張東鵬，潘正波，宋昕

1天津醫(yī)院泌尿外科（天津300211）；2臺(tái)州市立醫(yī)院泌尿外科（浙江臺(tái)州318000）

膀胱癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，屬于泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是全身十大常見(jiàn)腫瘤之一［1－2］。膀胱癌的病因較為復(fù)雜，既有內(nèi)在的遺傳因素、也有外在的環(huán)境因素。目前臨床治療的方式有手術(shù)、化療、放射治療等，但是由于膀胱癌腫瘤的異質(zhì)性較大，復(fù)發(fā)率高，且還容易出現(xiàn)局部浸潤(rùn)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，所以常常導(dǎo)致患者的預(yù)后不佳［3－4］。目前的腫瘤指標(biāo)對(duì)膀胱癌的特異性、準(zhǔn)確性較低，且缺乏對(duì)膀胱癌的分化、分期指導(dǎo)不足，尋求能夠檢測(cè)膀胱癌分化、分期的指標(biāo)尤為迫切。層粘連蛋白亞基B3（laminin subunit B3，LAMB3）蛋白是層粘連蛋白β亞基，其余α、γ亞基在一起能夠形成層粘連蛋白5。睪丸白聚糖（testicular leukan，SPOCK1）是睪丸蛋白聚糖，其基因位于5q31.2，編碼血漿蛋白聚糖的蛋白核心［5］。富含脯氨酸蛋白11基因（proline rich protein 11 gene，PRR11）位于染色體17q22上，編碼360個(gè)氨基酸的蛋白［6－7］。臨床上以上三者在膀胱癌中的表達(dá)均有所研究，但三者聯(lián)合在膀胱癌中的研究尚未有報(bào)道。本文研究中對(duì)LAMB3、SPOCK1、PRR11進(jìn)行檢測(cè)，旨在研究LAMB3、SPOCK1、PRR11在膀胱癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性選取2016年3月至2020年3月進(jìn)行膀胱腫瘤根治性切除術(shù)的膀胱癌患者53例，其中包括男31例，女22例，年齡41～75歲，平均（58.1±13.5）歲；腫瘤最大徑：＞3 cm 29例，≤3 cm 24例；TNM分期為Tis、Ta、T1期（38例），38例患者均進(jìn)行膀胱腫瘤根治性切除術(shù)，其中腫瘤最大徑＞3 cm 19例，腫瘤最大徑≤3 cm 19例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，T2、T3、T4期（15例）；病理分期高分化患者28例，中分化患者16例，低分化患者9例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者13例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)中對(duì)膀胱癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］；所有患者均具有手術(shù)指征，且自愿進(jìn)行手術(shù)；所有患者及家屬對(duì)本研究均知情，簽署知情通知書(shū)，并通過(guò)我院倫理委員會(huì)認(rèn)可（批準(zhǔn)文號(hào)：2016倫審等58號(hào)）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有手術(shù)禁忌證者；（2）其他部位并發(fā)惡性腫瘤者；（3）合并有膀胱炎者；（4）依從性差，無(wú)法配合者。

1.2 標(biāo)本采集、免疫組化 取手術(shù)后患者切除的癌組織以及距離癌組織5 cm癌旁組織標(biāo)本，隨后將組織標(biāo)本切成5 mm×5 mm小塊進(jìn)行處理。反復(fù)清洗之后放置在甲醛溶液浸泡。脫水之后進(jìn)行石蠟包埋，然后4μm厚度進(jìn)行切片，在60℃環(huán)境下烤3 h后進(jìn)行脫蠟水化。將檸檬酸修復(fù)液放置在高壓鍋內(nèi)煮沸之后放入切片，2 min之后降溫開(kāi)蓋，自然冷卻之后使用PBS液清洗，3 min／次，共清洗3次，之后滴加POD阻斷劑后孵育0.5 h，隨后再次使用PBS進(jìn)行清洗，滴加一抗之后在4℃環(huán)境下過(guò)夜，次日取出之后使用PBS清洗，加入二抗，在完全覆蓋狀態(tài)下常溫進(jìn)行孵育，30 min之后再次使用PBS液清洗，隨后進(jìn)行DAB染色，使用顯微鏡進(jìn)行觀察，蘇木精進(jìn)行核染，反藍(lán)，脫水處理之后封片。

