★羅暢 孫有智 趙益 趙利南（.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 南昌 000；2.臺州市黃巖區(qū)中醫(yī)院 浙江 臺州 8020；.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心/江西省中醫(yī)病因生物學(xué)重點實驗室 南昌 000；.濮陽市中醫(yī)醫(yī)院 河南 濮陽 5700）

乳腺癌是我國女性最常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率逐年攀升［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對乳腺癌的發(fā)病機制尚不明確，認為與激素、遺傳、不良生活方式和其他疾病有關(guān)［2］。中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說中的體病相關(guān)理論認為，不同體質(zhì)人群具有對特定病因和疾病的易感性，以及疾病傳變轉(zhuǎn)歸中的某種傾向性。王琦院士提出體病相關(guān)在發(fā)病學(xué)中十分重要［3］。體病相關(guān)的文獻計量研究指出，氣郁質(zhì)人群發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險更高，且氣郁質(zhì)在乳腺癌人群中分布比例較高［4］，由此推測氣郁質(zhì)對乳腺癌的發(fā)生有一定的促進作用。本實驗通過DMBA灌胃誘發(fā)大鼠乳腺癌模型，觀察激怒應(yīng)激誘導(dǎo)下氣郁狀態(tài)大鼠的一般狀況、曠場實驗評分、血漿雌二醇、皮質(zhì)酮含量、乳腺癌潛伏期及誘發(fā)率的變化，探討氣郁狀態(tài)對乳腺癌發(fā)病的影響，為乳腺癌的中醫(yī)實驗研究及臨床防治提供思路。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SPF級未交配雌性SD大鼠136只，體重（102±8）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（許可證號：SCXK〈湘〉2013-0004）。

1.2 試劑與儀器DMBA（7,12-dimethylbenz(a)anthra- cesne，7，12-二甲基苯蒽）（美國Sigma-Aldrich，批號：SLBM4575V）；雌二醇Elisa試劑盒（武漢優(yōu)爾生，批號：L151102019）；皮質(zhì)酮Elisa試劑盒（武漢優(yōu)爾生，批號：L151103101）；戊巴比妥鈉（南昌平海，批號：922L031）；蘇木素、伊紅染液（南昌雨露，批號：160601、160701）；小動物行為記錄視頻分析系統(tǒng)（西班牙Panlab）；恒溫培養(yǎng)搖床（常州萬華）；酶標(biāo)儀（美國MD）；脫水機、包埋機、切片機（德國徠卡）；光學(xué)顯微鏡（日本尼康）。

2 實驗方法

2.1 分組所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，分組前行曠場實驗，保留總評分在20~120分之間的大鼠［5］。具體方法：使用小動物行為記錄視頻分析系統(tǒng)，將100 cm×100 cm×40 cm黑色曠場敞箱等分為25個區(qū)域，記錄在安靜環(huán)境下3 min內(nèi)每只大鼠在箱中的直立及穿格次數(shù)；將大鼠放在箱中心區(qū)域，雙前肢向上抬舉且兩爪離地1 cm以上為1次直立，三爪以上跨入相鄰區(qū)域為1次穿格；總評分=直立次數(shù)+穿格次數(shù)；每只大鼠測試結(jié)束后擦拭曠場內(nèi)排泄物。剔除總評分不合格大鼠3只，剩余133只大鼠隨機分為6組：空白組、DMBA模型組、8周激怒組、8周激怒+DMBA組、22周激怒組、22周激怒+DMBA組。

2.2 大鼠氣郁狀態(tài)實驗開始后，對8周激怒組、8周激怒+DMBA組大鼠行連續(xù)8周的激怒應(yīng)激后停止應(yīng)激，對22周激怒組、22周激怒+DMBA組大鼠行連續(xù)22周的激怒應(yīng)激直至實驗結(jié)束，以造成大鼠的氣郁狀態(tài)。激怒應(yīng)激方式：（1）棉繩束縛大鼠雙后肢，2~3只倒吊于網(wǎng)籠蓋；（2）在大鼠尾巴靠近身體約2/3處夾一個長尾夾。應(yīng)激在安靜環(huán)境下進行，每次30 min，兩種應(yīng)激方式隔天交替。兩種方式均能造成同籠大鼠對峙扭打尖叫，若大鼠間出現(xiàn)撕咬行為則立刻調(diào)整棉繩或長尾夾位置。

2.3 建立大鼠乳腺癌模型分別于第9周首日和第10周首日對DMBA模型組、8周激怒+DMBA組、22周激怒+DMBA組大鼠行DMBA灌胃誘發(fā)乳腺癌模型（DMBA粉末以10 mg/mL濃度溶于芝麻油中，溶液10 mL/kg灌胃）。

