 周后僅開腹，不摘除雙側(cè)卵巢，設(shè)為假手術(shù)組。

利拉魯肽+H-89組大鼠以0.1 mg/kg的劑量皮下注射利拉魯肽，4 周后以0.2 mg/kg 的劑量皮下注射給藥［10］，同時以 5 mg/kg 的劑量腹腔注射 H-89［11］；利拉魯肽組大鼠以0.1 mg/kg 的劑量皮下注射給藥，4周后以0.2 mg/kg的劑量皮下注射給藥，同時以與H-89 組相同的給藥方法給予等體積生理鹽水干預；H-89組大鼠以5 mg/kg 的劑量腹腔注射給藥，同時以與利拉魯肽組相同的給藥方法給予等體積生理鹽水干預；假手術(shù)組與模型組大鼠以與利拉魯肽組相同的給藥方法給予等體積生理鹽水干預，同時以與H-89組相同的給藥方法給予等體積生理鹽水干預，每天一次，持續(xù)干預12周。

3.2 大鼠標本收集及股骨干骺端顯微結(jié)構(gòu)檢測末次給藥干預后24 h，以乙醚麻醉大鼠，通過注射器自頸動脈吸取血液2 mL，4 ℃、1 000×g離心，小心吸出上清，保存在-80 ℃。處死大鼠后取出兩側(cè)股骨，漂洗干凈，取左側(cè)股骨通過micro-CT 進行顯微結(jié)構(gòu)檢測：將股骨放入剛性塑料管中，置于可自動旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)盤上，70 kV、200 μA、300 ms、14.8 μm/切片進行斷層掃描，以股骨干骺端松質(zhì)骨為感興趣體積（volume of interest，VOI），運用儀器自帶的重建軟件進行圖像重建分析，獲得骨顯微結(jié)構(gòu)各參數(shù)——骨礦物質(zhì)密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨體積分數(shù)（bone volume fraction，bone volume/total volume，BV/TV）和骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）。

3.3 大鼠股骨骨生物力學檢測 大鼠左側(cè)股骨在micro-CT 掃描后進行骨生物力學檢測：將股骨水平放置在跨度為20 mm 的測試儀器兩個支撐點上，以10 mm/min 的速率下壓探頭，至股骨中段斷裂，通過儀器自帶軟件記錄并分析得到彈性模量、最大載荷和屈服載荷3種骨生物力學指標數(shù)值。

3.4 大鼠骨礦鹽含量檢測 將3.2 中各組大鼠右側(cè)股骨烘烤后測量其干重，再放入灰化爐中灰化，測量灰分重量，骨礦鹽含量=灰分重量/干重。

3.5 大鼠血清 ROS、CAT、GSH-Px、MDA 和 cAMP 水平檢測 取出3.2 中血清，提前以冰水浴凍融，運用試劑盒檢測其中ROS、CAT、GSH-Px 和MDA 水平，具體參照說明書進行操作；通過酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測cAMP：取酶標板進行包被后，分組加樣品血清，然后加酶標抗體37 ℃孵育0.5 h，洗滌，加底物液顯色，加終止液終止反應(yīng)，最后以酶標儀測定各孔吸光度（absorbance，A），根據(jù)說明書指導進行結(jié)果計算。

3.6 大鼠骨組織cAMP/PKA/CREB 通路蛋白表達檢測 以刮匙刮取3.3 中左側(cè)股骨斷面處骨組織約0.5 g，應(yīng)用試劑盒提取其中總蛋白并測量其濃度，經(jīng)煮沸變性后，以20 μg 蛋白為一份進行等份分裝，取出一份于120 V 恒壓下電泳100 min 進行分離，然后將凝膠中蛋白于100 V 恒壓下濕轉(zhuǎn)70 min 轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，使用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉膜上蛋白，分別剪下β-tubulin、PKA、p-PKA、CREB 和p-CREB 五種目的蛋白，以相應(yīng)兔源Ⅰ抗4 ℃孵育，吸出Ⅰ抗后洗膜，使用合適Ⅱ抗室溫孵育，吸出Ⅱ抗后洗膜，通過ECL 試劑盒顯色，以化學發(fā)光掃描儀及Image Studio 5.2 軟件可視化蛋白條帶并進行定量分析，得到各蛋白相對表達水平。

