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        STAT3在骨肉瘤中的研究進展

        2021-12-06 21:22:59鐘彬龍邵增務
        關鍵詞:結構域磷酸化抑制劑

        鐘彬龍, 邵增務

        華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科醫(yī)院,武漢 430022

        骨肉瘤是最常見的骨源性惡性腫瘤,多見于兒童和青少年。骨肉瘤的發(fā)病率雖然不高,但是其具有極高的致殘致死率,而對患者及其家庭、社會帶來了巨大的精神和經(jīng)濟負擔[1-3]。早期骨肉瘤癥狀較不明顯,很多患者在第一次就醫(yī)時就已經(jīng)出現(xiàn)遠處轉移。近年來隨著規(guī)范化化療和手術治療的進步,骨肉瘤患者預后已經(jīng)得到了較大改善,但是對于已經(jīng)出現(xiàn)遠處轉移的患者,其5年生存率仍不足20%[4]。

        信號轉導和活化轉錄因子(signal transducers and activators of transcriptions,STATs)是一組具有SH2(Src homology-2)蛋白結構域的胞質蛋白,在細胞中作為信號轉導信使和轉導因子,參與正常細胞對各種細胞因子和生長因子的應答。目前STATs已被證實參與基因表達的調控,如胚胎發(fā)育、程序性細胞死亡、器官形成、先天性和后天性免疫獲得等。STAT3是STATs中較為重要的一員,被細胞因子等激活后參與調節(jié)多種細胞生物學行為和功能,如細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、腫瘤新生血管形成及免疫逃逸等,在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用[5-6]。

        1 STAT3的結構

        STAT3的編碼基因位于17號染色體長臂2區(qū)1帶2號亞帶中(17q21.2),由750~795個氨基酸組成,蛋白分子質量約89 kD。STAT3蛋白的功能結構域與STAT家族的其他成員相似,包括有:①一個起始于130氨基酸的氨基端卷曲螺旋結構域,參與蛋白質-蛋白質相互作用;②中心一個DNA結合結構域,位于320~490氨基酸之間;③490~580氨基酸為連接器結構域,該結構域關系到STAT3與DNA結合的穩(wěn)定性;④一個SH2結構域,位于580~680氨基酸之間;⑤705氨基酸處為Tyr705酪氨酸磷酸化位點,較為保守;⑥一個羧基轉化結構域,其中Ser727位點為絲氨酸磷酸化位點。SH2結構域和羧基轉化結構域之間的Tyr705磷酸化后則引起2個STAT3分子的同源或者異源二聚體化,促進STAT3與DNA的結合[7]。

        2 STAT3的生物學功能

        在正常細胞中,為了避免產(chǎn)生異常的基因表達,STAT3的激活控制十分嚴格。細胞因子等刺激后15~60 min STAT3的磷酸化即到達峰值,并在數(shù)小時后開始下降[8]。整個過程受到負向調節(jié)蛋白的調控,如細胞因子信號蛋白抑制子家族(SOCS1~7)和CIS,活化后STATs蛋白抑制子(PIAS),以及包括SHP-2、PTP1B、TC45、SHP-1和泛素依賴性蛋白體降解系統(tǒng)在內的蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTPs)[9]。STAT3的組成性激活在細胞增殖、存活、炎癥反應、侵襲、轉移和血管形成等中起重要作用。活化后的STAT3形成二聚體進入細胞核中,與下游Cyclin D1、Cyclin B和cdc2啟動子結合啟動轉錄,促使細胞周期的運轉而起到促進細胞增殖的作用。另一方面,STAT3通過下調促凋亡因子,如Fas,來間接促進細胞增殖。此外,STAT3還可通過調節(jié)Survivin、Bcl-2、BclxL和Mcl-1等抗凋亡蛋白的基因表達來實現(xiàn)促進腫瘤細胞存活、抑制凋亡的目的。