2.4 指標(biāo)監(jiān)測

2.4.1 一般狀況自實驗開始，每天觀察各組大鼠的活躍程度、情緒反應(yīng)、毛色光澤度、大便等。

2.4.2 曠場實驗自實驗開始，每隔2周對各組大鼠行曠場實驗。

2.4.3 血漿雌二醇、皮質(zhì)酮含量測定對各組大鼠于第8周末行眼眶取血、第22周末行腹主動脈取血，分離血漿后使用Elisa法測定雌二醇、皮質(zhì)酮含量。

2.4.4 乳腺腫瘤潛伏期第14周開始，采用手摸的方式每天檢查DMBA模型組、8周激怒+DMBA組、22周激怒+DMBA組大鼠所有乳腺部位的腫瘤出現(xiàn)情況，以第9周首日至各大鼠出現(xiàn)第1個可觸及體表乳腺部位腫塊的時間為該大鼠乳腺腫瘤誘發(fā)的潛伏期。

2.4.5 乳腺腫瘤誘發(fā)率實驗結(jié)束時DMBA模型組、8周激怒+DMBA組、22周激怒+DMBA組各組大鼠成功誘發(fā)乳腺腫瘤的數(shù)量與該組總數(shù)的百分比為該組乳腺腫瘤的誘發(fā)率。

2.4.6 乳腺癌模型評價實驗結(jié)束時對DMBA模型組、8周激怒+DMBA組、22周激怒+DMBA組各組大鼠行腹腔注射麻醉（戊巴比妥鈉粉末以50 mg/mL濃度溶于雙蒸水中，溶液50 mg/kg腹腔注射），麻醉成功后剝離所有乳腺部位的腫瘤組織，常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋，3 μm切片后行HE染色，顯微鏡下觀察病理學(xué)形態(tài)。大鼠乳腺腫瘤組織病理學(xué)判讀由江西省腫瘤醫(yī)院病理科協(xié)助完成。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析使用SPSS 23.0軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，多組間比較使用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間率的比較使用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀態(tài)觀察8周激怒組、8周激怒+DMBA組、22周激怒組、22周激怒+DMBA組大鼠在激怒應(yīng)激中表現(xiàn)出尖叫、跳躥掙扎、豎立對峙、扭打撕咬等激動行為。在安靜狀態(tài)下，激怒應(yīng)激后的大鼠活動減少、喜扎堆蜷縮于飼養(yǎng)箱角落、易受驚嚇、便溏、墊料易濕。8周激怒組、8周激怒+DMBA組大鼠在停止激怒應(yīng)激后的上述表現(xiàn)逐漸與空白組大鼠趨于一致，而22周激怒組、22周激怒+DMBA組大鼠仍維持上述表現(xiàn)直至實驗結(jié)束。

3.2 各組大鼠曠場實驗總評分比較實驗第4周及第8周，8周激怒組、8周激怒+DMBA組、22周激怒組、22周激怒+DMBA組大鼠曠場實驗總評分均減低（P<0.05或P<0.01）；第12周、第16周 及 第20周，22周 激 怒 組、22周 激 怒+DMBA組大鼠曠場實驗總評分均減低（P<0.05或P<0.01）。見表1。

表1 各組大鼠曠場實驗總評分（±s） 分

表1 各組大鼠曠場實驗總評分（±s） 分

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與DMBA模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別 第1周 第4周 第8周 第12周 第16周 第20周空白組 67.6±24.2 74.3±28.2 69.8±27.1 70.8±17.4 82.3±18.5 71.3±25.8 DMBA模型組 69.3±24.3 72.0±30.0 71.8±31.7 74.9±36.3 64.1±35.1 61.7±31.2 8周激怒組 70.7±24.2 48.5±34.8# 37.9±21.9## 87.2±38.3 84.0±33.0 87.0±23.4 8周激怒+DMBA組 71.4±26.0 29.7±25.5** 33.6±24.8** 59.0±22.1 63.4±33.6 56.1±29.1 22周激怒組 64.5±27.7 39.2±29.1## 36.4±27.7## 45.2±25.3# 42.0±26.1## 38.5±27.6##22周激怒+DMBA組 68.8±24.5 32.7±31.8** 26.4±23.0** 41.0±33.8** 43.9±28.8* 38.9±30.2**

3.3 各組大鼠血漿雌二醇、皮質(zhì)酮含量比較實驗第8周，激怒應(yīng)激后的大鼠血漿雌二醇含量降低（P<0.05），皮質(zhì)酮含量升高（P<0.05或P<0.01）。第22周，22周激怒組、22周激怒+DMBA組大鼠血漿雌二醇含量仍降低（P<0.05），皮質(zhì)酮含量升高（P<0.05）；但8周激怒組及8周激怒+DMBA組大鼠的雌二醇及皮質(zhì)酮水平與空白組或DMBA模型組無明顯區(qū)別（P>0.05）。見表2。

