陶 潔，曹 陽，左其亭

(1.鄭州大學(xué)水利科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.鄭州市水資源與水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗室,河南 鄭州 450001；3.河南省地下水污染防治與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗室，河南 鄭州 450001;4.鄭州大學(xué)黃河生態(tài)保護(hù)與區(qū)域協(xié)調(diào)發(fā)展研究院，河南 鄭州 450001)

水利水電工程建設(shè)運(yùn)行、污染物超標(biāo)排放、水生生物過度捕撈等一系列人類活動[1]，改變了原有河流生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)平衡和水生棲息環(huán)境，導(dǎo)致河流生物多樣性減少，影響了河流生態(tài)系統(tǒng)的健康。河流生物多樣性是反應(yīng)河流健康的重要指標(biāo)[2]，其傳統(tǒng)檢測方法，如網(wǎng)捕、電釣等都是通過在調(diào)查點(diǎn)捕獲樣本或者制作成標(biāo)本再進(jìn)行鑒定，不但費(fèi)時費(fèi)力，對檢測物種也不友好。

基于這種情況，環(huán)境DNA(environmental DNA， eDNA)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，被認(rèn)為能夠有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)技術(shù)的缺陷。eDNA是從生物體(包括皮膚、黏液、鱗屑、尿液、糞便、唾液、配子或遺體等)脫落的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的，并懸浮在環(huán)境基質(zhì)(如水、土壤或空氣)中的DNA[3-7]。eDNA的產(chǎn)生依賴于生物體的生物量、年齡、攝食活動以及生理、生活史和空間使用[4]，而eDNA技術(shù)可以從環(huán)境基質(zhì)中捕獲產(chǎn)生的DNA，并將其進(jìn)行保存、提取、擴(kuò)增和測序[8]，進(jìn)而根據(jù)測序結(jié)果，判斷物種種屬。這種新型的檢測方法已被證明在生物檢測中的巨大潛力，經(jīng)過10多年的發(fā)展，它在檢測入侵物種、瀕?；蚴艿酵{的本土物種以及其他難以用傳統(tǒng)方法檢測的低密度的物種等方面都有可靠的應(yīng)用，也被廣泛應(yīng)用在物種分布和豐度的估測等多個領(lǐng)域[9-10]。

由于其高效性、準(zhǔn)確性和低成本性，eDNA技術(shù)在獲取河流的物種信息和解決河流生態(tài)相關(guān)問題等方面起到了巨大的作用。本文通過查詢河流生態(tài)系統(tǒng)領(lǐng)域與eDNA技術(shù)相關(guān)的文獻(xiàn)，采用文獻(xiàn)計量分析方法對發(fā)文狀況、主要研究領(lǐng)域、未來研究熱點(diǎn)等進(jìn)行統(tǒng)計分析，綜合闡述了eDNA技術(shù)在河流生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用研究現(xiàn)狀，并提出未來重點(diǎn)研究方向。

1 檢索方法與結(jié)果

1.1 檢索方法與數(shù)據(jù)來源

CiteSpace文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可視化軟件是一款文獻(xiàn)計量分析軟件，可以對檢索到的論文中的作者、關(guān)鍵詞、標(biāo)題、摘要和被引文獻(xiàn)等進(jìn)行分析，能有效地尋找到研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和發(fā)展前沿[11]。本文采用該軟件對關(guān)鍵詞的聚類圖、頻次以及突現(xiàn)狀況進(jìn)行分析。

研究數(shù)據(jù)來自中國知網(wǎng)(CNKI)和科睿唯安信息服務(wù)公司下屬的SCI-Expanded數(shù)據(jù)庫。自1991年起，SCI出版物都增加了摘要，因此在主題搜索中，可以同時從標(biāo)題、摘要和關(guān)鍵詞中收集相關(guān)信息并通過分析標(biāo)題、摘要和關(guān)鍵詞可以得到合理詳細(xì)的主題重點(diǎn)。在數(shù)據(jù)收集的過程中，為了確保原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和全面性，需要進(jìn)行檢索方法的優(yōu)化和檢索策略的調(diào)整，并排除無關(guān)的文獻(xiàn)。在知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中以“環(huán)境DNA”“eDNA”為主題進(jìn)行高級檢索，主題詞之間以“或”相連，檢索完后，選擇“中文文獻(xiàn)”來限定范圍；在SCI-Expanded數(shù)據(jù)庫中以“environmental DNA”“eDNA”為主題進(jìn)行檢索，主題詞之間以“or”相連；由于eDNA技術(shù)是Ficetola等[3]于2008年首次應(yīng)用到水生生物檢測中的，故將中外數(shù)據(jù)庫的檢索時間跨度均設(shè)為“2008—2019年”。

