王濤，崔月玲，王曉聰，譚薇

（遵義市第一人民醫(yī)院 眼科，貴州 遵義563000）

2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus, T2DM）是一種以血糖升高為主要表現(xiàn)的代謝性疾病，糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy, DR）為其常見嚴(yán)重并發(fā)癥，是患者視力下降、失明的重要原因，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。DR 是一個(gè)復(fù)雜病理過程，與長(zhǎng)期血糖控制不佳、炎癥反應(yīng)、新生血管形成、細(xì)胞纖維化等有關(guān)[2]?？寡軆?nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）治療是目前DR 主要治療手段之一[3]。MicroRNA 是一類非編碼RNA 分子，廣泛參與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)過程，還可影響VEGF 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，與眼底疾病發(fā)生有密切關(guān)系[4-5]。MicroRNA-20a-5p （miR-20a-5p）為microRNA-17-92 基因簇一員，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡，血管新生形成等病理生理過程[6-7]。有研究報(bào)道，妊娠期糖尿病患者血清miR-20a-5p 水平明顯降低[8]；miR-20a-5p 能負(fù)向調(diào)控VEGF 抑制高氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變的血管新生[9]。本研究旨在分析DR 患者血清miR-20a-5p、VEGF 水平變化，探討miR-20a-5p 參與DR 發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，以期為DR防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2020年12月遵義市第一人民醫(yī)院眼科收治的82 例DR 患者為DR 組。其中，男性38 例，女性44 例；年齡39～74 歲，平均（64.15±11.06）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)2 型糖尿病防治指南（2017年版）》[10]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②符合《我國(guó)糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床診療指南（2014年）》[11]DR 診斷標(biāo)準(zhǔn)；③臨床資料完整；④入院前未接受抗DR 治療；⑤患者及家屬均知情。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并視神經(jīng)疾病、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、青光眼、白內(nèi)障等其他眼部疾??；②合并血管瘤；③先天性弱視；④急慢性感染性疾??；⑤嚴(yán)重肝腎功能障礙；⑥合并其他慢性疾??；⑦合并甲狀腺功能亢進(jìn)、皮質(zhì)醇增多癥等影響糖代謝疾?。虎嘤薪谑中g(shù)史。選取同期52 例單純T2DM 患者為T2DM 組。其中，男性23 例，女性29 例；年齡40～75 歲，平均（64.15±12.26）歲；符合《中國(guó)2 型糖尿病防治指南（2017年版）》[10]診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取同期42 例健康體檢者為對(duì)照組。其中，男性20 例，女性22 例；年齡41～78 歲，平均（65.25±11.61）歲。3 組研究對(duì)象的性別構(gòu)成、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

采集DR 患者、T2DM 患者入院時(shí)和對(duì)照組體檢時(shí)空腹靜脈血6 ml，3 000 r/min 離心10 min（離心半徑8 cm），分離血清，取上清液，分為2 份，置于-80℃冰箱中冷凍待檢。其中一份采用Trizol 試劑盒（武漢科昊佳生物科技有限公司，貨號(hào)：15596-026；規(guī)格：100 ml）提取血清總RNA，TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（試劑盒購(gòu)自杭州?；锛夹g(shù)有限公司，貨號(hào)：K1622；規(guī)格：100 Rxns）。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)，反應(yīng)體系：1.0 μl cRNA，0.3 μl Taq 酶，1.0 μl 引物，0.4 μl 10 mmol dNTP，1.2 μl 25 mmol MgCl2，2.0 μl 10×PCR buffer，3.5 μl DEPC水；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性90 s、95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s，循環(huán)40 次。miR-20a-5p 引物：正向5'-ATGCTAAAGTGC TTATAGT-3'，反向5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT TC-3'；以U6為內(nèi)參，引物：正向5'-CGCTTCGGCA GCAGCACATATAC-3'，反向5'-AATTTGCGTGTCAT CCTTGC-3'。采 用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-20a-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量。另一份采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）（試劑盒購(gòu)自上海西格生物科技有限公司，貨號(hào)：XG-E102939）檢測(cè)血清VEGF 水平，葡萄糖氧化酶法檢測(cè)空腹血糖（FBG）水平，膠乳凝集反應(yīng)法檢測(cè)糖化血紅蛋白（HbA1c）水平。

1.3 DR病情評(píng)估

DR 患者入院后行眼底檢查，根據(jù)DR 發(fā)展階段和嚴(yán)重程度[11]分為增殖型（proliferative diabetic retinopathy, PDR）27 例（PDR 組）和非增殖型（nonproliferative diabetic retinopathy, NPDR）55 例（NPDR 組）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，比較用t檢驗(yàn)、方差分析或H檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析用Pearson 法；影響因素的分析用多因素Logistic 回歸分析模型；繪制ROC 曲線；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組糖尿病病程及FBG、HbA1c水平比較