表2 激怒應(yīng)激對大鼠血漿雌二醇和皮質(zhì)酮表達的影響（ ±s） %

表2 激怒應(yīng)激對大鼠血漿雌二醇和皮質(zhì)酮表達的影響（ ±s） %

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與DMBA模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別 雌二醇 皮質(zhì)酮8周 22周 8周 22周空白組 8.13±4.41 7.74±1.78 389.52±47.69 402.84±73.95 DMBA模型組 7.89±2.54 7.96±2.35 382.86±87.01 383.82±62.74 8周激怒組 6.25±2.86 7.46±1.42 482.09±62.31##** 400.74±67.65 8周激怒+DMBA組 5.41±2.69#* 7.50±2.40 456.47±88.29#** 407.41±56.40 22周激怒組 6.59±3.44 5.93±1.76* 455.40±83.80* 445.43±57.42*22周激怒+DMBA組 5.14±2.91#* 6.05±1.99* 451.67±66.75#* 436.33±46.61*

3.4 大鼠乳腺腫瘤潛伏期本次實驗中大鼠乳腺腫瘤潛伏期最短46 d，實驗結(jié)束時仍有16只大鼠未誘發(fā)乳腺腫瘤。DMBA模型組12只、8周激怒+DMBA組15只、22周激怒+DMBA組16只大鼠成功誘發(fā)乳腺腫瘤。22周激怒+DMBA組大鼠乳腺腫瘤潛伏期較DMBA模型組及8周激怒+DMBA組有縮短趨勢（P>0.05）。見表3。

表3 氣郁狀態(tài)對大鼠腫瘤潛伏期的影響（ ±s）

表3 氣郁狀態(tài)對大鼠腫瘤潛伏期的影響（ ±s）

組別 n 潛伏期/d DMBA模型組 12 65.3±12.8 8周激怒+DMBA組 15 66.4±13.3 22周激怒+DMBA組 16 61.5±14.4

3.5 大鼠乳腺腫瘤誘發(fā)率本次實驗中大鼠乳腺腫瘤總誘發(fā)率為51.19 %，DMBA模型組42.86 %，8周激怒+DMBA組53.57 %，22周激怒+DMBA組57.14 %。隨氣郁狀態(tài)的持續(xù)時間增加，誘發(fā)率呈增加趨勢（P>0.05）。見表4。

表4 氣郁狀態(tài)對大鼠乳腺腫瘤誘發(fā)率的影響

3.6 大鼠乳腺癌模型評價實驗結(jié)束時，成功誘發(fā)乳腺腫瘤且仍存活的大鼠共31只，其中DMBA模型組9只、8周激怒+DMBA組13只、22周激怒+DMBA組9只。通過組織病理學(xué)判讀，本實驗中大鼠乳腺腫瘤均為乳腺癌，病理分型分別為浸潤性導(dǎo)管癌（48.4 %）、浸潤性篩狀癌（38.7 %）、乳頭狀癌（6.5 %）、分泌型癌（3.2 %）、髓樣癌（3.2 %）。見表5。

表5 大鼠乳腺腫瘤組織病理形態(tài) n（%）

4 討論

通過動物實驗闡釋中醫(yī)理論及治法療效是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重要內(nèi)容。多年來，病證結(jié)合的動物模型在中醫(yī)藥科研工作中廣泛應(yīng)用，將現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理和中醫(yī)病因造模相結(jié)合，既包涵現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的疾病病理改變，又具備中醫(yī)的證候特點［6］。同時，病證結(jié)合模式也廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥臨床工作中，在診斷、治療、療效評價、臨床研究等方面均發(fā)揮重要作用［7］。但仍有學(xué)者認為，目前病證結(jié)合的動物模型不能較好體現(xiàn)疾病的動態(tài)演變和個體差異，需引入中醫(yī)體質(zhì)維度進行造模，因為體質(zhì)是證候表現(xiàn)的內(nèi)在基礎(chǔ)，通過研究發(fā)病前偏頗體質(zhì)對疾病發(fā)生的影響能為治未病提供思路，故中醫(yī)藥科研中的動物模型也應(yīng)具備體質(zhì)因素［8］。

