李天煜，龐彩蓮，徐瑞梅，林悠閱，呂昕琪，范志豪，鐘展華，何俊力，袁朝漢，魏馳譽(yù)，黃舒琪，謝烷頤，廖日煜

廣東醫(yī)科大學(xué) 1外科學(xué)教研室，3公共衛(wèi)生學(xué)院，4研究生學(xué)院（廣東東莞523808）；2東莞市大朗醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣東東莞523770）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是發(fā)生于結(jié)直腸上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率居惡性腫瘤中的第3位，同時(shí)也是癌癥致死的第二大原因［1］。到2030年，預(yù)計(jì)CRC的全球疾病負(fù)擔(dān)將增加60%，新增病例將超過220萬，死亡人數(shù)將超過110萬［2］。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多要素的病理變化過程，且涉及多個(gè)基因的改變。遺傳因素在CRC發(fā)病中起重要的作用［3］。然而，CRC的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，有待進(jìn)一步研究。MicroRNAs（miRNAs）是一種參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的調(diào)節(jié)性非編碼RNA，它通過與蛋白質(zhì)編碼mRNAs的3′端非編碼區(qū)（3′－UTR）結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA分子的翻譯抑制，在基因編碼轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用。單個(gè)miRNA可調(diào)控多個(gè)靶mRNAs，miRNA可調(diào)控約60%的人類基因［4］。目前研究顯示miR－218 rs11134527、miR－25 rs41274221、miR－143 rs4705342、miR－106a rs137881717的基因多態(tài)性與不同類型癌癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［5］。而microRNA－218 rs11134527的GG基因型與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展存在密切相關(guān)性，尤其與消化道腫瘤有潛在關(guān)聯(lián)。我們初步篩選實(shí)驗(yàn)表明microRNA－218 rs11134527可能與CRC有潛在關(guān)系，并影響CRC的發(fā)生、發(fā)展。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－連接酶檢測(cè)反應(yīng)技術(shù)（LDR－PCR）檢測(cè)上述基因在CRC患者血清中的表達(dá)水平，并采用二元邏輯回歸分析對(duì)miR－218 rs11134527等4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與CRC易感性的關(guān)聯(lián)程度進(jìn)行評(píng)估，旨在探討其多態(tài)位點(diǎn)在CRC診斷中的臨床價(jià)值，為CRC的篩查、診斷、治療及預(yù)后提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、江門市中心醫(yī)院、東莞市人民醫(yī)院和東莞市大朗醫(yī)院2017年8月至2019年7月確診為CRC并未作任何治療的66例患者（CRC組）。此外，選擇124例來自同期4個(gè)醫(yī)院且體檢結(jié)果均為正常的健康個(gè)體作為對(duì)照組。所有CRC患者和正常健康個(gè)體均為無血緣關(guān)系的人群。所有CRC患者均經(jīng)過組織病理學(xué)證實(shí)。本研究收集CRC患者標(biāo)本時(shí)，采集患者靜脈血標(biāo)本2 mL，經(jīng)EDTA－K2抗凝，－20℃保存，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)嚴(yán)格審查批準(zhǔn)，獲得相關(guān)4個(gè)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)進(jìn)行人體組織細(xì)胞采集、檢查與實(shí)驗(yàn)，并與患者簽署知情同意書。

1.2 基因組DNA的提取、分型 在受試者知情同意后，提取每個(gè)樣本的外周靜脈血，加入抗凝劑后充分混勻。用TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒提取各樣品的基因組DNA，并將提取的DNA保存在－80℃冰箱中，直至下一步的基因分型。對(duì)66例結(jié)直腸癌患者和124例健康對(duì)照者的microRNA－218 rs11134527、microRNA－25 rs41274221、microRNA －143 rs4705342 和 microRNA －106a rs137881717多態(tài)位點(diǎn)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－連接酶檢測(cè)反應(yīng)技術(shù)（LDR－PCR）進(jìn)行分型。MicroRNA－218 rs11134527、microRNA－25 rs41274221、microRNA－143 rs4705342 和 microRNA－106a rs137881717四個(gè)單核苷酸多態(tài)性的基本信息在國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）提取，見表1。首先構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括50 ng基因組DNA樣品、1×PCR緩沖液、3 mmol／LMg2＋、2 mmol／L／每個(gè)dNTP、0.5 p引物混合物和1 U Taq DNA聚合酶。引物序列見表2。第二步是建立一個(gè)LDR反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系總體積為10μL，其中包含1μL LDR緩沖液、第一步的4μL PCR產(chǎn)物、每種探針混合物2 pmol和2 U Taq DNA連接酶。探針序列見表3。在基因分型過程中，隨機(jī)選擇15%的樣品進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，與先前測(cè)定結(jié)果一致率為100%。

