梁 丹， 趙思琪， 李志陽， 肖雅文， 丁 菁， 肖 瑛△， 郭 兵

（1貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，貴州貴陽550025；2秦皇島軍工醫(yī)院，河北秦皇島066000）

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）患者由于持續(xù)的高血糖，腎小球系膜細(xì)胞中線粒體會產(chǎn)生氧化性DNA 損傷，毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變蛋白（ataxia telangiectasia mutated，ATM）-細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶2（checkpoint kinase 2，Chk2）信號通路是DNA 損傷中主要的修復(fù)通路之一［1］。ATM基因是參與DNA 損傷反應(yīng)的重要基因，可以檢測到DNA 雙鏈斷裂（double-strand breaks，DSBs），調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)；Chk2基因是編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶的一種腫瘤抑制基因，處于ATM基因的下游。DNA 的 DSBs 會導(dǎo)致 ATM 和 Chk2 持續(xù)磷酸化，激活A(yù)TM-Chk2通路來進(jìn)行DNA 損傷修復(fù)［2］。研究發(fā)現(xiàn)，諸多因子參與了DNA 損傷修復(fù)過程，其中DNA 損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物 4（DNA damage-inducible transcript 4，DDIT4）已被證明能被DNA 損傷誘導(dǎo)，且DDIT4 對DNA 損傷有負(fù)調(diào)控作用［3］。在高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞及鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）大鼠模型中，DDIT4的表達(dá)均下調(diào)［4］，提示 DKD 時的 DNA 損傷可能與DDIT4的減少有關(guān)，但具體機(jī)制仍不清楚。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類非編碼RNA，在DNA 損傷反應(yīng)中起著重要的作用。最近的研究已經(jīng)確定了幾種miRNA 在DKD 腎臟纖維化中發(fā)揮著重要作用，參與了DKD 的病理過程［5-7］。有研究發(fā)現(xiàn)miR-22 與異常生理?xiàng)l件下DNA 損傷信號傳導(dǎo)途徑有著密不可分的聯(lián)系，miR-22 能夠抑制DNA 損傷修復(fù)［8］。另有研究報道，miR-22 在 DKD 大鼠的腎臟組織中表達(dá)上調(diào)，并通過靶向PTEN發(fā)揮抑制自噬作用，從而促進(jìn)腎小管-間質(zhì)纖維化［9］。上述研究表明，miR-22 可能成為DKD 中有吸引力的治療靶標(biāo)，且其作用機(jī)制可能與DNA 損傷修復(fù)密切相關(guān)。因此本研究旨在探討DKD 時miR-22 能否靶向抑制DDIT4的表達(dá)，從而通過ATM-Chk2信號通路促進(jìn)DNA 損傷，以期進(jìn)一步闡明DKD 的發(fā)病機(jī)理，為預(yù)防DKD的進(jìn)展提供新的理論依據(jù)。

材料和方法

1 動物和細(xì)胞

健康清潔級雄性C57BL 小鼠，體重（20±5）g，許可證號為SCXK（京）2016-0002，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK-52E購自ATCC。

2 主要試劑

正常糖（normal glucose，NG；5.5 mmol/L 葡萄糖）培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶購自HyClone；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Biological Industries；DDIT4過表達(dá)質(zhì)粒購自上海毅樂生物科技有限公司；miR-22 mimics 和inhibitor 購自廣州瑞博生物科技有限公司；聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）購自Polyscience；兔抗Chk2 多克隆抗體購自Abcam；兔抗DDIT4、ATM、p-ATM 和 p-Chk2 多克隆抗體均購自上海愛必信生物科技有限公司；抗β-actin 單克隆抗體購自武漢普美克生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒和RIPA 裂解液等均購自碧云天公司；STZ 購自Sigma。電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購自北京六一公司；凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad；高速低溫離心機(jī)購自Eppendorf。

