張東鵬，潘正波，宋昕

1天津醫(yī)院泌尿外科（天津300211）；2臺州市立醫(yī)院泌尿外科（浙江臺州318000）

膀胱癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，屬于泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一［1－2］。膀胱癌的病因較為復雜，既有內在的遺傳因素、也有外在的環(huán)境因素。目前臨床治療的方式有手術、化療、放射治療等，但是由于膀胱癌腫瘤的異質性較大，復發(fā)率高，且還容易出現(xiàn)局部浸潤以及遠處轉移，所以常常導致患者的預后不佳［3－4］。目前的腫瘤指標對膀胱癌的特異性、準確性較低，且缺乏對膀胱癌的分化、分期指導不足，尋求能夠檢測膀胱癌分化、分期的指標尤為迫切。層粘連蛋白亞基B3（laminin subunit B3，LAMB3）蛋白是層粘連蛋白β亞基，其余α、γ亞基在一起能夠形成層粘連蛋白5。睪丸白聚糖（testicular leukan，SPOCK1）是睪丸蛋白聚糖，其基因位于5q31.2，編碼血漿蛋白聚糖的蛋白核心［5］。富含脯氨酸蛋白11基因（proline rich protein 11 gene，PRR11）位于染色體17q22上，編碼360個氨基酸的蛋白［6－7］。臨床上以上三者在膀胱癌中的表達均有所研究，但三者聯(lián)合在膀胱癌中的研究尚未有報道。本文研究中對LAMB3、SPOCK1、PRR11進行檢測，旨在研究LAMB3、SPOCK1、PRR11在膀胱癌組織中的表達及相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性選取2016年3月至2020年3月進行膀胱腫瘤根治性切除術的膀胱癌患者53例，其中包括男31例，女22例，年齡41～75歲，平均（58.1±13.5）歲；腫瘤最大徑：＞3 cm 29例，≤3 cm 24例；TNM分期為Tis、Ta、T1期（38例），38例患者均進行膀胱腫瘤根治性切除術，其中腫瘤最大徑＞3 cm 19例，腫瘤最大徑≤3 cm 19例，無遠處轉移者，T2、T3、T4期（15例）；病理分期高分化患者28例，中分化患者16例，低分化患者9例；有淋巴結轉移者13例，無淋巴結轉移者40例。納入標準：所有患者均符合中華醫(yī)學會中對膀胱癌的診斷標準［8］；所有患者均具有手術指征，且自愿進行手術；所有患者及家屬對本研究均知情，簽署知情通知書，并通過我院倫理委員會認可（批準文號：2016倫審等58號）。排除標準：（1）有手術禁忌證者；（2）其他部位并發(fā)惡性腫瘤者；（3）合并有膀胱炎者；（4）依從性差，無法配合者。

1.2 標本采集、免疫組化 取手術后患者切除的癌組織以及距離癌組織5 cm癌旁組織標本，隨后將組織標本切成5 mm×5 mm小塊進行處理。反復清洗之后放置在甲醛溶液浸泡。脫水之后進行石蠟包埋，然后4μm厚度進行切片，在60℃環(huán)境下烤3 h后進行脫蠟水化。將檸檬酸修復液放置在高壓鍋內煮沸之后放入切片，2 min之后降溫開蓋，自然冷卻之后使用PBS液清洗，3 min／次，共清洗3次，之后滴加POD阻斷劑后孵育0.5 h，隨后再次使用PBS進行清洗，滴加一抗之后在4℃環(huán)境下過夜，次日取出之后使用PBS清洗，加入二抗，在完全覆蓋狀態(tài)下常溫進行孵育，30 min之后再次使用PBS液清洗，隨后進行DAB染色，使用顯微鏡進行觀察，蘇木精進行核染，反藍，脫水處理之后封片。

1.3 LAMB3、SPOCK1、PRR11表達檢測 使用Western blot法檢測LAMB3、SPOCK1、PRR11表達：對標本以PBS緩沖液進行沖洗后，行30 min裂解，隨后對蛋白濃度進行測定。隨后電泳20μg／孔蛋白質的同時加入蛋白緩沖液，電泳10 min后將電轉膜放置在牛奶（濃度為10%）中進行浸泡，在常溫封閉環(huán)境下孵育1 d。次日將電轉膜取出后使用TBST溶液進行沖洗，沖洗后結合二抗。1 h后進行清洗、顯色，對LAMB3、SPOCK1、PRR11表達進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）描述，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間行F檢驗，因素間的相關性采用Spearman相關性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 癌組織、癌旁組織LAMB3、SPOCK1、PRR11表達對比 癌組織中LAMB3、SPOCK1、PRR11表達高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1～2。