氣郁質(zhì)是由于長期情志不暢、氣機郁滯而形成，精神刺激、暴受驚恐、所欲不遂、憂郁思慮等因素是后天形成氣郁質(zhì)的主要原因［9］?！鹅`樞》曰：“憂恐忿怒傷氣，氣傷臟，乃病臟”“愁憂者，氣閉塞而不行”，《張氏醫(yī)通》曰：“郁證多緣于志慮不伸，而氣先受病”，可見氣郁質(zhì)易因過極情志所致。過去的動物實驗中多注重乳腺癌的證型研究，而對于體質(zhì)狀態(tài)對乳腺癌的影響少有報導(dǎo)。本實驗在大鼠誘發(fā)乳腺癌模型之前采用激怒應(yīng)激方式造成大鼠氣郁狀態(tài)，以模擬氣郁質(zhì)人群在乳腺癌發(fā)病前的體質(zhì)，符合“體-病-證結(jié)合”的研究方式。所應(yīng)用的雙后肢倒吊激怒法和夾尾激怒法均是中醫(yī)動物模型中常用的激怒應(yīng)激法［10］，對大鼠進行強烈的情志刺激，使肝氣失于條暢、氣機失常而產(chǎn)生氣郁，達到“怒傷肝，久則郁”的目的，且情志刺激也避免了藥物造模引起的急性損傷和中毒。激怒應(yīng)激后的大鼠曠場實驗總評分減低，血漿中雌二醇含量降低、皮質(zhì)酮含量升高。曠場實驗反映大鼠的探究行為，通過記錄大鼠進入陌生環(huán)境后在一定時間內(nèi)的自發(fā)活動，在肝郁、抑郁等評價動物情緒變化的模型中廣泛應(yīng)用［11］。相關(guān)動物實驗中，肝郁、氣郁模型大鼠血中雌二醇水平降低［12］，皮質(zhì)酮水平升高［13］；且臨床實驗研究中，煩躁、抑郁情緒人群血中雌二醇水平降低、皮質(zhì)醇水平升高［14-15］。同時，本實驗中激怒后的大鼠在安靜狀態(tài)下活動減少、喜扎堆蜷縮于飼養(yǎng)箱角落、易受驚嚇，與氣郁質(zhì)人群性格內(nèi)向不穩(wěn)定、敏感、對精神刺激適應(yīng)能力較差相類似［9］。

本實驗中DMBA誘發(fā)的大鼠乳腺腫瘤經(jīng)判讀均為乳腺癌，但部分大鼠在誘導(dǎo)過程中死亡，且部分大鼠未能成功誘導(dǎo)乳腺腫瘤，因DMBA是多環(huán)芳烴類的強力致癌劑，且有一定的誘發(fā)成功率［16］。從誘發(fā)乳腺癌的潛伏期和誘發(fā)率來看，氣郁狀態(tài)大鼠的潛伏期有縮短的趨勢，誘發(fā)率較模型組稍高，但均無統(tǒng)計學(xué)意義，這無論是與傳統(tǒng)中醫(yī)理論的認識，還是與截至目前國內(nèi)大部分中醫(yī)體質(zhì)臨床調(diào)查的結(jié)果并不一致。然而，近年來國外一些大樣本研究并不支持情志因素與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險存在相關(guān)性。一項納入了14.7萬多名絕經(jīng)期女性、評估了800多個潛在危險因素、隨訪8年的調(diào)查研究顯示，心理因素對乳腺癌的發(fā)病可能相對并不重要［17］。另外一項納入了10.6萬名女性的研究結(jié)果也并未顯示出乳腺癌風(fēng)險與過去5年內(nèi)感知到的壓力水平和負性生活事件相關(guān)聯(lián)［18］。本實驗結(jié)果與此一致，這就說明氣郁狀態(tài)可能并不一定促進乳腺癌的發(fā)生。本實驗對大鼠血漿雌二醇、皮質(zhì)酮進行檢測，此兩種物質(zhì)為腺垂體分泌的促激素所產(chǎn)生的雌激素及腎上腺糖皮質(zhì)激素，高水平雌激素能通過促進乳腺上皮細胞增殖及刺激雌激素受體引起乳腺癌的發(fā)生［19］，高水平糖皮質(zhì)激素能通過抑制免疫降低機體對腫瘤的免疫監(jiān)視及免疫應(yīng)答［20］，表明雌二醇、皮質(zhì)酮能在乳腺癌發(fā)生中呈促進作用。但氣郁狀態(tài)下，大鼠血漿皮質(zhì)酮雖升高、雌二醇卻降低，其原因可能與下丘腦-腺垂體-性軸/腎上腺皮質(zhì)軸及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)的功能紊亂有關(guān)［21］。在后期實驗中，本實驗組對乳腺癌組織進行基因測序后發(fā)現(xiàn)，氣郁狀態(tài)的大鼠癌組織中很多與免疫相關(guān)的基因表達均有所升高，這可能會阻止腫瘤的發(fā)生。因此我們推測，氣郁狀態(tài)對機體的影響是復(fù)雜的，可能既會促發(fā)利于腫瘤生長的某些因素，也會激發(fā)免疫系統(tǒng)阻止其發(fā)病，最終是否發(fā)病可能取決于二者相互作用的結(jié)果，其中機理有待于進一步的深入研究。