1.2 結(jié)果分析

1.2.1論文發(fā)表數(shù)量和趨勢

對獲取文獻(xiàn)進(jìn)行整理和精準(zhǔn)匹配，同時從標(biāo)題、摘要和關(guān)鍵詞中搜集信息，去除與河流生態(tài)系統(tǒng)無關(guān)文獻(xiàn)，知網(wǎng)檢索到的國外作者發(fā)文歸到國外，SCI-Expanded數(shù)據(jù)庫中檢索到的國內(nèi)作者發(fā)文歸到國內(nèi)，最終檢索得到46篇國內(nèi)作者發(fā)表的文獻(xiàn)和758篇國外作者發(fā)表的文獻(xiàn)。對國內(nèi)外發(fā)文量進(jìn)行年度統(tǒng)計(圖1)，國外eDNA發(fā)文數(shù)量在2008—2013年呈平穩(wěn)趨勢，2014年之后逐年穩(wěn)步提升；國內(nèi)eDNA的發(fā)文量的趨勢和國外相同，雖然發(fā)文量很低，但近幾年來呈明顯上升趨勢。2013年之后該領(lǐng)域受到了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注，在一定程度上與其檢測監(jiān)測的優(yōu)越性有關(guān)。

圖1 eDNA的發(fā)文量

1.2.2關(guān)鍵詞頻次分析

圖2為CiteSpace關(guān)鍵詞共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖，關(guān)鍵詞出現(xiàn)次數(shù)越多則字體越大。除了“環(huán)境DNA”和“environmental DNA”“eDNA”這些關(guān)鍵詞的不同之外，國內(nèi)eDNA技術(shù)研究過程中出現(xiàn)頻次較高的關(guān)鍵詞有：生物多樣性(或物種多樣性)、水生生物、生物監(jiān)測(或物種監(jiān)測)、水生態(tài)系統(tǒng)、coi(指的是線粒體DNA上的一段蛋白質(zhì)編碼基因，主要被生物科學(xué)領(lǐng)域用作系統(tǒng)發(fā)育研究或DNA條形碼研究)等；國外的有：diversity(多樣性)、conservation(保護(hù))、temperature(溫度)、abundance(豐度)、metabarcoding(宏條形碼)等。

(a) 國內(nèi)發(fā)文

(b) 國外發(fā)文

網(wǎng)絡(luò)共現(xiàn)圖中存在一些節(jié)點(diǎn)，代表被分析的對象，其中頻次越高則節(jié)點(diǎn)就越大，節(jié)點(diǎn)之間的連線表示共現(xiàn)關(guān)系，連線越粗表示共現(xiàn)關(guān)系越強(qiáng)。國內(nèi)(圖2(a))由于在此方面研究的文獻(xiàn)較少，所以節(jié)點(diǎn)的大小不夠明顯，但從國內(nèi)外發(fā)文關(guān)鍵詞頻次(表1和表2)可知，國內(nèi)外在研究方向上基本相同，主要集中在生物多樣性和物種入侵方面，但是與國內(nèi)相比，國外的研究呈現(xiàn)更加多元化的趨勢，不僅僅局限于eDNA在生物本身的應(yīng)用，還關(guān)注其影響因素、提取方法和PCR技術(shù)(又名聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種用于放大擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù))等，具體包括：光照、時間和溫度等對eDNA濃度的影響機(jī)理研究，為防止樣品污染而改進(jìn)提取方法的研究，能帶來測序速度和準(zhǔn)確率提高的PCR技術(shù)更新研究。

表1 國內(nèi)發(fā)文前15個關(guān)鍵詞出現(xiàn)頻次

1.2.3關(guān)鍵詞突現(xiàn)分析

通過對關(guān)鍵詞的突現(xiàn)性分析，可以了解不同時間階段eDNA技術(shù)的應(yīng)用研究情況。表3和表4顯示了關(guān)鍵詞突變的出現(xiàn)時間以及持續(xù)時間。2014—2015年是國內(nèi)關(guān)于eDNA技術(shù)研究的開始階段，主要聚焦在河流生態(tài)方面，隨著研究的深入逐漸過渡到微觀領(lǐng)域?qū)DNA的測序技術(shù)方面，這對水生生物和物種監(jiān)測研究成為2018—2019年的研究熱點(diǎn)起到了一定的推動作用。相比國內(nèi)，國外eDNA技術(shù)的研究要早許多，也不局限于物種監(jiān)測方面，并且逐漸從eDNA技術(shù)本身過渡到對河流環(huán)境中DNA的運(yùn)輸、產(chǎn)生和降解及其敏感性的研究。只有深入了解外在因素對eDNA的影響機(jī)理，才能通過eDNA技術(shù)得到更加精確的檢測結(jié)果。