3 主要方法

3.1 動物造模及分組 將20 只C57BL 小鼠飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水、適宜溫度和濕度及每天12 h 照明，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)等分為正常對照（normal control，NC）組和DM 組。造模前1 d 稱重，禁食4 h，造模方式為：DM 組小鼠連續(xù)5 d 腹腔注射STZ 溶液（50 mg·kg-1·d-1，溶媒為0.01 mol/L、pH 4.5的滅菌檸檬酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液）；NC組小鼠連續(xù)5 d腹腔注射等量溶媒。1周后尾靜脈采血測空腹血糖，血糖值大于或等于16.7 mmol/L則視為造模成功。

3.2 NRK-52E 細(xì)胞的培養(yǎng) 將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入恒溫培養(yǎng)箱等待細(xì)胞貼壁，設(shè)定5% CO2，37 ℃恒溫的培養(yǎng)條件，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時可進(jìn)行傳代并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為高糖（high glucose，HG；30 mmol/L葡萄糖）組和NG組。

3.3 動物的處死和體液采集 成模16 周后處死各組小鼠，處死前1 d 用代謝籠收集24 h 尿液，記錄尿量，收集的尿液離心后取部分上清送檢；處死前禁食4 h，麻醉，稱重，眼眶取血，4 000 r/min 離心10 min 分離血清，將血清置于-20 ℃冷凍保存；取血后剪開腹腔暴露雙側(cè)腎臟，在冰上輕柔去除腎臟外包膜，稱取雙側(cè)腎臟重量后取一部分腎臟用4%中性甲醛固定，其余部分置于-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存。

3.4 動物生化指標(biāo)的檢測 用葡萄糖氧化酶法檢測血糖（blood glucose，BG），脲酶連續(xù)監(jiān)測法檢測血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN），氧化酶法檢測血清肌酐（serum creatinine，SCr），免疫比濁法檢測尿微量白蛋白（microalbumin，MALB），氧化酶法檢測尿肌酐（urine creatinine，U-Crea），鄰苯三酚紅鉬法測尿總蛋白（urinary total protein，UTP）。以尿蛋白濃度乘以24 h尿量作為24 h UTP。

3.5 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 取部分4%中性甲醛固定的小鼠腎組織，用石蠟包埋后切片。脫蠟后進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察腎組織切片的形態(tài)學(xué)改變。

3.6 Western blot 檢測小鼠腎皮質(zhì)及NRK-52E 細(xì)胞中ATM、p-ATM、Chk2、p-Chk2 和DDIT4 蛋白水平稱取 0.1 g 小鼠腎皮質(zhì)，加入 500 μL 裂解液，在管內(nèi)放入磁珠經(jīng)組織研磨機(jī)研磨成液體，于4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，吸取上清于新的EP 管中，即為所提取的蛋白溶液，BCA 法蛋白定量后，根據(jù)濃度加入適量的上樣緩沖液，經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入Ⅰ抗（anti-DDIT4、anti-ATM 和 anti-p-ATM 均按 1∶2 000 稀釋，anti-Chk2 和 anti-p-Chk2 按 1∶1 000稀釋，anti-β-actin 按1∶5 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，次日回收Ⅰ抗，TBST 洗膜后，加入Ⅱ抗，室溫孵育1 h，經(jīng)ECL 顯影液顯影，成像儀曝光。所得蛋白條帶用Image Lab 5.1軟件分析處理。