        3 STAT3在骨肉瘤中的作用

        3.1 STAT3表達在骨肉瘤中的臨床意義

        STAT3在許多常見惡性腫瘤中往往表現(xiàn)出高表達,如乳腺癌、前列腺癌、尿路上皮癌、肺癌等[10-13]。同樣的,在骨肉瘤腫瘤組織中STAT3也呈現(xiàn)出異常的高表達[14-16],并對病情發(fā)展及預后具有指導意義。

        Ryu等[14]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中STAT3均呈現(xiàn)出結構化高表達,且磷酸化STAT3(p-STAT3)在大部分骨肉瘤患者中過表達,p-STAT3高表達患者的預后明顯較低表達者差。

        Wang等[16]收集了76例骨肉瘤患者的腫瘤標本與正常骨組織、軟骨組織進行比較,發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中STAT3的mRNA水平和蛋白水平明顯增高。STAT3的蛋白表達水平與腫瘤分化、腫瘤轉移相關,而與腫瘤大小、位置和病理分型無明顯相關性。組織中高表達STAT3的骨肉瘤患者5年無病生存率和總生存率(21.8%和23.5%)均較低表達組(57.5%和60.8%)低[16-17],STAT3在腫瘤中的表達是骨肉瘤無病生存率和總生存率的一個獨立預后因素。

        骨肉瘤化療和手術治療的發(fā)展給大多數(shù)骨肉瘤患者的長期生存帶來了福音,但是仍有30%~40%的患者在后期發(fā)生骨肉瘤復發(fā),其中約70%的患者因骨肉瘤復發(fā)進展而死亡。Salas等[18]利用化療后骨肉瘤壞死率是否大于90%將患者分為化療敏感和不敏感兩個組別進行基因和蛋白水平的對比,發(fā)現(xiàn)化療不敏感組的骨肉瘤患者腫瘤組織中STAT3和ERK1的mRNA水平異常增高,且化療不敏感患者的組織中p-STAT3和p-ERK1蛋白表達明顯增高。聯(lián)合p-STAT3和p-ERK1可對患者化療敏感與否進行準確預測,陽性預測值大于90%。利用該預測方案可在腫瘤處穿刺進行病理診斷的同時開展患者對化療方案是否敏感的預測,指導化療策略的制定。

        3.2 STAT3對骨肉瘤細胞的影響

        3.2.1 細胞周期與增殖 在細胞周期中,細胞進行基因組的自我復制、細胞生長并進一步分裂為2個子細胞,完成增殖過程。p-STAT3的結構性表達促進重要周期相關蛋白的異常表達,引起腫瘤細胞不可控的細胞增殖,與腫瘤細胞周期密切相關的有Cyclin D1、Cyclin B和cdc2。其中Cyclin D1在G0/G1期向S期轉化中起重要作用,Cyclin D1合成后結合CDK4和CDK6,形成Cyclin D1-CDK4/6復合物,進一步磷酸化下游Rb基因[19],釋放E2F蛋白以啟動其他基因的轉錄過程。研究表明骨肉瘤細胞系高表達STAT3和p-STAT3,抑制STAT3活化可以下調Cyclin D1的表達,進一步抑制骨肉瘤細胞的增殖能力[20-22]。長鏈非編碼RNA HOXD-AS1被認為是一種原癌基因,在骨肉瘤中高表達且具有促腫瘤作用。HOXD-AS1可能是通過上調STAT3及其活性而增加Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2的表達進而達到促骨肉瘤增殖作用[23]。敲低HOXD-AS1的同時可觀察到STAT3的激活受到抑制,Cyclin D1表達下降,細胞被阻滯于G0/G1期[23]。相似的,STAT3還可作為下游效應分子參與miR-126[24]、miR-199a-3p[25]、miR-199a-5p[26]、miR-19[27]和miR-125b[28]等非編碼RNA對骨肉瘤細胞增殖過程的調控。

