廖榮恒 祁禛 汪永義

心臟纖維化是一種以肌成纖維細胞過度分泌與細胞外基質過度沉積為特點的病理過程，急性心肌梗死(AMI)后，心臟成纖維細胞在以轉化生長因子-β1(TGF-β1)為主的細胞因子作用下分化為肌成纖維細胞，并分泌大量細胞外基質(ECM)，使心臟順應性下降，影響心臟正常功能[1-2]。心臟成纖維細胞分泌的細胞外基質是維持正常心臟結構必不可少的成分，但分化的肌成纖維細胞分泌細胞外基質的能力大大提升，從而導致心臟纖維化[3-4]。細胞外基質的特異性構成組分是α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)[5]，常作為評價細胞外基質生成的標準。其次，心臟成纖維細胞分化的特征還包括細胞增殖和遷移能力增強[6]。

RhoA/ROCK通路由Rho家族小G蛋白最具代表性的亞型RhoA及其下游分子Rho相關激酶(ROCK)構成，廣泛參與如轉錄調節(jié)、遷移、黏附、增殖、細胞生存與凋亡等細胞基本功能的調控[7]。ROCK家族包括2種亞型，即ROCK1與ROCK2，兩者具有高度同源性[8]。作為調節(jié)細胞行為的重要信號通路，RhoA和ROCK1廣泛參與血管平滑肌增生、心肌肥厚和心肌纖維化等過程[9-11]。本研究擬探究RhoA/ROCK2通路在AMI后心臟成纖維細胞分化過程中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)和轉染

人心臟成纖維細胞在含5%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗處理前，成纖維細胞在無血清DMEM/F12中饑餓6 h,然后用含10 ng/L TGF-β1帶血清DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)。RhoA 小干擾RNA通過Lipo3000在無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基中轉染8 h，之后換成用含10 ng/L TGF-β1帶血清DMEM/F-12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

收集細胞后于常溫下用lysis buffer裂解15 min，收集裂解液后通過EZ-press RNA提取試劑盒(EZ-bioscience)提取總RNA并確定樣本濃度,之后通過HiScript Ⅱ 逆轉錄試劑盒(Vazyme)合成為cDNA。qRT-PCR采用ChamQ SYBR 綠色熒光染料(Vazyme)與引物混合后在熒光定量熱循環(huán)儀中進行反應。

1.3 免疫印跡分析(Western blot)

收集細胞后通過RIPA在4 ℃條件下對細胞樣本進行裂解，收集裂解液后15 000 g離心15 min取上清液。測定蛋白質樣本濃度通過BCA蛋白定量試劑盒(Beyotime)進行。等量的蛋白樣本通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移到硝酸纖維素膜(PVDF膜)上，室溫條件下在5%牛血清白蛋白(Thermofisher)中封閉2 h。封閉結束的PVDF膜在4 ℃條件下用對應的一抗孵育過夜，并在室溫條件下用TBST清洗3次。之后在與一抗相同種屬的二抗(Beyotime)中孵育1 h，TBST洗3遍后采用增強化學發(fā)光試劑(Vazyme)顯影，并采用ImageJ 軟件處理圖像數(shù)據(jù)。

1.4 劃痕實驗

細胞種植于六孔板生長至90%密度后，用200 μL槍頭在劃痕尺的引導下于，每孔左、中、右分別劃1道劃痕。用PBS洗滌3次后，細胞在不同的處理組中繼續(xù)培養(yǎng)。相應時間內，六孔板在倒置相差顯微鏡下通過明場觀察并測量劃痕寬度變化(放大倍數(shù)100倍)。

1.5 Transwell試驗

細胞經過不同組的處理后，將等量的細胞懸浮于1.5 mL無血清培養(yǎng)基中種植于Transwell板(Corning)上腔，在下腔中放入2 mL含25%血清的培養(yǎng)基。經過24 h的培養(yǎng)后，遷移至腔底的細胞被固定在4%的甲醛中,用結晶紫(Beyotime)染色后，在光學顯微鏡下(放大倍數(shù)100倍)隨機選取5個明場視野計數(shù)發(fā)生遷移的細胞數(shù)。

1.6 小鼠心肌梗死后纖維化模型建立與免疫組織化學染色

將12只6～8周健康雄性C57小鼠隨機分為2組，每組6只。假手術組于異氟烷麻醉后切開氣管，直視下插管機械通氣。AMI組經左胸切口進胸后，尋找小鼠冠狀動脈左前降支，結扎相同位置左前降支，保證梗死面積約60%。術后于SPF環(huán)境中飼養(yǎng)21 d，處死后取出小鼠心臟，結扎點以下石蠟包埋切片，予以對應抗體染色后，樹脂封片于顯微鏡下明場觀察。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad 7.0軟件進行作圖及統(tǒng)計學分析。兩組樣本之間比較采用Student′st檢驗，多組(n≥3)樣本之間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RhoA、ROCK2在梗死心臟組織中表達水平增加