表2 國外發(fā)文前15個關(guān)鍵詞出現(xiàn)頻次

表3 2008—2019年國內(nèi)引文爆發(fā)最強(qiáng)的7個關(guān)鍵詞突現(xiàn)點(diǎn)

表4 2008—2019年國外引文爆發(fā)最強(qiáng)的15個關(guān)鍵詞突現(xiàn)點(diǎn)

2 研究進(jìn)展

2.1 eDNA研究技術(shù)手段

eDNA在河流生態(tài)系統(tǒng)研究中最常用的兩種技術(shù)是條形碼(barcoding)和宏條形碼(metabarcoding)技術(shù)。條形碼和宏條形碼的主要區(qū)別在于：條形碼主要用特異性引物來對單個DNA片段進(jìn)行測序，主要針對單一物種[12-14]，檢測精度較高；宏條形碼則是使用通用引物同時檢測來自多個營養(yǎng)水平的各種物種的數(shù)百萬個DNA片段，主要針對復(fù)雜群落[15-16]。DNA條形碼對于探測入侵的、稀有的和低密度的物種尤其有用，即使是在研究者難以進(jìn)入的棲息地，也可以繪制它們的棲息地和物種分布圖并且設(shè)計相應(yīng)的保護(hù)策略。eDNA宏條形碼也已經(jīng)成功地用于描述過去和現(xiàn)在的生物多樣性模式以及研究珍稀瀕危物種的產(chǎn)卵生態(tài)[17-19]和監(jiān)測生態(tài)系統(tǒng)健康和動態(tài)[20-21]。

2.2 eDNA技術(shù)應(yīng)用研究的主要內(nèi)容

2.2.1物種檢測和監(jiān)測

自從在法國天然池塘水體中成功提取出了美國牛蛙(一種原產(chǎn)于北美的入侵兩棲物種)的eDNA[3]，eDNA技術(shù)便提高了研究者們對河流生態(tài)系統(tǒng)研究的興趣，并被廣泛應(yīng)用于入侵物種檢測、珍稀物種監(jiān)測等領(lǐng)域[22-23]，這些應(yīng)用研究證明了eDNA技術(shù)有著傳統(tǒng)調(diào)查方法所缺少的靈敏度、精度和效率。Valentini等[24]利用eDNA技術(shù)對骨魚和兩棲動物群體進(jìn)行檢測，得出的結(jié)果為該技術(shù)和傳統(tǒng)方法相比，檢出率相同或更高且效率更高。吳昀晟等[25]利用eDNA技術(shù)對長江流域的江豚進(jìn)行監(jiān)測；Shelton等[26]通過eDNA的濃度對美國華盛頓州斯卡吉特灣瀕危的大鱗大馬哈魚進(jìn)行物種監(jiān)測；Jo等[27]通過eDNA技術(shù)對日本兵庫縣東南部的3個外來魚類和3個瀕危的本土魚類進(jìn)行不同季節(jié)的分布檢測與監(jiān)測。以上應(yīng)用對入侵物種的早期發(fā)現(xiàn)、瀕危物種管理與監(jiān)測和瀕危物種等的有效保護(hù)提供了很大幫助。

eDNA技術(shù)解決了傳統(tǒng)技術(shù)在檢測和監(jiān)測入侵、未知和瀕危物種時費(fèi)時、費(fèi)力等問題，對物種分布的長期監(jiān)測、珍稀瀕危物種的保護(hù)和入侵物種的預(yù)防以及政府政策的制定都能起到很大的作用。