1.3 LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)檢測(cè) 使用Western blot法檢測(cè)LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)：對(duì)標(biāo)本以PBS緩沖液進(jìn)行沖洗后，行30 min裂解，隨后對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。隨后電泳20μg／孔蛋白質(zhì)的同時(shí)加入蛋白緩沖液，電泳10 min后將電轉(zhuǎn)膜放置在牛奶（濃度為10%）中進(jìn)行浸泡，在常溫封閉環(huán)境下孵育1 d。次日將電轉(zhuǎn)膜取出后使用TBST溶液進(jìn)行沖洗，沖洗后結(jié)合二抗。1 h后進(jìn)行清洗、顯色，對(duì)LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間行F檢驗(yàn)，因素間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織、癌旁組織LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)對(duì)比 癌組織中LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖1～2。

表1 癌組織、癌旁組織LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)對(duì)比±s

表1 癌組織、癌旁組織LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)對(duì)比±s

項(xiàng)目 例數(shù)LAMB3 SPOCK1 PRR11癌旁組織53 0.21±0.01 0.20±0.04 0.29±0.03癌組織 53 1.04±0.19 1.31±0.21 1.34±0.19 t值 31.760 37.800 39.740 P值0.001 0.001 0.001

圖1 癌組織、癌旁組織LAMB3、SPOCK1、PRR11免疫組化染色圖（×400）

2.2 膀胱癌LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)一般資料對(duì)比 不同性別、不同年齡下癌組織LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有無(wú)吸煙史情況下膀胱癌患者癌組織內(nèi)LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 膀胱癌LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)一般資料對(duì)比 ±s

表2 膀胱癌LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)一般資料對(duì)比 ±s

項(xiàng)目 例數(shù)LAMB3 SPOCK1 PRR11性別 男 31 1.07±0.21 1.32±0.16 1.38±0.22 女 22 1.06±0.20 1.31±0.18 1.36±0.24 t值 0.174 0.213 0.314 P值 0.862 0.832 0.755年齡 ≤60歲 27 1.07±0.18 1.30±0.19 1.34±0.24 ＞60歲 26 1.08±0.21 1.32±0.16 1.32±0.21 t值 0.186 0.414 0.322 P值 0.853 0.680 0.748吸煙史 有 16 1.04±0.18 1.35±0.21 1.37±0.17 無(wú) 37 1.05±0.16 1.32±0.18 1.33±0.16 t值 0.201 0.530 0.216 P值0.842 0.590 0.829

圖2 LAMB3、SPOCK1、PRR11基因蛋白印跡圖

2.3 膀胱癌患者LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)與病理特征關(guān)系 腫瘤最大徑＞3 cm患者癌組織LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)高于腫瘤最大徑≤3 cm患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱癌患者癌組織LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移膀胱癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TNM 分期T2、T3、T4期膀胱癌患者LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)高于TNM 分期Tis、Ta、T1期膀胱癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低分化膀胱癌患者癌組織中LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)高于高、中分化膀胱癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 膀胱癌患者LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)與病理特征關(guān)系 ±s

表3 膀胱癌患者LAMB3、SPOCK1、PRR11表達(dá)與病理特征關(guān)系 ±s

病理特征 例數(shù)LAMB3 SPOCK1 PRR11腫瘤最大徑 ＞3 cm 29 1.25±0.20 1.39±0.21 1.38±0.21 ≤3 cm 24 1.02±0.18 1.27±0.14 1.26±0.19 t值 4.358 2.392 2.161 P值 0.001 0.020 0.035淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無(wú) 40 1.04±0.12 1.28±0.19 1.24±0.20 有 13 1.23±0.24 1.45±0.36 1.48±0.39 t值 3.797 2.209 2.918 P值 0.001 0.032 0.005 TNM分期 Tis、Ta、T1期 38 0.99±0.15 1.28±0.30 1.19±0.15 T2、T3、T4期 15 1.24±0.24 1.45±0.40 1.28±0.18 t值 4.573 2.096 2.368 P值 0.001 0.040 0.021分化情況 高分化 28 0.95±0.13 1.26±0.21 1.18±0.21 中分化 16 1.06±0.14 1.31±0.14 1.24±0.22 低分化 9 1.30±0.21 1.38±0.19 1.38±0.41 F值 6.859 10.264 9.538 P值0.001 0.001 0.001

2.4 LAMB3、SPOCK1、PRR11在膀胱癌組織中相關(guān)性 膀胱癌組織中LAMB3、SPOCK1呈正相關(guān)（r＝0.357，P＝0.008）；膀胱癌組織中LAMB3、PRR11表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.366，P＝0.006）；膀胱癌組織中SPOCK1、PRR11在膀胱癌組織中呈現(xiàn)出正相關(guān)（r＝0.534，P＝0.001）。見(jiàn)圖3。