        3.2.2 細胞凋亡與存活 細胞凋亡是一種細胞的程序性死亡,正常情況細胞凋亡和細胞生存相互牽制處于平衡狀態(tài)。惡性腫瘤中,腫瘤細胞通過表達抗凋亡蛋白(如Bcl-2)、下調或者突變促凋亡蛋白(如Bax)以獲得對細胞凋亡的耐受性,導致其突破正常壽命而異常存活。許多抗凋亡分子,如Survivin和Bcl家族(Bcxl、Bcl-2、Mcl-1)是STAT3的下游靶基因,受到STAT3的正向調控[15,21]。Couto等[20]利用小分子抑制劑LLL12抑制STAT3活性后探索4種犬類骨肉瘤細胞系的凋亡水平,發(fā)現(xiàn)當STAT3被抑制后骨肉瘤細胞的凋亡水平增高,STAT3下游靶基因Cyclin D1、Bcl-2、Mcl-1和Survivin均受到抑制。另外,使用STAT3抑制劑LLL3或S31-201,或利用siRNA敲低STAT3也可觀察到骨肉瘤細胞由Caspase3/7介導的細胞凋亡增加[15,21]。通過藥物篩選,Oi等[29]發(fā)現(xiàn)葫蘆素I(cucurbitacin I)可降低STAT3活性,增加骨肉瘤細胞凋亡水平,上調Mcl-1、cleaved PARP和Caspase-3等凋亡相關蛋白[29]。

        3.2.3 遷移和侵襲 惡性腫瘤的局部侵襲性和遠處轉移是臨床診療中的棘手問題之一。金屬基質蛋白酶(MMPs)在組織重構中發(fā)揮關鍵作用,其主要功能是降解并重組細胞間質。惡性腫瘤中MMP-2和MMP-9分泌增加以降解細胞基底膜,使腫瘤細胞向外侵襲周圍正常組織。同時MMPs還可促進腫瘤微環(huán)境中VEGF和EGF等的水平,導致腫瘤新生血管形成,引起腫瘤向遠處轉移。惡性腫瘤中異常表達的STAT3激活金屬基質蛋白酶MMP-2,MMP-1,MMP-9及MMP-10的轉錄,促進腫瘤細胞的侵襲和遷移。在骨肉瘤中,腫瘤相關巨噬細胞(TAM)通過上調p-STAT3、MMP-9和COX-2的表達促進骨肉瘤細胞的轉移和上皮間質轉化(EMT)[30]。Tu等[31]發(fā)現(xiàn)間充質干細胞可以向骨肉瘤細胞分泌IL-6,并通過磷酸化STAT3促進骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力,提示骨肉瘤周圍正常骨中的間充質干細胞可通過STAT3通路促使骨肉瘤的轉移并抑制腫瘤細胞凋亡[31]。小分子化合物LLL12和LLL32作為STAT3的特異性抑制劑,可以抑制IL-6誘導的STAT3活化,使骨肉瘤細胞遷移和侵襲能力受到抑制,同時降低腫瘤的形成能力[32]。

        3.2.4 血管形成 腫瘤內部形成的復雜微血管網(wǎng)絡結構確保了腫瘤整體細胞生長所需的營養(yǎng)物質和氧氣,并提供了一個有效的代謝廢物排泄途徑,在腫瘤生長和轉移中起重要作用[33]。結構化STAT3的激活參與了惡性腫瘤在體內的新生血管形成過程[34]。在頭頸部惡性腫瘤和惡性黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)異常表達的STAT3可以上調VEGF的表達,從而促進腫瘤微血管的新生[35]。阻斷STAT3信號通路可以抑制由Src誘導的VEGF上調,顯著下調VEGF依賴的血管滲透性[36]。越來越多研究表明轉移性骨肉瘤通過血管新生和仿血管生成形成十分復雜和強健的血管體系。更特殊的是,轉移性骨肉瘤細胞可以通過仿血管生成直接形成腫瘤血管,無需依賴血管內皮細胞的參與[37-38]。Bao等[39]發(fā)現(xiàn)非洲防己堿可以顯著降低p-STAT3的水平,抑制細胞增殖和骨肉瘤細胞所介導的血管新生。抑瘤素M是IL-6細胞因子家族的一員,F(xiàn)ossey等[40]發(fā)現(xiàn)人和犬類骨肉瘤細胞中有抑瘤素M受體的表達,外源性給予抑瘤素M促進了STAT3的磷酸化并上調Src和JAK2活性,顯著增加骨肉瘤細胞VEGF的表達,促進骨肉瘤新生血管形成,使用STAT3特異性抑制LLL3可抑制由抑瘤素M誘導的STAT3激活和腫瘤血管形成。同樣的,Xie等[41]發(fā)現(xiàn)中藥單體成分青藤堿可以通過CXCR4-STAT3信號軸抑制骨肉瘤腫瘤相關血管的形成。