3.7 彗星實(shí)驗(yàn)檢測DNA的DSBs情況 提前準(zhǔn)備好所需液體和制膠倒模，取正常熔點(diǎn)瓊脂糖0.3 g 和50 mL PBS，微波爐中加熱至沸騰，將正常熔點(diǎn)瓊脂糖液倒入模具，待其凝固，放入烤箱內(nèi)烘干12 h 以上，收取細(xì)胞懸液，取0.3 g 低熔點(diǎn)瓊脂糖和50 mL PBS，加熱至沸騰制備低熔點(diǎn)瓊脂糖液，將細(xì)胞懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖液按1∶1 混合，吹打混勻后迅速倒在第1層膠上。常溫放置待其凝固，放入4 ℃冰箱冷卻15 min以上，再倒入至少1 cm厚的裂解液，避光平放入 4 ℃冰箱，裂解 5～8 h，裂解后用 PBS 輕柔沖洗膠，于25 V、300 mA 電泳，完成后用中和液迅速沖洗2 次，風(fēng)干5 min，再將膠轉(zhuǎn)移到載玻片上，以5 mg/L的EB 染色液染色，避光風(fēng)干5 min，鏡下觀察彗尾長度。

3.8 流式細(xì)胞術(shù) 收取細(xì)胞，用70%乙醇固定液充分重懸細(xì)胞，放入4 ℃冰箱固定24 h。800 r/min離心4 min，倒掉固定液，加入PBS 充分重懸細(xì)胞；800 r/min 離心 4 min，倒掉 PBS，加入周期試劑盒 PI 染色buffer、每管500 μL，避光常溫放置15 min，選擇相應(yīng)檢測指標(biāo)和停止條件，設(shè)出對應(yīng)的門，重懸細(xì)胞并放入樣本夾，等待探針吸取細(xì)胞。將G1、S 和G2期細(xì)胞比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，判斷細(xì)胞阻滯的周期。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Western blot 圖像的數(shù)據(jù)提取使用Image Lab 軟件。彗星實(shí)驗(yàn)圖像的數(shù)據(jù)提取使用CASP 軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）形式。兩組間的對比在正態(tài)性檢驗(yàn)之后用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DM小鼠生化指標(biāo)的變化

DM 組小鼠BG、BUN、24 h MALB、24 h UTP、SCr和腎臟指數(shù)（kidney index，KI）均明顯高于NC 組，見表1。

表1 NC組和DM組小鼠血糖、血尿素氮、24 h尿微量白蛋白、24 h尿總蛋白、血清肌酐和腎臟指數(shù)的變化Table 1. The changes of blood glucose（BG），blood urea nitrogen（BUN），24 h urinary microalbumin（MALB），24 h urinary total protein（UTP），serum creatinine（SCr）and kidney index（KI）in NC and DM groups（Mean±SD. n=6）

2 DM小鼠腎組織的病理變化

小鼠腎組織HE 染色后可見，NC 組小鼠腎小球形態(tài)較規(guī)則，腎小管結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤；DM 組小鼠腎小管排列紊亂，且發(fā)生了萎縮，腎小管與基底膜有黏連，間質(zhì)有炎癥細(xì)胞浸潤，見圖1。

3 DM 小鼠腎皮質(zhì)及HG 培養(yǎng)的NRK-52E 細(xì)胞中ATM、p-ATM、Chk2和p-Chk2蛋白水平的變化

Western blot 結(jié)果顯示，與 NC 組相比，DM 組中的 ATM 和 Chk2 無明顯變化，p-ATM 和 p-Chk2 蛋白水平增加（P＜0.05）；HG 組同NG 組比較也呈同樣的變化，見圖2、3。

Figure 1. The histomorphological changes of renal tissues in NC and DM groups.圖1 NC組和DM組小鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化

Figure 2. The protein levels of p-ATM and p-Chk2 in kidney tissues of NC and DM groups. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs NC group.圖2 NC組和DM組小鼠腎組織中p-ATM和p-Chk2蛋白水平的變化

4 HG培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞DNA的DSBs情況

彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NG 組相比，HG 組細(xì)胞彗尾更長（P＜0.05），DNA雙鏈斷裂程度加重，見圖4。