2.2.2物種生物量估測

準(zhǔn)確了解物種在河流環(huán)境中的生物量有助于維持河流生態(tài)系統(tǒng)的健康。研究表明，eDNA濃度與環(huán)境中的生物量正相關(guān)，因此，eDNA濃度可以在一定程度上反映物種的生物量[28-30]。Takahara等[31]利用eDNA技術(shù)來檢測實(shí)驗室和池塘試驗以及淡水湖泊實(shí)地調(diào)查的eDNA濃度，對比進(jìn)行鯉魚的生物量估測，得出eDNA濃度能反映目標(biāo)物種生物量，并可據(jù)此推測自然環(huán)境中的鯉魚分布情況。Dougherty等[32]利用傳統(tǒng)誘捕小龍蝦的方法和eDNA技術(shù)對美國中西部地區(qū)內(nèi)陸湖中入侵的銹斑小龍蝦(Orconectesrusticus)進(jìn)行了監(jiān)測及相對豐度估測，結(jié)果表明eDNA技術(shù)檢測物種的成功率隨該物種相對豐度的增加而增加。Doi等[33]在日本瀨戶內(nèi)海西部Suonada灣的Saba河進(jìn)行了eDNA試驗,得出eDNA濃度與香魚的生物量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

雖然能夠通過eDNA技術(shù)檢測eDNA濃度來快速評估物種的生物量，但是通過eDNA濃度對生物量的準(zhǔn)確估計仍然具有挑戰(zhàn)性，并取決于多種因素，如個體釋放到水中的DNA數(shù)量、河流的運(yùn)輸率和eDNA隨時間和溫度的穩(wěn)定性等[34]。此外，行為和季節(jié)也會影響物種的檢測和利用eDNA濃度對豐度的估測。因此，在應(yīng)用定量eDNA方法之前，需要對這些誤差進(jìn)行量化。

2.2.3生物產(chǎn)卵繁殖調(diào)查

掌握河流水生生物的繁殖活動對于物種多樣性的保護(hù)和管理非常重要。eDNA技術(shù)可以通過檢測水體中eDNA的濃度分布來確定生物產(chǎn)卵的空間范圍。Bylemans等[17]通過eDNA技術(shù)對瀕危的澳洲麥?zhǔn)削|進(jìn)行產(chǎn)卵活動監(jiān)測。Maruyama等[18]使用qPCR技術(shù)(實(shí)時熒光定量PCR技術(shù))對日本受威脅的本地三唇馬口魚的繁殖遷移進(jìn)行了非侵入性監(jiān)測。Antognazza等[19]以qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)，提出了鯡魚(Alosa)的eDNA檢測方法，并在英格蘭西部Teme河上進(jìn)行了檢測，確定了鯡魚產(chǎn)卵期的持續(xù)時間和空間分布范圍，并對鯡魚的空間分布進(jìn)行了評估。

更有研究者發(fā)現(xiàn)繁殖時期eDNA在水體中的濃度會顯著增加，并且只在一定的空間范圍內(nèi)顯著變化?；诖?，了解物種在何時何地發(fā)生繁殖行為，明確繁殖期與非繁殖期eDNA濃度與生物資源量的定量關(guān)系，可以更精確地了解其如何影響生物量的預(yù)測。

2.2.4生物多樣性檢測

在全球氣候變化和人類活動的影響下，生物多樣性正在快速地喪失，全球正經(jīng)歷第六次生物多樣性危機(jī)[35]。保護(hù)生物多樣性是一項全球性的挑戰(zhàn)，它需要大量不同時空尺度上的物種分布和數(shù)量數(shù)據(jù)。傳統(tǒng)方法調(diào)查生物多樣性往往存在效率低下、生物損傷、環(huán)境破壞等缺點(diǎn)，eDNA技術(shù)提供了一種新的方法來評估生物多樣性，只需要少量的水樣便能可靠地檢測出水環(huán)境中的目標(biāo)生物，包括入侵的、瀕危的和當(dāng)?shù)氐奈锓N[36-40]。Lacoursière-Roussel等[41]通過eDNA技術(shù)檢測北極兩個港口采集到的水樣，成功鑒定出了181個物種。Jo等[42]進(jìn)行的魚類多樣性調(diào)查顯示，eDNA技術(shù)檢測的平均種數(shù)為19(±4.4)種，略高于常規(guī)調(diào)查得到的10(±4.8)種，但在對韓國特有物種和外來物種的鑒定中顯示，通用引物(Mi-Fish引物集)并不適用，此外，一些常規(guī)方法捕獲的瀕危物種也沒有被eDNA技術(shù)檢測到，所以需要對通用引物進(jìn)行開發(fā)或補(bǔ)充，以便eDNA技術(shù)能識別更多的韓國本地淡水魚。在eDNA技術(shù)的支持下，分析生物多樣性也變得更加便捷，但需要更豐富的引物集來和DNA序列進(jìn)行配對，才能識別更多的物種。

