李雨鵬 宓 丹 潘 沖 李曉梅

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

咳嗽變異性哮喘（CVA）是一種以慢性咳嗽為主癥的呼吸道疾病，在就診的慢性咳嗽中占14%～62%，是慢性咳嗽的主要原因之一［1］。近年來由于環(huán)境因素影響CVA的患病率呈上升趨勢(shì)［2］。目前CVA治療主要以支氣管擴(kuò)張劑、吸入性糖皮質(zhì)激素等為主，盡管這些藥物取得了較好的臨床療效，然而長期應(yīng)用帶來的高血糖、骨質(zhì)疏松等副作用不容忽視。同時(shí)，這些治療并不能有效預(yù)防復(fù)發(fā)，減緩氣管重塑的發(fā)生。因此，需要尋找一種安全有效的治療方法。

中醫(yī)藥治療CVA在減輕氣道炎癥、降低氣道高反應(yīng)性，抑制氣道重塑等方面具有多靶點(diǎn)的作用［3］。扶正固本湯聯(lián)合“伏九貼”穴位貼敷是本科室基于“冬病夏治”理論研制的治療CVA有效方法，臨床療效顯著，但作用機(jī)制不清。近年來研究表明，免疫失衡是導(dǎo)致CVA發(fā)病的重要因素［4］。因此本研究從免疫相關(guān)因子角度，來闡述“伏九貼”聯(lián)合“扶正固本湯”治療CVA的部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性大鼠180～200 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：室溫22～24℃，濕度65%左右，復(fù)合鼠飼料喂養(yǎng)。

1.2 試劑及儀器 卵蛋白（OVA）：美國Sigma公司；氫氧化鋁干粉［AI（OH）3］、辣椒素：北京百奧萊博科技有限公司；白細(xì)胞介素-4（IL-4）酶聯(lián)免疫試劑盒、白細(xì)胞介素-10（IL-10）酶聯(lián)免疫試劑盒、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）酶聯(lián)免疫試劑盒：武漢博士生物技術(shù)有限公司。動(dòng)物超聲霧化器：江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司。石蠟包埋機(jī)：德國LEICA公司。病理切片機(jī)：德國LEICA公司。電熱恒溫水浴箱：北京國華醫(yī)療儀器廠。酶標(biāo)儀：BENCHMARK，BIO-RAD。Leica顯微鏡：DM2000徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 扶正固本湯，組成：黨參25 g，佛手15 g，茯苓 25 g，炙甘草15 g，芥子 5 g，桔梗 15 g，半夏15 g，山藥20 g，山茱萸15 g，五味子15 g，蟬蛻15 g。藥材用中藥煎藥機(jī)煎煮，含生藥3.0 g/mL。伏九貼：延胡索、細(xì)辛、白芥子等藥碾成粉末，姜汁調(diào)成膏狀。地塞米松片（天津天藥藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H12020686，規(guī)格：0.75 mg×100片）。

1.4 分組及造模 將SPF大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、治療組、地塞米松組，每組10只。根據(jù)文獻(xiàn)采用OVA聯(lián)合Al（OH）3多次激發(fā)致敏法制備CVA模型［5］。除空白組外，其余各組第1日腹腔注射2 mg卵蛋白OVA和100 mg的AI（OH）3，14 d后再次腹腔注射2 mg卵蛋白OVA和100 mg的Al（OH）3，空白組同時(shí)注射等量的生理鹽水。第15天后除空白組，其余各組予以1%OVA霧化，空白組用生理鹽水霧化，每日1次，共7 d。以大鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹肌收縮、咳嗽等表現(xiàn)確定模型成功。

1.5 藥物干預(yù) 末次霧化結(jié)束24 h后各組予相應(yīng)藥物。1）治療組：扶正固本湯6 g/（kg·d）灌胃，給藥體積設(shè)為1 mL/100 g，同時(shí)將伏九貼敷藥貼制成0.5 cm×0.5 cm大小，厚度為0.3 cm的藥餅，貼于背部相應(yīng)穴位處［大椎（雙側(cè)）、肺俞（雙側(cè)）、膏肓（雙側(cè)）、膻中］，用膠布固定，每日1次，每次1.5 h，持續(xù)14 d。2）地塞米松組：0.5 mg/（kg·d）地塞米松灌胃，給藥體積設(shè)為1 mL/100 g，每日1次，用生理鹽水浸紗布敷貼于相應(yīng)穴位處，每日1次，持續(xù)14 d。3）模型組、空白組：生理鹽水10 mL/（kg·d）灌胃，用生理鹽水浸紗布敷貼于相應(yīng)穴位處（同治療組），每日1次，持續(xù)14 d。