5 HG培養(yǎng)后NRK-52E細(xì)胞發(fā)生了周期阻滯

與 NG 組相比，HG 培養(yǎng) 24 h 與 48 h 的細(xì)胞均發(fā)生了明顯的細(xì)胞周期阻滯，HG 培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞阻滯在G1期（P＜0.05），HG 培養(yǎng)48 h 后的細(xì)胞阻滯在S期（P＜0.05），見圖5。

6 DM 小鼠腎皮質(zhì)及HG 培養(yǎng)的NRK-52E 細(xì)胞中DDIT4表達(dá)水平的變化

Western blot 結(jié)果顯示，與 NC 組相比，DM 組中的DDIT4 的蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；HG 組與NG 組比較也降低，見圖6、7。

Figure 3. The protein levels of p-ATM and p-Chk2 in the NRK-52E cells of NG group and HG group. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG group.圖3 NG組和HG組細(xì)胞中p-ATM和p-Chk2的蛋白表達(dá)水平

Figure 4. The length of comet tail in NG group and HG group. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG group.圖4 正常糖和高糖組細(xì)胞慧尾長度的變化

7 HG 培 養(yǎng) 的 NRK-52E 細(xì) 胞 過 表 達(dá) DDIT4 后ATM、p-ATM、Chk2和p-Chk2蛋白水平的變化

HG 培養(yǎng)的NRK-52E 細(xì)胞中過表達(dá)DDIT4 后，ATM 和Chk2表達(dá)無明顯變化，p-ATM 和p-Chk2的蛋白水平明顯降低（P＜0.05），見圖8。

8 HG培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞過表達(dá)DDIT4使DNA的DSBs程度減輕

將分別轉(zhuǎn)染DDIT4 空載質(zhì)粒和DDIT4 過表達(dá)質(zhì)粒的NRK-52E 細(xì)胞分別用NG 和HG 培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h 后收集活細(xì)胞，通過彗星實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，在過表達(dá)DDIT4 后，DNA 雙鏈斷裂的程度有所改善（P＜0.05），見圖9。

9 HG 培養(yǎng)的NRK-52E 細(xì)胞分別過表達(dá)和抑制miR-22 后 ATM、p-ATM、Chk2、p-Chk2 和 DDIT4蛋白水平的變化

HG 培養(yǎng)的NRK-52E 細(xì)胞中過表達(dá)miR-22 后，ATM 和Chk2表達(dá)無明顯變化，p-ATM 和p-Chk2的蛋白水平增加，DDIT4 的蛋白水平降低（P＜0.05）；抑制miR-22 后，ATM 和 Chk2 表達(dá)無明顯變化，p-ATM 和p-Chk2的蛋白水平降低，DDIT4的蛋白水平增加（P＜0.05），提示 miR-22 可能抑制了DDIT4 的表達(dá)，促進(jìn)DNA損傷，見圖10、11。

Figure 5. Cell cycle distribution in normal and high glucose concentrations after 24 and 48 h. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG group.圖5 正常糖和高糖培養(yǎng)24和48 h后細(xì)胞周期分布的分析

Figure 6. The protein expression levels of DDIT4 in kidney tissues of NC group and DM group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs NC group.圖6 NC組和DM組小鼠腎組織中DDIT4蛋白表達(dá)水平的比較

Figure 7. The protein expression levels of DDIT4 in the NRK-52E cells of NG and HG groups. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG group.圖7 NG組和HG組細(xì)胞中DDIT4蛋白表達(dá)水平的比較

討 論

DKD 的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及了腎臟血流動力學(xué)變化、氧化應(yīng)激、炎癥和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)過度活躍等［10］，其中高血糖引起的氧化應(yīng)激是DKD 發(fā)展的關(guān)鍵因素，會導(dǎo)致蛋白氧化，脂質(zhì)過氧化及 DNA 損傷的發(fā)生［11］。其中 DNA 損傷在 DKD病程進(jìn)展中起著重要作用，ATM-Chk2 信號通路是DNA 損傷修復(fù)的信號通路之一，DSBs 時，ATM 會迅速磷酸化而活化下游的Chk2，導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生阻滯。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞p-ATM 和p-Chk2 的蛋白水平明顯升高，細(xì)胞慧尾變長，細(xì)胞周期發(fā)生了阻滯，提示高糖促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生DNA 損傷，且DNA 損傷修復(fù)通路ATMChk2被激活。