        4 STAT3抑制劑在骨肉瘤中的研究

        STAT3的結構性表達在骨肉瘤等惡性腫瘤增殖、凋亡、遷移、侵襲以及血管形成等中發(fā)揮重要作用,因此有必要將STAT3作為治療惡性腫瘤的新靶點,研發(fā)新型抑制劑用于臨床。

        4.1 合成特異性小分子抑制劑

        4.1.1 LLL3 LLL3是一種基于蒽主鏈衍生物的小分子化合物,其結構類似于STA-21(一種已被成功用于抑制STAT3表達細胞的化合物)。LLL3較STA-21易于合成,且仍具有STA-21結合STAT3 SH2結構域并抑制其與DNA結合啟動轉錄的功能[42]。LLL3處理后骨肉瘤細胞STAT3與Survivin啟動子的結合減少,并濃度依賴和時間依賴性地降低骨肉瘤細胞的增殖水平,上調Caspase3/7活性,增加細胞凋亡。LLL3還可通過抑制STAT3活性降低MMP-2和VEGF的表達,抑制骨肉瘤細胞侵襲能力和血管新生能力[15]。

        4.1.2 LLL12 LLL12是一種優(yōu)化后的LLL3類似物,其通過結合STAT3單體的T705磷酸化位點阻斷STAT3的二聚體化,使其不能順利進入細胞核中發(fā)揮作用。Couto等[20]使用LLL12處理犬類骨肉瘤細胞,發(fā)現(xiàn)LLL12可以抑制骨肉瘤細胞的增殖、誘導細胞凋亡,抑制STAT3的磷酸化并下調STAT3下游靶基因(Survivin,Cyclin D1,Mcl-1和Bcl-2)的轉錄而起到抗骨肉瘤的作用。除此之外,LLL12與骨肉瘤經(jīng)典化療藥多柔比星具有互相協(xié)同的抗骨肉瘤效應。抑制STAT3磷酸化后,LLL12還可下調VEGF、MMP-9、血管生成素1/2、組織因子和FGF-1的表達,抑制骨肉瘤新生血管的形成[43]。

        4.1.3 FLLL32 FLLL32是姜黃素的小分子類似物,較姜黃素更具選擇性地抑制JAK2/STAT3信號通路,能更有效且牢固地結合STAT3的SH2結構域,抑制STAT3二聚體化。在骨肉瘤中,F(xiàn)LLL32降低了STAT3與DNA結合的能力下調總STAT3和p-STAT3的表達,抑制細胞增殖和遷移,并促使細胞發(fā)生Caspase3依賴性的細胞凋亡。STAT3下游靶基因如Survivin、VEGF、MMP-2的mRNA和蛋白水平也隨之下降[32,44]。

        4.1.4 阿帕替尼(Apatinib) 阿帕替尼是一種新型的高選擇性抑制血管內皮生長因子受體2(VEGFR-2)酪氨酸激酶,在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要的抗血管形成作用,目前已被用于胃癌等多種癌癥的靶向治療。在骨肉瘤中,阿帕替尼可抑制骨肉瘤細胞的生長,將細胞阻滯于G0/G1期,誘導細胞凋亡和自噬[45]。阿帕替尼通過抑制STAT3和Bcl-2的表達,降低STAT3活性,抑制骨肉瘤細胞遷移、侵襲能力,下調骨肉瘤內皮間質化進程[46]。