1.6 觀察指標(biāo) 1）觀察各組大鼠咳嗽次數(shù)變化情況：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠分組放入玻璃罩中，霧化10-4mol/L辣椒素溶液60 s（霧化流量3 mL/mim），記錄2 min內(nèi)各大鼠的咳嗽次數(shù)。2）IL-4、IL-10、TGF-β含量：動(dòng)物處死后取頸部、前胸正中皮膚切口，打開胸腔，用手術(shù)線結(jié)扎右主支氣管，于左側(cè)主支氣管進(jìn)行氣管插管，在氣管中下1/3處做一切口，將灌洗針插入氣管并結(jié)扎固定，進(jìn)行支氣管肺泡灌洗。用注射器抽取預(yù)熱的生理鹽水（37℃）2.5 mL緩慢注入大鼠肺組織中，保留20 s，緩慢抽回。反復(fù)注入抽回操作5次，回收肺泡灌洗液（BALF），每只大鼠各收集BALF 10 mL，4℃保存。向5個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP管中預(yù)先加入250 μL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，再進(jìn)行倍比稀釋。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接作為空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔5孔，分別依次加入50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，待測(cè)樣品孔加待測(cè)BALF 50 μL，空白孔加50 μL。覆膜，37℃水浴箱孵育1 h。取出后洗滌，每孔加抗體工作液100 μL，覆膜，37℃孵育1 h。重復(fù)洗板3次，甩干。每孔加入酶結(jié)合工作液100 mL，覆膜，37℃水浴箱孵育30 min。重復(fù)洗板3次。每孔加入底物溶液100 μL，覆膜，37 ℃避光顯色。加入終止液50 μL，終止反應(yīng)，藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變黃色。在450 nm波長處用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度（OD）值，用OD值作為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)待測(cè)樣品的OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到其濃度，計(jì)算出結(jié)果。3）氣管及周圍組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察：取大鼠左肺中葉放入4%甲醛溶液中浸泡固定，脫水，石蠟包埋切片，脫蠟，HE染色，顯微鏡下400倍觀察氣管及其周圍組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析處理，采用LSD檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的，采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體征及咳嗽次數(shù)比較 見表1。空白組大鼠一般狀態(tài)較好，呼吸平穩(wěn)，毛色光澤，激發(fā)后伴有輕微咳嗽。模型組致敏后大鼠精神狀態(tài)較差，毛色失去光澤，反應(yīng)緩慢，激發(fā)后出現(xiàn)不同程度的咳嗽，口鼻分泌物較多。地塞米松組、治療組致敏后大鼠表現(xiàn)與模型組相似，經(jīng)14 d治療后兩組整體狀態(tài)顯著好轉(zhuǎn)，地塞米松組、治療組2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)較模型組比均顯著減少，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 各組大鼠2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)比較（次，±s）

注：與模型組比較，*P<0.05。

images/BZ_39_165_1052_1169_1118.png1.70±0.67 8.40±1.26 5.00±0.81*4.80±0.63*空白組模型組地塞米松組治療組10 10 10 10

2.2 各組大鼠肺部組織觀察 見圖1。經(jīng)HE染色后氣管周圍的嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞呈藍(lán)色。空白組：肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡上皮完整，氣管壁不增生，氣管上皮完整，腔內(nèi)無滲出液。模型組：氣管周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤，管腔變窄，黏膜水腫，結(jié)締組織輕度增生。地塞米松組、治療組同樣存在不同程度的氣管腔狹窄，炎性細(xì)胞浸潤，但較模型組程度減輕。

圖1 各組大鼠肺部組織觀察（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠BALF中IL-4、IL-10、TGF-β的含量比較 見表2。與空白組比，模型組BALF液中致炎因子IL-4顯著升高（P<0.05），地塞米松組、治療組可以抑制IL-4的表達(dá)，與模型組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。地塞米松組IL-4與治療組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與空白組比，模型組BALF液中抑炎因子IL-10、TGF-β顯著下降（P<0.05），地塞米松組、治療組可以促進(jìn)IL-10、TGF-β水平的表達(dá)，與模型組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。地塞米松組與治療組之間TGF-β含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療組IL-10含量顯著高于地塞米松組（P<0.05）。

表2 各組大鼠BALF中IL-4、IL-10、TGF-β的含量比較（pg/mL，±s）

表2 各組大鼠BALF中IL-4、IL-10、TGF-β的含量比較（pg/mL，±s）

注：與模型組比較，*P<0.05；與地塞米松組比較，△P<0.05。

組別空白組模型組地塞米松組治療組n 10 10 10 10 IL-4 26.79±1.20 37.90±1.23 31.84±1.97*32.78±2.01*IL-10 37.27±2.53 33.40±1.80 38.29±2.18*40.92±2.23*△TGF-β 32.93±1.65 27.96±2.12 31.86±2.85*31.85±2.86*