Figure 8. The protein levels of p-Chk2，p-ATM and DDIT4 under the condition of DDIT4 over-expression（DDIT4ov）. Con：control.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG+Con group；#P＜0.05 vs HG+Con group.圖8 過表達(dá)DDIT4后p-Chk2、p-ATM和DDIT4蛋白水平的變化

Figure 9. The length of comet tail under the condition of DDIT4 over-expression（DDIT4ov）in NG group and HG group. Con：control. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG+Con group；#P＜0.05 vs HG+Con group.圖9 正常糖和高糖過表達(dá)DDIT4后細(xì)胞慧尾長度的變化

DDIT4 是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白，其表達(dá)受幾種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)，包括缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力和DNA 損傷［12-13］。作為 DNA 損傷負(fù)調(diào)控因子，DDIT4 在高糖情況下的表達(dá)下降［14］，提示其可能參與DKD 時的DNA 損傷。我們的結(jié)果顯示，高糖狀態(tài)下，DDIT4 的表達(dá)降低；過表達(dá)DDIT4后，p-ATM 和p-Chk2的蛋白表達(dá)水平明顯下降，細(xì)胞慧尾變短，提示DDIT4 能抑制高糖誘導(dǎo)的DNA 損傷，然而具體的調(diào)控機(jī)制尚不甚清楚。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miRNA 可能通過靶向調(diào)控DDIT4 的表達(dá)發(fā)揮抑制 DNA 損傷修復(fù)作用［15-16］。在膀胱尿路上皮癌中，miR-22 可以負(fù)調(diào)控DDIT4 的表達(dá)［17］，而在 DKD 中，miR-22 是否同樣發(fā)揮負(fù)調(diào)控DDIT4 的表達(dá)，抑制DKD 時DNA 損傷修復(fù)的作用不清楚。因此為了進(jìn)一步驗(yàn)證此猜想，本研究在高糖狀態(tài)下轉(zhuǎn)染miR-22 mimics，觀察到DDIT4 的表達(dá)受到明顯抑制，且p-ATM 和p-Chk2 的蛋白水平明顯升高；而轉(zhuǎn)染 miR-22 inhibitor 后，DDIT4 的表達(dá)明顯升高，p-ATM 和p-Chk2的蛋白水平受到抑制，這一結(jié)果提示miR-22可能通過靶向抑制DDIT4的表達(dá)進(jìn)而抑制DNA損傷修復(fù)。

Figure 10. The protein levels of p-Chk2，p-ATM and DDIT4 under the condition of miR-22 over-expression（mimics）. Con：control.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG+Con group；#P＜0.05 vs HG+Con group.圖10 過表達(dá)miR-22后p-Chk2、p-ATM和DDIT4蛋白水平的變化

Figure 11. The protein levels of p-Chk2，p-ATM and DDIT4 under the condition of miR-22 inhibition（inhibitor）. Con：control.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG+Con group；#P＜0.05 vs HG+Con group.圖11 抑制miR-22后p-Chk2、p-ATM和DDIT4蛋白水平的變化

綜上所述，體內(nèi)外高糖環(huán)境可導(dǎo)致DNA 損傷加重，高糖環(huán)境中大鼠腎小管上皮細(xì)胞DDIT4 的表達(dá)降低，過表達(dá)DDIT4 可以減輕DNA 損傷。miR-22 可靶向抑制DDIT4 促進(jìn)糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞DNA 的損傷，促進(jìn)了 DKD 的發(fā)生發(fā)展，為 DKD 的治療帶來了新的啟發(fā)和一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。