        4.2 天然產(chǎn)物抑制劑

        除了人工合成的小分子STAT3抑制劑外,近年來對天然產(chǎn)物的研究越來越多,其提取物中不斷涌現(xiàn)出可以抑制STAT3通路的單體成分。

        4.2.1 葫蘆素I(Cucurbitacin I)和葫蘆素B(Cucurbitacin B) 葫蘆素是葫蘆科植物中提取出來的三萜甾醇類物質,由于其具有抗炎止痛的效果已經(jīng)作為一種傳統(tǒng)藥物廣泛應用于治療中。近年來葫蘆素B、D、E、Q和I等葫蘆素衍生物相繼被提取出來,研究發(fā)現(xiàn)部分葫蘆素還具有抗腫瘤作用。其中葫蘆素I具有明顯細胞毒性和抗增殖作用,能抑制STAT3的激活。葫蘆素I能夠濃度依賴和時間依賴地抑制骨肉瘤細胞的增殖,抑制STAT3的活化和Mcl-1、Cyclin D1、c-Myc和Survivin的表達,促進細胞凋亡,增加cleaved PARP和cleaved-Caspase3的水平[29]。葫蘆素B也是一種STAT3抑制劑,通過抑制JAK2/STAT3通路信號和MMP-2、MMP-9介導抑制骨肉瘤增殖、遷移,促進細胞凋亡。葫蘆素B處理后的骨肉瘤細胞VEGF水平明顯下降,表明葫蘆素B還具有抑制骨肉瘤血管形成的功能[47]。

        4.2.2 4-甲氧基黃檀醌(4-methoxydalbergione,4-MD)和4-parvifuran 降香黃檀(D.odorifera)是一種主要分布于中國的植物,其心材常被中國和朝鮮人當做一種治療血液性疾病、缺血性疾病、水腫、風濕痛等疾病的傳統(tǒng)藥物。Park和Yun等[48-49]從降香黃檀中提取出4-甲氧基黃檀醌(4-MD)和4-parvifuran兩種有效單體,發(fā)現(xiàn)二者均通過JAK2/STAT3信號通路抑制STAT3的磷酸化發(fā)揮抗腫瘤作用。其中4-MD可以上調骨肉瘤細胞cleaved-Caspase3和cleaved-PARP的水平,降低Bcl-2、Bcl-xl和Survivin等抗凋亡蛋白的表達。4-parvifuran除了發(fā)揮抑制增殖和促進凋亡作用外,對骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力也有抑制作用,并下調MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白水平。

        4.2.3 維泰醇(Alternol) 維泰醇是一種新型的活性單體成分,通過紅豆杉樹皮中一種微生物菌誘變株發(fā)酵純化而來。維泰醇和紫杉醇一樣均具有一定的抗腫瘤功效,在多種腫瘤中表現(xiàn)出致周期阻滯和誘導細胞凋亡等特性[50]。維泰醇可抑制骨肉瘤細胞STAT3的活化,降低細胞增殖和遷移能力。維泰醇還可導致骨肉瘤細胞活性氧ROS的增加,JNK、ERK1/2和p38通路的激活,表明ROS依賴的MAPK信號通路和STAT3信號通路在維泰醇抑制骨肉瘤過程中起重要作用[51]。

        4.2.4 銀杏素(Ginkgetin) 銀杏素是一種從銀杏葉中偶然分離而來的雙黃酮類分子,具有調血脂、治療心絞痛、消炎抗氧化等療效。近十多年來研究發(fā)現(xiàn)銀杏素還具有抗腫瘤的作用。Xiong等[52]將銀杏素應用于骨肉瘤的研究中,發(fā)現(xiàn)銀杏素可以抑制STAT3的激活,具有較強細胞毒性,可以抑制骨肉瘤細胞生長,激活Caspase3/9途徑細胞凋亡。銀杏素通過抑制STAT3磷酸化下調其下游靶基因Bcl-2、Bcl-xL、Survivin和Cyclin D1的表達。