表1 rs11134527、rs41274221、rs4705342、rs137881717的基本信息

表2 引物的信息

表3 探針的信息

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，使用SHEsis軟件（http：／／analysis.bio－x.cn／myAnalysis.php）對(duì)microRNAs進(jìn)行單倍體估算和分析。對(duì)照組采用χ2檢驗(yàn)4個(gè)microRNA多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布是否符合Hardy－Weinberg平衡原則。最后，通過二元邏輯回歸分析評(píng)估m(xù)icroRNA－218 rs11134527和其他4個(gè)單核苷酸多態(tài)性與CRC易感性的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MicroRNA－218 rs11134527及其他3個(gè)單核苷酸多態(tài)性的基本信息 與NCBI數(shù)據(jù)庫中國受試者的最小等位基因頻率（MAF）對(duì)比，本研究對(duì)照組中4個(gè)單核苷酸多態(tài)性的MAF極為相似。結(jié)果顯示，對(duì)照組中除了rs41274221外，Hardy－Weinberg平衡測(cè)試均正常（P＞0.05），見表4。因此，本研究樣本群體的基因型頻率分布大多遵循Hardy－Weinberg平衡原則。

2.2 MicroRNA－218 rs11134527及其他3個(gè)單核苷酸多態(tài)性與CRC易感性的關(guān)聯(lián)分析 基因型關(guān)聯(lián)分析中，CRC組和對(duì)照組僅有microRNA－218 rs11134527這一單核苷酸多態(tài)性有顯著差異。二元邏輯回歸分析顯示，與AG、AA基因型相比，microRNA－218 rs11134527中GG基因型與CRC易感性增加相關(guān)（OR＝2.31，95%CI：1.04～5.15，P＝0.04），表明攜帶有GG基因型個(gè)體的CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)比攜帶AG或AA基因型個(gè)體高出2.31倍。在等位基因和基因型分析中并未發(fā)現(xiàn)其余3個(gè)單核苷酸多態(tài)性與CRC易感性有任何關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。見表4。

表4 MicroRNA－218 rs11134527等4個(gè)單核苷酸多態(tài)性與CRC易感性的關(guān)聯(lián)分析 數(shù)量（%）

2.3 MicroRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342兩個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)形成的單體型與CRC易感性的關(guān)聯(lián)分析 通過進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析，MicroRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342均位于5號(hào)染色體上，這2個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)位于同一個(gè)單體型區(qū)。同時(shí)，單倍體連鎖不平衡測(cè)試提示microRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342之間存在連鎖關(guān)系。因此，本研究進(jìn)一步對(duì)比CRC組和對(duì)照組之間兩個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)形成的單體型頻率。納入本研究的2個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的4種常見單體型（頻率＞3%）幾乎占單體型變異的100%。單體型分析結(jié)果顯示，microRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342形成的4種常見的單體型均與CRC易感性不存在任何關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。見表5。

表5 MicroRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342兩個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)形成的單體型與CRC易感性的關(guān)聯(lián)分析數(shù)量（%）

3 討論

CRC是一種多步驟、多因素、多基因疾病，由多種環(huán)境、生活方式和個(gè)體的遺傳易感因素共同作用的結(jié)果，其中個(gè)體遺傳易感性是CRC發(fā)生、發(fā)展的主要?jiǎng)右?。miRNAs在腫瘤發(fā)展過程中特異度較高，穩(wěn)定性好，因此microRNA對(duì)癌癥生物學(xué)具有重要意義，已有研究證實(shí)miRNAs可以作為乳腺癌、肺癌、腎癌等［6－8］腫瘤的生物標(biāo)志物。越來越多的研究表明，microRNA表達(dá)失調(diào)在CRC的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著功能性的作用［9］。