3 討論

CVA在中醫(yī)典籍中歸為“久咳”“頑咳”“風(fēng)咳”等范疇，主要病理因素是“伏風(fēng)”［6］。風(fēng)邪侵入人體后失治、誤治，或先天稟賦不足，以致“風(fēng)伏于肺絡(luò)”成為“伏風(fēng)”，再次感邪后引發(fā)伏風(fēng)，內(nèi)外合邪阻礙肺宣降功能以致患者咳嗽不止［7］。邪伏于內(nèi)，其氣必虛，故治療應(yīng)外散風(fēng)邪，內(nèi)補(bǔ)肺脾腎之氣以去除“伏于肺絡(luò)之風(fēng)”。伏九貼是本院名老中醫(yī)郭振武教授依據(jù)“冬病夏治”理論研制的治療咳喘病的有效方劑，具有溫補(bǔ)肺氣，止咳平喘的功效［8］。扶正固本湯中用黨參、山藥、山茱萸補(bǔ)脾、肺、腎之氣，以培本固元；佛手、茯苓調(diào)理氣機(jī)以防滋膩過甚；白芥子、半夏降逆化痰，蟬蛻疏散內(nèi)外風(fēng)邪，桔梗宣氣止咳，五味子收斂肺氣，炙甘草調(diào)和諸藥。諸藥共用具有補(bǔ)肺脾益腎、祛風(fēng)散邪、止咳平喘的功效。本研究結(jié)果提示扶正固本湯聯(lián)合伏九貼穴位貼敷能夠減少CVA模型大鼠咳嗽次數(shù)。

近年來研究認(rèn)為免疫學(xué)機(jī)制在CVA的發(fā)病過程中扮演重要角色。初始的T淋巴細(xì)胞在不同的微環(huán)境中分化成不同的亞群，各亞群處于動(dòng)態(tài)平衡中，維持機(jī)體正常的免疫功能。而Th2亞群的過度活化，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞亞群之間的平衡打破，致炎因子過度分泌被認(rèn)為是CVA發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制［9］。Th2在CVA中發(fā)揮的作用與其分泌的細(xì)胞因子IL-4密不可分［10］。IL-4是強(qiáng)大的致炎因子，在CVA患者早期就呈高表達(dá)狀態(tài)，并且IL-4的表達(dá)水平常常被作為判定CVA療效的細(xì)胞因子之一［11］。IL-4可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的分泌水平，使氣道內(nèi)聚集多種炎癥細(xì)胞，成為慢性氣道炎癥形成的源頭之一［12］。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是一種免疫抑制T細(xì)胞，能夠抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的表達(dá)，當(dāng)Treg的分化不足和出現(xiàn)功能缺陷時(shí)，過敏性疾病就會(huì)發(fā)生［13］。IL-10和TGF-β是由Treg細(xì)胞分泌的兩種標(biāo)志性因子［14］，IL-10能夠抑制各種炎性因子的分泌和自身的免疫應(yīng)答，在哮喘患者血清中表達(dá)水平顯著低于健康者，并與哮喘嚴(yán)重程度呈反比［15］。TGF-β在哮喘炎癥反應(yīng)中能抑制T淋巴細(xì)胞向Th2型轉(zhuǎn)化，還能通過增加轉(zhuǎn)錄因子FoxP3的表達(dá)促進(jìn)Treg的分化，間接抑制Th2免疫反應(yīng)，減少嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤［16］。CVA大鼠經(jīng)扶正固本湯聯(lián)合穴位貼敷或地塞米松治療后，與模型組比肺支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤程度減輕，肺泡灌洗液中炎性介質(zhì)下降，抗炎因子含量升高。因此，本實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為扶正固本湯聯(lián)合穴位貼敷能夠抑制IL-4的表達(dá)，并促進(jìn)IL-10、TGF-β的表達(dá)，減輕氣道炎癥，與糖皮質(zhì)激素作用相似。但其在促進(jìn)IL-10表達(dá)上更優(yōu)于糖皮質(zhì)激素，這提示扶正固本湯聯(lián)合穴位貼敷在治療CVA中可能更偏重于促進(jìn)抗炎因子的表達(dá)，這也正體現(xiàn)了扶正固本湯聯(lián)合穴位貼敷通過“扶正”達(dá)到“祛邪”目的的方義。

引發(fā)CVA的免疫機(jī)制非常復(fù)雜，經(jīng)典的Th1/Th2失衡無法完全解釋CVA的發(fā)病機(jī)制，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)CVA患者中存在Treg/Th2失衡。本實(shí)驗(yàn)研究通過扶正固本湯聯(lián)合穴位貼敷對(duì)Th2、Tregs效應(yīng)因子的研究初步推測(cè)扶正固本湯聯(lián)合穴位貼敷能夠糾正Th2/Tregs的失衡，但其具體的治療靶點(diǎn)將在今后的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。