表1 癌組織、癌旁組織LAMB3、SPOCK1、PRR11表達對比±s

表1 癌組織、癌旁組織LAMB3、SPOCK1、PRR11表達對比±s

項目 例數(shù)LAMB3 SPOCK1 PRR11癌旁組織53 0.21±0.01 0.20±0.04 0.29±0.03癌組織 53 1.04±0.19 1.31±0.21 1.34±0.19 t值 31.760 37.800 39.740 P值0.001 0.001 0.001

圖1 癌組織、癌旁組織LAMB3、SPOCK1、PRR11免疫組化染色圖（×400）

2.2 膀胱癌LAMB3、SPOCK1、PRR11表達一般資料對比 不同性別、不同年齡下癌組織LAMB3、SPOCK1、PRR11表達相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），有無吸煙史情況下膀胱癌患者癌組織內LAMB3、SPOCK1、PRR11表達相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 膀胱癌LAMB3、SPOCK1、PRR11表達一般資料對比 ±s

表2 膀胱癌LAMB3、SPOCK1、PRR11表達一般資料對比 ±s

項目 例數(shù)LAMB3 SPOCK1 PRR11性別 男 31 1.07±0.21 1.32±0.16 1.38±0.22 女 22 1.06±0.20 1.31±0.18 1.36±0.24 t值 0.174 0.213 0.314 P值 0.862 0.832 0.755年齡 ≤60歲 27 1.07±0.18 1.30±0.19 1.34±0.24 ＞60歲 26 1.08±0.21 1.32±0.16 1.32±0.21 t值 0.186 0.414 0.322 P值 0.853 0.680 0.748吸煙史 有 16 1.04±0.18 1.35±0.21 1.37±0.17 無 37 1.05±0.16 1.32±0.18 1.33±0.16 t值 0.201 0.530 0.216 P值0.842 0.590 0.829

圖2 LAMB3、SPOCK1、PRR11基因蛋白印跡圖

2.3 膀胱癌患者LAMB3、SPOCK1、PRR11表達與病理特征關系 腫瘤最大徑＞3 cm患者癌組織LAMB3、SPOCK1、PRR11表達高于腫瘤最大徑≤3 cm患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；有淋巴結轉移膀胱癌患者癌組織LAMB3、SPOCK1、PRR11表達高于無淋巴轉移膀胱癌患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TNM 分期T2、T3、T4期膀胱癌患者LAMB3、SPOCK1、PRR11表達高于TNM 分期Tis、Ta、T1期膀胱癌患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；低分化膀胱癌患者癌組織中LAMB3、SPOCK1、PRR11表達高于高、中分化膀胱癌患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 膀胱癌患者LAMB3、SPOCK1、PRR11表達與病理特征關系 ±s

表3 膀胱癌患者LAMB3、SPOCK1、PRR11表達與病理特征關系 ±s

病理特征 例數(shù)LAMB3 SPOCK1 PRR11腫瘤最大徑 ＞3 cm 29 1.25±0.20 1.39±0.21 1.38±0.21 ≤3 cm 24 1.02±0.18 1.27±0.14 1.26±0.19 t值 4.358 2.392 2.161 P值 0.001 0.020 0.035淋巴結轉移 無 40 1.04±0.12 1.28±0.19 1.24±0.20 有 13 1.23±0.24 1.45±0.36 1.48±0.39 t值 3.797 2.209 2.918 P值 0.001 0.032 0.005 TNM分期 Tis、Ta、T1期 38 0.99±0.15 1.28±0.30 1.19±0.15 T2、T3、T4期 15 1.24±0.24 1.45±0.40 1.28±0.18 t值 4.573 2.096 2.368 P值 0.001 0.040 0.021分化情況 高分化 28 0.95±0.13 1.26±0.21 1.18±0.21 中分化 16 1.06±0.14 1.31±0.14 1.24±0.22 低分化 9 1.30±0.21 1.38±0.19 1.38±0.41 F值 6.859 10.264 9.538 P值0.001 0.001 0.001

2.4 LAMB3、SPOCK1、PRR11在膀胱癌組織中相關性 膀胱癌組織中LAMB3、SPOCK1呈正相關（r＝0.357，P＝0.008）；膀胱癌組織中LAMB3、PRR11表達呈正相關（r＝0.366，P＝0.006）；膀胱癌組織中SPOCK1、PRR11在膀胱癌組織中呈現(xiàn)出正相關（r＝0.534，P＝0.001）。見圖3。