3.7 大鼠股骨成骨細胞活力檢測 取正常大鼠左側(cè)股骨，浸泡在75%乙醇中消毒，以0.25%胰酶去除股骨結(jié)締組織，然后剪碎，置于Ⅱ型膠原酶中消化，50 min 后終止消化，吹打混勻后過220 目網(wǎng)篩，以PBS 洗滌 3 次，以 5 mL 培養(yǎng)液（DMEM 培養(yǎng)基+1% 青鏈霉素混合液+10%胎牛血清）重懸細胞沉淀，接種在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，傳代4 代后得到純化成骨細胞。將細胞以1×108L-1的密度接種在96 孔板，隨機分為對照組、模型組、利拉魯肽組、H-89 組和利拉魯肽+H-89組，每組6個重復孔；另取6個孔不接種細胞，作為空白對照組。無菌培養(yǎng)12 h，模型組和藥物處理組細胞以16.5 mmol/L 葡萄糖［12］處理，利拉魯肽組以10 nmol/L 利拉魯肽［12］處理，H-89 組以 2 mmol/L H-89［13］處理，利拉魯肽+H-89 組以 10 nmol/L 利拉魯肽和 2 mmol/L H-89 處理，48 h 后加入 CCK-8 試劑，1 h后以酶標儀檢測各孔A值，再計算各組細胞相對活力（%）=（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。

3.8 大鼠股骨成骨細胞cAMP/PKA/CREB 通路表達檢測 取傳代的大鼠股骨成骨細胞，以1×108L-1的密度接種在24孔板，按照3.7中方法分組處理細胞，分別收集各組細胞培養(yǎng)液及細胞材料，以3.5 中方法測定細胞培養(yǎng)液中cAMP 水平，以3.6 中方法提取各組細胞中總蛋白，并檢測PKA、p-PKA、CREB 和p-CREB蛋白相對水平。

4 統(tǒng)計學處理

以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示計量資料，使用SPSS 24.0 軟件對其進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 利拉魯肽減少大鼠骨流失

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th 均顯著降低（P＜0.05）；與模型組和利拉魯肽+H-89 組分別相比，利拉魯肽組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th 均顯著升高（P＜0.05），而H-89組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th 均顯著降低（P＜0.05），見圖1及表1。

Figure 1. Three-dimensional micro-CT reconstruction of the rat femur in each group. A：sham operation group；B：model group，bone mineral density decreased and a large number of bone trabeculae disappeared；C：lilarulidide group，bone mineral density increased and the number of trabeculae recovered；D：H-89 group，bone mineral density became smaller and a large number of bone trabeculae disappeared；E：lilaruptide+H-89 group. The scale bar=2 mm.圖1 各組大鼠股骨micro-CT三維重建圖

表1 各組大鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.ThTable 1. The BMD，BV/TV，Tb.N and Tb.Th of the rat femur in each group（Mean±SD. n=12）

2 利拉魯肽改善大鼠股骨生物力學

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠最大載荷、屈服載荷和彈性模量顯著降低（P＜0.05）；分別與模型組、利拉魯肽+H-89 組相比，利拉魯肽組大鼠最大載荷、屈服載荷和彈性模量均顯著升高（P＜0.05），而H-89 組大鼠最大載荷、屈服載荷和彈性模量均顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠股骨最大載荷、屈服載荷和彈性模量Table 2. Maximum load，yield load and elastic modulus of femur in each group（Mean±SD. n=12）

3 利拉魯肽增加大鼠骨礦化

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠骨礦鹽含量顯著降低（P＜0.05）；分別與模型組和利拉魯肽+H-89 組相比，利拉魯肽組大鼠骨礦鹽含量顯著升高（P＜0.05），而H-89 組大鼠骨礦鹽含量顯著降低（P＜0.05），見表3。