圖3 LAMB3、SPOCK1、PRR11在膀胱癌組織中相關(guān)性

3 討論

膀胱癌是臨床較為常見(jiàn)的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，其在全球內(nèi)有著較高的發(fā)病率。臨床上常見(jiàn)的病理類型有膀胱移行細(xì)胞癌和膀胱未移行細(xì)胞癌、鱗癌等，其中以移行細(xì)胞癌較為常見(jiàn)［9－10］。臨床上治療膀胱癌的手段為手術(shù)治療、生物治療、放化療等手段。但是低分化、高分期的患者進(jìn)行治療后預(yù)后的效果不佳，且長(zhǎng)期的生存時(shí)間較短［11］。因此需要能早期發(fā)現(xiàn)、并能預(yù)檢膀胱癌分化、分期的臨床檢測(cè)指標(biāo)。

LAMB3作為層粘連蛋白家族的成員之一，其是基底層重要的生物活性成分，其有著調(diào)控細(xì)胞的分化、遷移、黏附以及增生、存活等生物學(xué)功能［12－13］。LAMB3能夠參與和促進(jìn)多種惡性腫瘤的進(jìn)展，從而影響到宮頸癌、頭頸鱗癌等惡性腫瘤的侵襲以及轉(zhuǎn)移。本研究中發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中的LAMB3異常上升，高于膀胱癌癌旁組織，此結(jié)果可能提示著LAMB3 mRNA的3＇非編碼區(qū)，降低LAMB3 mRNA的穩(wěn)定型，導(dǎo)致LAMB3表達(dá)量增加。本研究中還發(fā)現(xiàn)，腫瘤分期Ⅲ＋Ⅳ期膀胱癌患者且伴隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的癌組織LAMB3表達(dá)明顯較高，提示著LAMB3能夠促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。其原因?yàn)長(zhǎng)AMB3表達(dá)上調(diào)能夠直接或者間接地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug等的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤分期升高［14－15］。

SPOCK1作為一種細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白聚糖，是鈣離子結(jié)合蛋白多糖家族的成員，能夠影響細(xì)胞的發(fā)育分化以及增殖等生物學(xué)行為，其參與了細(xì)胞之間以及細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用［16－17］。本研究中對(duì)膀胱癌組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SPOCK1在膀胱癌組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)，且腫瘤最大徑大、Ⅲ～Ⅳ期、低分化以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者癌組織中SPOCK1表達(dá)量增加，進(jìn)一步說(shuō)明SPOCK1的異常表達(dá)與膀胱癌相對(duì)應(yīng)的病理特征有著一定的相關(guān)性，其參與了臨床膀胱癌的發(fā)生及演進(jìn)過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)，SPOCK1在肺癌、肝癌等惡性腫瘤中呈現(xiàn)出高表達(dá)，當(dāng)SPOCK1出現(xiàn)高表達(dá)時(shí)，能夠?qū)е履[瘤癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并能夠促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展［18］。這與本研究結(jié)果相佐證。

PRR11位于染色體17q22之上，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期S期到G2／M其進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用，并且還能夠?qū)е略缡烊旧|(zhì)的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，PRR11在膀胱癌癌組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)，其在腫瘤最大徑大、晚期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者癌組織中表達(dá)量較高，由此可得，PRR11異常表達(dá)能夠與膀胱癌病理特征關(guān)系密切，有著一定的相關(guān)性，其可能參與了膀胱癌的發(fā)生及演進(jìn)過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)PRR11與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有著相關(guān)性［19－20］。

本研究中對(duì)膀胱癌組織中LAMB3、SPOCK1以及PRR11進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)三者互相呈正相關(guān)，說(shuō)明三者可能存在某種內(nèi)在聯(lián)系，三者能夠共同作用，調(diào)控膀胱癌細(xì)胞，共同參與到膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。其內(nèi)在聯(lián)系或?yàn)榘螂装┘?xì)胞介導(dǎo)，進(jìn)一步說(shuō)明其與膀胱癌細(xì)胞的增殖、分化、分期有關(guān)。但本研究中選病例數(shù)較少，有著一定的局限性，且本研究中未對(duì)其機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，期待未來(lái)完善相關(guān)研究。

綜上所述，LAMB3、SPOCK1、PRR11在膀胱癌組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)，且與腫瘤大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度密切相關(guān)，呈現(xiàn)出正相關(guān)的存在，LAMB3、SPOCK1、PRR11可能共同參與了膀胱癌的發(fā)展演進(jìn)。