圖3 LAMB3、SPOCK1、PRR11在膀胱癌組織中相關性

3 討論

膀胱癌是臨床較為常見的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，其在全球內有著較高的發(fā)病率。臨床上常見的病理類型有膀胱移行細胞癌和膀胱未移行細胞癌、鱗癌等，其中以移行細胞癌較為常見［9－10］。臨床上治療膀胱癌的手段為手術治療、生物治療、放化療等手段。但是低分化、高分期的患者進行治療后預后的效果不佳，且長期的生存時間較短［11］。因此需要能早期發(fā)現(xiàn)、并能預檢膀胱癌分化、分期的臨床檢測指標。

LAMB3作為層粘連蛋白家族的成員之一，其是基底層重要的生物活性成分，其有著調控細胞的分化、遷移、黏附以及增生、存活等生物學功能［12－13］。LAMB3能夠參與和促進多種惡性腫瘤的進展，從而影響到宮頸癌、頭頸鱗癌等惡性腫瘤的侵襲以及轉移。本研究中發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中的LAMB3異常上升，高于膀胱癌癌旁組織，此結果可能提示著LAMB3 mRNA的3＇非編碼區(qū)，降低LAMB3 mRNA的穩(wěn)定型，導致LAMB3表達量增加。本研究中還發(fā)現(xiàn)，腫瘤分期Ⅲ＋Ⅳ期膀胱癌患者且伴隨著淋巴結轉移患者的癌組織LAMB3表達明顯較高，提示著LAMB3能夠促進膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。其原因為LAMB3表達上調能夠直接或者間接地促進腫瘤細胞中上皮間質轉化相關轉錄因子Slug等的表達，促進腫瘤細胞的浸潤以及轉移，導致腫瘤分期升高［14－15］。

SPOCK1作為一種細胞外基質的蛋白聚糖，是鈣離子結合蛋白多糖家族的成員，能夠影響細胞的發(fā)育分化以及增殖等生物學行為，其參與了細胞之間以及細胞與基質之間的相互作用［16－17］。本研究中對膀胱癌組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)SPOCK1在膀胱癌組織中呈現(xiàn)出高表達，且腫瘤最大徑大、Ⅲ～Ⅳ期、低分化以及有淋巴結轉移的膀胱癌患者癌組織中SPOCK1表達量增加，進一步說明SPOCK1的異常表達與膀胱癌相對應的病理特征有著一定的相關性，其參與了臨床膀胱癌的發(fā)生及演進過程。有研究發(fā)現(xiàn)，SPOCK1在肺癌、肝癌等惡性腫瘤中呈現(xiàn)出高表達，當SPOCK1出現(xiàn)高表達時，能夠導致腫瘤癌細胞增殖和轉移，并能夠促進腫瘤的惡性進展［18］。這與本研究結果相佐證。

PRR11位于染色體17q22之上，其在調節(jié)細胞周期S期到G2／M其進程中發(fā)揮著重要的作用，并且還能夠導致早熟染色質的發(fā)生。本研究結果顯示，PRR11在膀胱癌癌組織中呈現(xiàn)出高表達，其在腫瘤最大徑大、晚期、低分化、有淋巴結轉移的膀胱癌患者癌組織中表達量較高，由此可得，PRR11異常表達能夠與膀胱癌病理特征關系密切，有著一定的相關性，其可能參與了膀胱癌的發(fā)生及演進過程。有研究發(fā)現(xiàn)PRR11與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后有著相關性［19－20］。

本研究中對膀胱癌組織中LAMB3、SPOCK1以及PRR11進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)三者互相呈正相關，說明三者可能存在某種內在聯(lián)系，三者能夠共同作用，調控膀胱癌細胞，共同參與到膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。其內在聯(lián)系或為膀胱癌細胞介導，進一步說明其與膀胱癌細胞的增殖、分化、分期有關。但本研究中選病例數(shù)較少，有著一定的局限性，且本研究中未對其機制進行進一步研究，期待未來完善相關研究。

綜上所述，LAMB3、SPOCK1、PRR11在膀胱癌組織中呈現(xiàn)出高表達，且與腫瘤大小、有無淋巴結轉移、TNM分期、分化程度密切相關，呈現(xiàn)出正相關的存在，LAMB3、SPOCK1、PRR11可能共同參與了膀胱癌的發(fā)展演進。