3 組糖尿病病程及FBG、HbA1c 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，DR 組糖尿病病程長(zhǎng)于T2DM 組，DR 組FBG、HbA1c 水平高于T2DM 組（P<0.05），T2DM 組FBG、HbA1c 水平高于對(duì)照組（P<0.05）。見表1。

表1 3組糖尿病病程及FBG、HbA1c水平比較

2.2 3 組血清miR-20a-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量、VEGF水平比較

3 組血清miR-20a-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量、VEGF 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，DR 組血清miR-20a-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于T2DM 組和對(duì)照組（P<0.05），VEGF 水平高于T2DM 組和對(duì)照組（P<0.05）；T2DM 組血清miR-20a-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（P<0.05），血清VEGF 水平高于對(duì)照組（P<0.05）。見表2。

表2 3組血清miR-20a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量、VEGF水平比較 （±s）

表2 3組血清miR-20a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量、VEGF水平比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與T2DM組比較，P<0.05。

組別DR組T2DM組對(duì)照組F 值P 值n 82 52 42 miR-20a-5p mRNA 0.43±0.06①②0.81±0.19①0.98±0.25 182.102 0.000 VEGF/（pg/ml）194.12±56.85①②102.26±20.952①65.13±19.07 158.222 0.000

2.3 不同程度DR 患者血清miR-20a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量及FBG、HbA1c、VEGF水平比較

PDR 組和NPDR 組患者血清miR-20a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量及FBG、HbA1c、VEGF 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），PDR 組血清miR-20a-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于NPDR 組，F(xiàn)BG、HbA1c、VEGF 水平高于NPDR 組。見表3。

表3 不同程度DR患者血清miR-20a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量及FBG、HbA1c、VEGF水平比較 （±s）

表3 不同程度DR患者血清miR-20a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量及FBG、HbA1c、VEGF水平比較 （±s）

組別PDR組NPDR組t 值P 值n 27 55 miR-20a-5p mRNA 0.39±0.06 0.45±0.05-5.045 0.000 FBG/（mmol/L）12.15±3.84 9.83±2.95 3.016 0.003 HbA1c/%11.03±1.69 9.50±1.20 4.712 0.000 VEGF/（pg/ml）223.97±64.79 179.47±46.51 3.564 0.001

2.4 DR 患者血清miR-20a-5p 與FBG、HbA1c、VEGF的相關(guān)性

Pearson 法分析顯示，DR 患者血清miR-20a-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量與FBG、HbA1c、VEGF 呈負(fù)相關(guān)（r=-0611、-0.799 和-0.545，均P=0.000）。

2.5 DR影響因素的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

以DR 發(fā)生（是=1，否=0）為因變量，糖尿病病程、FBG、HbA1c、miR-20a-5p、VEGF 為自變量，納入多因素Logistic 回歸模型，結(jié)果顯示，血清miR-20a-5p 高水 平[=0.254（95% CI：0.154，0.596）]為DR 發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素（P<0.05），糖尿病病程長(zhǎng)[=2.042（95%CI：1.422，2.933）]、血清HbA1c 高水平[=2.307（95% CI：1.101，4.833）]、血清VEGF 高水平[=2.570（95% CI：1.584，4.144）]為DR 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。見表4。

表4 DR影響因素的多因素Logistic回歸分析參數(shù)

2.6 血清miR-20a-5p、VEGF 對(duì)DR 發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值

血清miR-20a-5p 預(yù)測(cè)DR 發(fā)生的AUC 為0.816（95% CI：0.739，0.877），截?cái)嘀禐?.56，敏感性為97.56%（95% CI：0.915，0.997），特 異 性 為61.54%（95% CI：0.471，0.748）；血清VEGF 的AUC 為0.818（95%CI：0.742，0.879），截?cái)嘀禐?38.25 pg/ml，敏感性為57.32%（95% CI：0.447，0.683），特異性為96.15%（95% CI：0.868，0.995）；聯(lián) 合 預(yù) 測(cè)AUC 為0.892（95% CI：0.827，0.939），敏感性為91.46%（95% CI：0.832，0.965），特 異 性 為76.92%（95% CI：0.632，0.875）。見圖1。

圖1 血清miR-20a-5p、VEGF預(yù)測(cè)DR發(fā)生的ROC曲線

3 討論

DR 是一種嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，T2DM 患者長(zhǎng)期血糖控制不佳，血糖滲入眼部基底膜，引起眼局部組織缺血缺氧、炎癥反應(yīng)等，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖和纖維化，形成病理性新生血管，破裂出血后表現(xiàn)為眼底出血，患者視力模糊，隨著血管破裂，疤痕組織生長(zhǎng)又可牽拉視網(wǎng)膜，導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫落，最終喪失視力[3，11]。流行病學(xué)顯示，我國(guó)糖尿病病程5年和10～15年患者的DR 發(fā)生率為9.7%和80.0%，已成為嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題[1]，因此早期發(fā)現(xiàn)和闡明其發(fā)病機(jī)制對(duì)DR 防治意義重大。