MicroRNA－218 rs11134527已被有關(guān)研究證實(shí)與肺癌［10］、宮頸癌［11］、食管鱗狀細(xì)胞癌［12］等多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切關(guān)聯(lián)。然而，這些研究均提供了不同的結(jié)果。2018年Danesh等［13］報(bào)道m(xù)icroRNA－218 rs11134527單核苷酸多態(tài)性增加了患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。此外，Chuanyin等［11］發(fā)現(xiàn)，microRNA－218 rs11134527的GG基因型在宮頸上皮內(nèi)瘤樣變組和對(duì)照組中比AA和AG基因型具有更高的宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了基因型關(guān)聯(lián)分析研究，結(jié)果表明microRNA－218 rs11134527與CRC的易感性增加有關(guān)（OR＝2.31，95%CI：1.04～5.15），CRC組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而microRNA－25 rs41274221、microRNA－143 rs4705342和microRNA－106a rs137881717與CRC易感性卻無關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。再進(jìn)一步分析位于5號(hào)染色體同一個(gè)單體型塊上2個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)microRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342，結(jié)果示2個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)形成的單體型與CRC易感性不存在關(guān)聯(lián)。

目前，已有研究發(fā)現(xiàn)microRNA－218 rs11134527的AG ＋GG基因型與非小細(xì)胞肺癌的易感性降低有關(guān)［10］；而本研究表明，與AG和AA基因型相比，攜帶有GG基因型個(gè)體的CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)比攜帶AG或AA基因型個(gè)體高出2.31倍。He等［14］報(bào)道m(xù)icroRNA－218 rs11134527的A＞G單核苷酸多態(tài)性可降低個(gè)體罹患神經(jīng)母細(xì)胞瘤的風(fēng)險(xiǎn)，這提示G等位基因可能是多種疾病發(fā)展的保護(hù)因子，但其在CRC中的作用有待進(jìn)一步研究。

近年來有許多microRNA被報(bào)道可用于癌癥的化學(xué)治療，對(duì)降低腫瘤細(xì)胞的抵抗性有一定的作用。Nangia－Makker等［15］發(fā)現(xiàn)上調(diào)microRNA－145的表達(dá)和阻斷Wnt／β－catenin的信號(hào)可抑制CRC耐藥干細(xì)胞的增殖和克隆。目前CRC的主要化療方案是奧沙利鉑／氟尿嘧啶方案，血清中microRNA－92a－3p的高表達(dá)也與CRC的轉(zhuǎn)移和化療耐藥性高度相關(guān)［16］。microRNA－218可通過靶向Rictor增加宮頸癌患者對(duì)化療藥物雷帕霉素的敏感性［17］。通過靶向Glut1，microRNA－218也增加了膀胱癌對(duì)化療藥物順鉑的敏感性［18］。miR－218可通過下調(diào)TS的表達(dá)，與5－氟尿嘧啶共同抑制CRC細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展，microRNA－218還可通過靶向BIRC5增強(qiáng)5－氟尿嘧啶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)藥物療效［19］。除BIRC5外，胸苷酸合酶（TS）也被發(fā)現(xiàn)與5－氟尿嘧啶的耐藥有關(guān)。奧沙利鉑作為化療的基礎(chǔ)藥物之一，其臨床發(fā)展也受到CRC細(xì)胞耐藥性的限制。Fu等［20］發(fā)現(xiàn)miR－218的高表達(dá)可以抑制CRC細(xì)胞的自噬，顯著提高腫瘤對(duì)奧沙利鉑的敏感性。此外，一些研究證實(shí)miR－218聯(lián)合MALAT1（一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA）應(yīng)用可以抑制上皮細(xì)胞－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，從而影響癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性［21］。以上結(jié)果表明，microRNA－218有望成為降低CRC細(xì)胞耐藥性的關(guān)鍵靶點(diǎn)，但需要進(jìn)一步的研究來證明。

綜上所述，本研究通過分析microRNA－218 rs11134527證明了microRNA－218 rs11134527與CRC易感性之間的關(guān)聯(lián)。然而，microRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)形成的單倍型與CRC的易感性無關(guān)。本研究的結(jié)果拓展了CRC易感基因的數(shù)據(jù)庫，并為未來的研究人員提供了研究方向。此外，microRNA－218 rs11134527有望成為未來CRC發(fā)生、發(fā)展的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)，為CRC的早期診斷和治療奠定堅(jiān)實(shí)的分子基礎(chǔ)。

（志謝：感謝廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、東莞市人民醫(yī)院、東莞市大朗醫(yī)院、江門市中心醫(yī)院胃腸外科的醫(yī)護(hù)人員，在實(shí)驗(yàn)中尤其是標(biāo)本收集提供便利。）