4 利拉魯肽降低大鼠血清ROS水平

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清ROS 水平顯著升高（P＜0.05）；分別與模型組和利拉魯肽+H-89組相比，利拉魯肽組大鼠血清ROS水平顯著降低（P＜0.05），而 H-89 組大鼠血清 ROS 水平顯著升高（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠股骨礦鹽含量及血清ROS水平Table 3. Bone mineral content of femur and serum ROS levels in each group（Mean±SD. n=12）

5 利拉魯肽降低大鼠氧化應(yīng)激水平

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清CAT 和GSHPx 水平均顯著降低，MDA 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組和利拉魯肽+H-89組分別相比，利拉魯肽組大鼠血清CAT 和GSH-Px 水平均顯著升高，MDA 水平顯著降低（P＜0.05），而 H-89 組大鼠血清 CAT 和GSH-Px 水平均顯著降低，MDA 水平顯著升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠血清CAT、GSH-Px和MDA水平Table 4. Serum CAT，GSH-Px and MDA levels in rats of each group（Mean±SD. n=12）

6 利拉魯肽激活大鼠cAMP/PKA/CREB 通路

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清cAMP及骨組織p-PKA/PKA 和p-CREB/CREB 水平均顯著降低（P＜0.05）；分別與模型組和利拉魯肽+H-89組相比，利拉魯肽組大鼠血清cAMP 及骨組織p-PKA/PKA 和p-CREB/CREB 水平均顯著升高（P＜0.05），而H-89 組大鼠血清cAMP 及骨組織p-PKA/PKA 和p-CREB/CREB水平均顯著降低（P＜0.05），見圖2及表5。

表5 各組大鼠骨組織cAMP、p-PKA/PKA和p-CREB/CREB蛋白水平Table 5. The protein levels of cAMP，p-PKA/PKA and p-CREB/CREB in bone tissue of rats in each group（Mean±SD. n=12）

7 利拉魯肽促進高糖誘導的股骨成骨細胞活力

與對照組相比，模型組大鼠股骨成骨細胞活力顯著降低（P＜0.05）；分別與模型組和利拉魯肽+H-89 組相比，利拉魯肽組大鼠股骨成骨細胞活力顯著升高（P＜0.05），而H-89 組大鼠股骨成骨細胞活力顯著降低（P＜0.05），見表6。

表6 各組大鼠股骨成骨細胞活力Table 6. The viability of rat femoral osteoblasts in each group（Mean±SD. n=6）

8 利拉魯肽激活大鼠股骨成骨細胞cAMP/PKA/CREB通路

與對照組相比，模型組大鼠股骨成骨細胞cAMP、p-PKA/PKA 及 p-CREB/CREB 水平顯著降低（P＜0.05）；分別與模型組和利拉魯肽+H-89 組相比，利拉魯肽組大鼠股骨成骨細胞cAMP、p-PKA/PKA 及p-CREB/CREB 水平均顯著升高（P＜0.05），而H-89組大鼠股骨成骨細胞cAMP、p-PKA/PKA 及p-CREB/CREB水平均顯著降低（P＜0.05），見圖3及表7。

表7 各組大鼠股骨成骨細胞cAMP、p-PKA/PKA和p-CREB/CREB蛋白水平Table 7. The protein levels of cAMP，p-PKA/PKA and p-CREB/CREB in rat femoral osteoblasts in each group（Mean±SD. n=6）

討 論

隨著社會發(fā)展及老齡化趨勢加劇，我國DOP 病例逐年增加，因其致殘的患者越來越多，極大降低患者生活質(zhì)量，并給其家庭帶來了沉重負擔，因此找尋安全有效的DOP治療手段是當今的臨床醫(yī)學研究熱點［1-2，14］。本項工作對高糖高脂飼養(yǎng) 8 周的雌性大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素合并摘除卵巢，來誘導建立DOP 模型，結(jié)果顯示，建模大鼠骨密度減小，骨顯微結(jié)構(gòu)顯著受損，骨生物力學性能減弱，骨礦化降低，呈現(xiàn)顯著骨質(zhì)疏松癥狀，表示DOP模型構(gòu)建成功。