生物多樣性檢測依賴于精確快速的基因測序技術(shù)，目前它已經(jīng)發(fā)展到第三代。第三代基因測序技術(shù)[43-44]采用單分子讀取技術(shù)，并且不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增處理，具有更高的通量和測序效率，操作過程更簡便，測序速度更快，讀長更長，可達(dá)幾千個堿基，可進(jìn)一步節(jié)省測序成本，同時克服了傳統(tǒng)檢測分析中錯誤頻率較高的問題，這對于提高eDNA技術(shù)在物種檢測方面的檢出率有很大幫助。

此外，eDNA技術(shù)在河流水質(zhì)評價和水污染評價[45-46]、病原體的檢測[47-49]等方面也有應(yīng)用，如eDNA序列的種類、濃度大小及變化速率、濃度分布等可以反映出指示生物的多樣性和物種豐度及其變化、指示物種的群落分布及結(jié)構(gòu)變化、食物鏈?zhǔn)澄锞W(wǎng)的能量流動、動植物的相互作用以及其在維持生態(tài)系統(tǒng)功能和提供生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)中的作用等[50-51]；在病原體檢測方面，eDNA技術(shù)可監(jiān)測河流環(huán)境中物種攜帶的病原體，這能起到很好的疾病預(yù)防作用。

3 研究展望

eDNA技術(shù)是集高效、精準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化為一體的新一代生物物種和多樣性檢測和監(jiān)測工具，相較于傳統(tǒng)調(diào)查方法具有明顯優(yōu)勢，隨著第三代基因測序技術(shù)的發(fā)展，eDNA技術(shù)檢測和監(jiān)測結(jié)果更加精確，在河流生態(tài)環(huán)境和物種保護(hù)中也發(fā)揮著更廣泛的作用。然而作為一種新技術(shù)，未來eDNA技術(shù)在河流生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用研究應(yīng)著重在以下幾個方面：

a.開展生物及非生物因素對eDNA濃度的影響機(jī)理研究。雖然eDNA技術(shù)在物種生物量估測和生物多樣性分析等方面具有巨大的潛力，但因為生物及非生物因素的影響，該技術(shù)大面積應(yīng)用還存在一定的局限性。例如，eDNA的產(chǎn)生率和降解率直接影響著河流中的eDNA濃度，eDNA的持久性、轉(zhuǎn)移和沉降等間接影響著河流中的eDNA濃度，所以未來應(yīng)該建立eDNA濃度與生物、非生物因子之間的量化關(guān)系，以有效提高eDNA定量檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

b.因地制宜地豐富公共數(shù)據(jù)庫，開發(fā)設(shè)計適合當(dāng)?shù)氐耐ㄓ靡?。雖然通用引物能同時檢測出許多物種，但由于物種的生理特征和環(huán)境因素的不同，會導(dǎo)致通用引物的檢測出現(xiàn)檢測不出或結(jié)果錯誤的狀況，且目前對河流生態(tài)系統(tǒng)的群體質(zhì)量信息掌握不夠。因此加強(qiáng)通用引物設(shè)計和數(shù)據(jù)庫擴(kuò)展對檢測當(dāng)?shù)睾恿魃锶后w信息、生物多樣性、物種入侵以及制定物種保護(hù)政策非常重要。

c.開展eDNA采樣、保存、運(yùn)輸、提取、分析等全過程標(biāo)準(zhǔn)研究和制定。統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)是確保樣本研究過程和結(jié)果具有可對比性的重要條件。

d.將傳統(tǒng)調(diào)查方法和eDNA技術(shù)結(jié)合。eDNA技術(shù)作為新興技術(shù)，還有著其不完善的地方，而傳統(tǒng)調(diào)查方法雖然缺點(diǎn)明顯，但是它的調(diào)查過程更直觀、識別率更高，并且不為地域所限，將兩者有效結(jié)合，可以互相彌補(bǔ)，顯著提升河流物種檢測和監(jiān)測精度。但是在具體使用過程中如何結(jié)合需要進(jìn)一步探索。

e.拓展eDNA技術(shù)的應(yīng)用研究范圍。除了應(yīng)用在河流生物入侵檢測和監(jiān)測等方面，未來eDNA技術(shù)應(yīng)加強(qiáng)在食物網(wǎng)、檢測物種體內(nèi)病原體、能量流動等方面的應(yīng)用研究，便于更全面地了解河流生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)程，掌握河流健康動態(tài)。