MicroRNA 是一類長(zhǎng)度約22 個(gè)核苷酸的高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈非編碼RNA，能與靶mRNA 的3'非翻譯端相互作用，降解靶mRNA 或翻譯抑制，參與多種生物學(xué)過程。研究報(bào)道，缺血誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管后，缺血視網(wǎng)膜中存在多種miRNAs 異常表達(dá)，參與血管新生等過程[12]。miR-20a-5p 位于13 號(hào)染色體，已被證實(shí)參與乳腺癌、胃癌等實(shí)體瘤增殖、遷移、入侵等過程[13-14]。miR-17-92 基因簇作為miR-20a-5p 的前體，研究報(bào)道，轉(zhuǎn)染miR-17-92 基因簇能恢復(fù)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、新生血管能力[15]。PLATANIA 等[16]發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜和血清中miR-20a-5p 表達(dá)顯著降低，下調(diào)miR-20a-5p 表達(dá)能引起糖尿病小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成。本研究結(jié)果顯示，T2DM 組血清miR-20a-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，提示miR-20a-5p 低表達(dá)與T2DM 發(fā)生有關(guān)。結(jié)果還顯示，DR 組血清miR-20a-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于T2DM組，PDR 組血清miR-20a-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于NPDR 組，提示miR-20a-5p 不僅與T2DM 發(fā)生有關(guān)，還可能參與DR 發(fā)生，支持PLATANIA 等[16]的觀點(diǎn)。內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙是糖尿病患者血管生成并發(fā)血管并發(fā)癥的關(guān)鍵[17]。miR-20a-5p 能抑制高糖狀態(tài)下的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡和自噬，調(diào)節(jié)糖尿病小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞功能，進(jìn)而抑制新生血管生成[18]。該項(xiàng)研究進(jìn)一步佐證了本研究結(jié)果，本研究結(jié)果也顯示，血清miR-20a-5p 高水平為DR 發(fā)生的保護(hù)因素，說明miR-20a-5p 對(duì)DR 可能具有抑制作用，但關(guān)于其作用機(jī)制尚不明確。

VEGF 是一種糖蛋白，能通過結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性受體和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體，發(fā)揮增加血管通透性、促進(jìn)血管生成等作用，被認(rèn)為是DR 新生血管形成的主要調(diào)控因子[2]。本研究結(jié)果顯示，DR 組血清VEGF 水平高于T2DM 組和對(duì)照組，T2DM 組血清VEGF 水平高于對(duì)照組，PDR 組血清miR-20a-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于NPDR 組，符合既往研究報(bào)道[19]。血糖紊亂是DR 發(fā)生主要因素之一[2]。本研究結(jié)果顯示，DR 組FBG、HbA1c 高于T2DM 組，PDR 組FBG、HbA1c 高于NPDR 組，符合DR 患者血糖水平變化。本研究結(jié)果還顯示，DR 患者血清miR-20a-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量與FBG、HbA1c、VEGF 呈負(fù)相關(guān)，提示miR-20a-5p 可能通過影響血糖和VEGF 水平參與DR 發(fā)生過程。高氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜病變模型中，上調(diào)視網(wǎng)膜組織中miR-20a-5p 表達(dá)能通過抑制VEGF 減少小鼠視網(wǎng)膜血管新生[9]。體外DR 模型中，高濃度糖顯著降低了視網(wǎng)膜光受體中miR-20a-5p 表達(dá)，增加了VEGF 表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-20a-5p 至視網(wǎng)膜光受體，可顯著降低VEGF 表達(dá)，并抑制視網(wǎng)膜新生血管生成潛能[20]。上述研究表明，miR-20a-5p 可能通過負(fù)向調(diào)控VEGF 發(fā)揮對(duì)DR 的保護(hù)作用。DR 嚴(yán)重影響T2DM 患者生存質(zhì)量，玻璃體切割和視網(wǎng)膜激光光凝治療雖然能改善PDR 的視功能，但并不能解決根本問題，因此早期發(fā)現(xiàn)DR 十分必要[21]。本研究ROC 曲線顯示，miR-20a-5p 可作為預(yù)測(cè)T2DM 患者DR 發(fā)生的指標(biāo)，且聯(lián)合VEGF 后預(yù)測(cè)價(jià)值更高。

綜上所述，DR 患者血清miR-20a-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低，與FBG、HbA1c、VEGF 密切相關(guān)，miR-20a-5p 可能通過調(diào)控糖代謝和VEGF 介導(dǎo)DR的發(fā)生、發(fā)展，可作為DR 的預(yù)測(cè)指標(biāo)。但關(guān)于miR-20a-5p 參與DR 的確切機(jī)制，還需更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。