        4.2.5 白藜蘆醇(Resveratrol) 白藜蘆醇是一種天然的多酚化合物,存在于多種植物體內,如桑樹、花生、葡萄等,具有抗病毒、抗腫瘤、調血脂等生物活性。研究報道白藜蘆醇具有抗白血病、前列腺癌、胃癌等惡性腫瘤的作用,且能夠誘導胰腺癌腫瘤干細胞的凋亡[53]。白藜蘆醇抑制骨肉瘤細胞活力和自我更新,降低骨肉瘤細胞的腫瘤形成能力。白藜蘆醇可通過下調STAT3磷酸化水平抑制JAK2/STAT3通路的活性,降低CD133而降低骨肉瘤干細胞的干性。外源性給予STAT3可以減弱白藜蘆醇對骨肉瘤干細胞的抑制作用[54]。

        4.2.6 其他天然抑制劑 除了上述幾種天然STAT3抑制劑外,氯原酸、藍萼甲素A、千金藤素等[41,55-56]也具有STAT3抑制活性和抗骨肉瘤作用。氯原酸能以劑量依賴性方式抑制骨肉瘤細胞的細胞活力,通過抑制STAT3/Snail通路的活性誘導細胞增加Caspase3/7活性導致細胞凋亡[56]。藍萼甲素A抑制STAT3的磷酸化而不降低總STAT3的表達,降低STAT3下游基因如Cyclin D1和BCl-2的表達,還可以抑制IL-6誘導的STAT3在細胞核中的聚集[57]。與藍萼甲素A不同,千金藤素下調STAT3磷酸化水平的同時也抑制了總STAT3的表達,STAT3的下游基因Bcl-xL、c-Myc和Cyclin D1也受到抑制[58]。

        5 展望

        STAT3在惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、卵巢癌等中常常表現(xiàn)出結構性表達,在腫瘤細胞生長、增殖、凋亡和腫瘤發(fā)生中起重要作用。在骨肉瘤中,STAT3同樣發(fā)揮著促進骨肉瘤作用,而人為抑制STAT3的激活則出現(xiàn)骨肉瘤細胞增殖、血管形成、侵襲和遷移受抑制,同時細胞凋亡增多的治療作用。

        已有較多研究表明腫瘤組織中異常表達的STAT3和p-STAT3可以作為骨肉瘤預后、化療藥敏感與否的輔助指標,但是目前該指標仍未進入臨床試驗,說明STAT3在臨床預后應用中的證據(jù)仍有不足,需要大樣本多中心的臨床探索給予實踐支撐。

        骨肉瘤中STAT3的表達異常還可以作為研發(fā)新型靶向治療的線索,或許在未來使用STAT3抑制劑進行靶向治療是一種不錯的選擇。根據(jù)STAT3激活的過程,阻斷或者抑制STAT3的策略可有以下幾種:①抑制細胞膜上受體配體復合物的形成;②阻斷磷酸化受體胞質端的激酶;③誘導增強可以將p-STAT3去磷酸化的磷酸化酶的活性;④抑制JAK激酶以阻止STAT3的二聚體化;⑤阻止STAT3向核內轉移;⑥抑制STAT3與DNA結合,阻斷其促轉錄作用;⑦反義STAT3策略的應用;⑧誘騙寡聚脫氧核苷酸。目前已有一部分人工合成和天然的STAT3抑制劑引起了研究者的重視,但是這些抑制劑的具體機制尚不明確,且沒有一種抑制劑真正進入了骨肉瘤治療臨床試驗階段。因此研發(fā)具有臨床意義的STAT3抑制劑仍是未來科研和臨床工作者的巨大挑戰(zhàn)之一。

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