小鼠心臟組織切片中，AMI組梗死區(qū)與假手術組相比，RhoA與ROCK2的表達均明顯增加(圖1)，心臟組織勻漿中，AMI組較假手術組α-SMA、RhoA和ROCK2的mRNA和蛋白表達水平均明顯增加(表1)。

表1 2組小鼠心臟組織RhoA、ROCK2、α-SMA表達水平比較(n=6)

圖1 假手術組與AMI 組心臟組織RhoA與ROCK2蛋白表達

2.2 RhoA與ROCK2在TGF-β1刺激下分化的成纖維細胞中表達增加

TGF-β1刺激成纖維細胞，α-SMA表達隨時間梯度逐漸增加。4個時間點中，RhoA與ROCK2的mRNA與蛋白層表達水平在48 h之前隨時間梯度增加，而48 h時表達水平相對24 h時下降(見表2)。

表2 TGF-β1刺激后成纖維細胞中RhoA、ROCK2、α-SMA的表達水平(n=3)

2.3 TGF-β1刺激下分化的成纖維細胞遷移能力增加

TGF-β1刺激成纖維細胞后進行劃痕試驗與Transwell實驗，細胞劃痕愈合比例與穿膜數(shù)量在24 h之前隨時間而增加(見表3)，細胞遷移能力增加，且細胞遷移能力與RhoA、ROCK2變化情況一致。

表3 成纖維細胞劃痕愈合比例與穿膜數(shù)量(n=3)

2.4 TGF-β1通過RhoA/ROCK2通路增強細胞遷移以促進成纖維細胞分化

利用RhoA小干擾RNA敲低RhoA表達后，相對于TGF-β1+空白小干擾RNA組，TGF-β1+RhoA小干擾RNA組α-SMA、RhoA與ROCK2蛋白表達水平均下降，而空載小干擾RNA不影響實驗結果(見表4)。對同樣處理的細胞進行劃痕實驗與Transwell實驗，相對于TGF-β1+空白干擾RNA組，TGF-β1+RhoA小干擾RNA組成纖維細胞劃痕愈合比例與穿膜量均明顯下降(見表5)。

表4 各組成纖維細胞中α-SMA、RhoA、ROCK2蛋白的表達水平比較(n=3)

表5 各組成纖維細胞劃痕愈合比例與穿膜數(shù)量比較(n=3)

3 討論

心臟成纖維細胞是心臟中最重要的細胞成分之一，在心臟的結構維持中起著至關重要的作用[12]。心肌梗死后TGF-β1表達增加，引起心臟成纖維細胞過度激活，造成ECM過度沉積，導致心功能障礙和心力衰竭[13-15]?，F(xiàn)有治療心臟纖維化的藥物由于不良反應和未知風險在臨床上的應用受到限制。因此，探索心臟纖維化下游機制成為解決這個問題的重要方向。本研究結果提示RhoA/ROCK2通路參與心臟纖維化的過程，其相關抑制治療可能是預防和治療心臟纖維化的一個新的潛在方向。

RhoA/ROCK1通路作為典型的細胞遷移信號通路，廣泛參與細胞骨架形成、細胞極化、遷移過程[16]。作為與ROCK1同源的ROCK2蛋白，其在心臟成纖維細胞遷移過程中的作用尚不清楚。在腫瘤治療領域，針對RhoA/ROCK通路的治療策略已見文獻報道[17]，臨床應用具有一定前景。因此，研究RhoA/ROCK通路參與心臟成纖維細胞分化的機制具有一定的臨床價值。

本研究通過構建小鼠AMI后纖維化模型和人成纖維細胞系分化模型明確了RhoA、ROCK2在小鼠心臟梗死后纖維化區(qū)域和分化的心臟成纖維細胞中表達增加。通過構建小干擾RNA敲低RhoA蛋白表達，進一步明確了RhoA/ROCK2通路與心臟成纖維細胞遷移的關系。本研究結果證實RhoA/ROCK2通路可通過增強細胞遷移能力促進心臟成纖維細胞分化，在TGF-β1誘導的心臟成纖維細胞分化過程中，RhoA/ROCK2通路通過增強細胞遷移能力，促進心臟成纖維細胞分化，從而促進AMI后心臟纖維化過程。本研究為通過干擾RhoA/ROCK2通路改善心肌梗死后心臟纖維化過程提供了理論依據(jù)。