Figure 2. Western blot was used to detect the expression of cAMP/PKA/CREB pathway-related proteins in bone tissue of rats in each group. A：sham operation group；B：model group；C：liraglutide group；D：H-89 group；E：liraglutide+H-89 group.圖2 各組大鼠骨組織cAMP/PKA/CREB 通路相關(guān)蛋白表達

有報道顯示胰高血糖素樣肽1 受體是2 型糖尿病的主要治療靶點，利拉魯肽作為該受體的一種激動劑，可顯著降低并控制血糖，促進骨形成，減少骨吸收，抑制糖尿病引發(fā)的骨密度降低，緩解糖皮質(zhì)激素及糖尿病導致的骨質(zhì)疏松癥［15］。本項工作采用利拉魯肽處理DOP大鼠及股骨成骨細胞，結(jié)果顯示，利拉魯肽可提高成骨細胞活力，減輕DOP 大鼠骨顯微結(jié)構(gòu)損傷，升高BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th，改善骨生物力學性能，增強最大載荷、屈服載荷和彈性模量，提升骨礦化，增大骨礦鹽含量。本研究進一步證實了利拉魯肽可減少糖尿病導致的骨丟失，緩解其骨質(zhì)疏松癥狀，對DOP具有明顯的治療功效，但其發(fā)揮作用的具體分子機制目前還未有確切詳盡的闡述。

研究表明，DOP 的主要發(fā)病機制是高糖誘導產(chǎn)生的ROS引發(fā)高水平的氧化應(yīng)激，造成骨代謝失衡，增強機體抗氧化活性，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，可顯著改善 DOP 骨流失癥狀［16-17］。cAMP 是細胞內(nèi)調(diào)控 ROS產(chǎn)生及應(yīng)激反應(yīng)的信號分子，可促進下游PKA 和CREB 蛋白磷酸化，清除ROS，降低氧化應(yīng)激水平，減輕2 型糖尿病誘導的神經(jīng)毒性，還能促進成骨分化及骨形成，防治骨質(zhì)疏松癥［5-6，18-19］，而利拉魯肽可通過激活cAMP 信號抑制淀粉樣蛋白β 肽誘導的晝夜節(jié)律紊亂［20］，因此推測通過激活cAMP/PKA/CREB 信號減輕氧化應(yīng)激可能是DOP 的藥物防治機制之一。本項工作顯示，DOP 大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增強，抗氧化酶 CAT 和 GSH-Px 活性降低，cAMP/PKA/CREB信號處于抑制狀態(tài)；利拉魯肽可增強抗氧化酶活性，激活cAMP/PKA/CREB 信號，抑制ROS 產(chǎn)生及釋放，減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕大鼠骨質(zhì)疏松癥狀；而以PKA 抑制劑 H-89 干擾 cAMP/PKA/CREB 信號傳導，可加重DOP 大鼠骨量缺失及骨質(zhì)疏松癥狀，并可減弱利拉魯肽降低氧化應(yīng)激的作用，逆轉(zhuǎn)其對DOP 大鼠骨質(zhì)疏松癥狀的緩解作用，表明利拉魯肽是通過激活cAMP/PKA/CREB 信號而提高DOP 大鼠骨密度與骨生物力學性能，發(fā)揮減輕骨質(zhì)疏松癥狀作用的。

Figure 3. Western blot was used to detect the expression of cAMP/PKA/CREB pathway-related proteins in rat femoral osteoblasts in each group. A：control group；B：model group；C：liraglutide group；D：H-89 group；E：liraglutide+H-89 group.圖3 各組大鼠股骨成骨細胞cAMP/PKA/CREB 通路相關(guān)蛋白表達

綜上所述，利拉魯肽可升高cAMP 水平，促進PKA 和 CREB 磷酸化，抑制 ROS 產(chǎn)生，增強 DOP 大鼠抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，促使骨形成及骨礦化，減少骨量流失，提高骨密度，改善骨生物力學性能，最終起到對抗骨質(zhì)疏松的作用；激活cAMP/PKA/CREB 信號是發(fā)揮其抗骨質(zhì)疏松功效的分子機制之一。本文對DOP發(fā)病及藥物治療分子機制做出新的探討，也為探尋更安全有效的DOP 防治措施提供了參考資料。