魏 敏 宋旭艷 - 李 冉 肜 霖 董愛君 - 潘 曦

(湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430040)

羅漢果(Siraitiagrosvenorii)是葫蘆科苦瓜屬植物的果實。黃世杰等[1]分析了羅漢果浸膏的香味成分，主要有糠醛、糠醇、5-甲基糠醛、2,4-二羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃-3-酮、5-羥甲基糠醛和反式角鯊烯等。研究表明，酶促反應(yīng)[2]或者微生物發(fā)酵[3-6]可以改善天然香料質(zhì)量，而且反應(yīng)條件溫和、專一性強、對環(huán)境友好[7]。陳義坤等[8]利用食甲醇芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化山楂提取物，減少了其刺激性成分，提高了香氣質(zhì)；羅誠浩等[9]研究食甲醇芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化當歸提取物，新生成了丁酸、濃馥香蘭素、香蘭素、高香草醇等28種揮發(fā)性物質(zhì)，其香氣更豐富柔和；食甲醇芽孢桿菌還具有生物轉(zhuǎn)化阿魏酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的功能[10]。近年來，以丁香酚、異丁香酚和阿魏酸為底物的細菌、真菌生產(chǎn)香蘭素的研究逐漸變?yōu)檠芯繜狳c[11]。

從香莢蘭植株栽培土壤中篩選的產(chǎn)香菌——植生拉烏爾菌(RaoultellaplanticolaVP4-4)[12]，該菌株具有轉(zhuǎn)化阿魏酸生成天然香蘭素的功能和豐富的酶體系，能利用羅漢果提取物中的阿魏酸[13]、多糖、蛋白質(zhì)等進行生物轉(zhuǎn)化，生成香味物質(zhì)或香味前體物。試驗擬探究產(chǎn)香菌VP4-4生物轉(zhuǎn)化對羅漢果提取物揮發(fā)性成分的影響，以期為羅漢果增香提質(zhì)及開發(fā)利用方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

植生拉烏爾菌(RaoultellaplanticolaVP4-4)：CCTCC NO: M 2012005 2012.01.11，該菌從海南香莢蘭植株栽培土壤中分離得到，武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心；

麥芽汁、葡萄糖、瓊脂、麥芽糖、蛋白胨：BR級，北京三藥科技開發(fā)公司；

二氯甲烷、無水硫酸鈉、95%乙醇、鹽酸、氯化鈉：AR級，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

斜面培養(yǎng)基：麥芽汁125 mL，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L；

原始種子培養(yǎng)基：麥芽糖50 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L；

羅漢果果實：產(chǎn)地為神農(nóng)架。

1.1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱：SHP-080型，上海精宏試驗設(shè)備有限公司；

滅菌鍋：YX.350Z型，上海三申醫(yī)療器械有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇凈集團安泰公司；

數(shù)顯電熱恒溫干燥箱：DM101 A-1型，武漢鼎立烘箱爐業(yè)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-5IAA型，上海亞榮生化儀器廠；

循環(huán)式真空泵：SHZ-D型，鞏義市予華儀器有限公司；

電熱套：TWCL-T型，鞏義市予華儀器有限公司；

恒溫搖床：HQL 300B型，武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；

pH計：DELTA-320型，瑞士Mettler Toledo公司；

密度折光儀：DMA4500型，奧地利安東帕有限公司；

電子天平：ALC-210.2型，德國Sartorius公司；

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：TRACE GC Ultra-DSQⅡ型，美國Thermo Fisher公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 羅漢果發(fā)酵物及其提取物對照的制備

(1) 羅漢果發(fā)酵物的制備：用接種環(huán)挑取一環(huán)植生拉烏爾菌(RaoultellaplanticolaVP4-4)到裝有200 mL液體種子培養(yǎng)基的500 mL三角錐瓶中，35 ℃，120 r/min培養(yǎng)3 d，然后接種到斜面培養(yǎng)基(麥芽汁、葡萄糖、瓊脂)上，在恒溫培養(yǎng)箱中35 ℃靜置培養(yǎng)3 d，挑取一塊斜面菌種，接種到60 mL原始種子培養(yǎng)基(麥芽糖、蛋白胨、氯化鈉培養(yǎng)基)上，在35 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2 d，制得VP4-4種子培養(yǎng)液。

將羅漢果果實粉碎至40目粉末，取50 g粉末裝入圓底燒瓶中，加入25倍質(zhì)量水混合均勻，裝上冷凝管，電熱套加熱，冷凝回流提取5 h，抽濾，取濾液，115 ℃滅菌20 min，得到羅漢果提取液，作為發(fā)酵底物。將VP4-4種子培養(yǎng)液與羅漢果提取液按V種子培養(yǎng)液∶V提取液=1∶5接種，混合均勻，取混合液350 mL置于1 L三角錐瓶中，用0.01 mol/L的HCl溶液調(diào)整培養(yǎng)液pH為6.5，恒溫搖床設(shè)置溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速120 r/min，發(fā)酵72 h，抽濾濃縮得到浸膏，加入3倍質(zhì)量的體積分數(shù)95%乙醇進行醇沉，靜置過夜后抽濾，將濾液減壓濃縮，制得黃褐色浸膏，其相對密度為1.23，為植生拉烏爾菌發(fā)酵制備的羅漢果發(fā)酵物。

(2) 羅漢果提取物對照的制備：將羅漢果果實粉碎至40目粉末，取50 g裝入圓底燒瓶中并加入25倍質(zhì)量水混合均勻，裝上冷凝管，電熱套加熱，冷凝回流提取5 h，抽濾，將濾液抽濾濃縮為浸膏，然后加入3倍質(zhì)量的體積分數(shù)95%乙醇進行醇沉，靜置過夜、抽濾，將濾液減壓濃縮得到黃褐色浸膏，其相對密度為1.21，為羅漢果提取物對照。

1.2.2 揮發(fā)性成分分析

(1) 同時蒸餾萃取預(yù)處理：將植生拉烏爾菌VP4-4發(fā)酵的羅漢果發(fā)酵物和羅漢果提取物對照分別取5.0 g，裝入1 L圓底燒瓶中，加入400 mL水，用電熱套加熱至沸騰，另一側(cè)的圓底燒瓶中加入200 mL的二氯甲烷，60 ℃水浴沸騰，待中間分液管處液面出現(xiàn)分層后計時萃取5 h。萃取結(jié)束后，向二氯甲烷萃取液中加入無水硫酸鈉，過夜，過濾并減壓濃縮至1 mL，濃縮液用于進行GC-MS分析。

(2) 揮發(fā)性成分GC-MS分析：HP-5MS(50 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管柱；進樣溫度250 ℃；分流比20∶1；載氣為He，流速1 mL/min；升溫程序：從50 ℃(1 min)以5 ℃/min升到250 ℃(5 min)；傳輸線溫度250 ℃；EI離子源；電子能量70 eV；掃描范圍為50～400 amu；使用WILEY和MINILAB譜庫進行檢索，采用峰面積歸一化的方法分析，計算每一揮發(fā)性組分在產(chǎn)物中的相對百分比含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性化學(xué)組分分析

GC-MS總離子流譜圖見圖1。經(jīng)GC-MS分析，通過WILEY和MINILAB譜庫檢索，羅漢果發(fā)酵物及其提取物對照共分離鑒定出89種揮發(fā)性化學(xué)組分，結(jié)果見表1。

圖1 羅漢果發(fā)酵物和提取物GC-MS總離子流圖Figure 1 Total ion chromatogram of Siraitia grosvenorii fermentation and extract by GC-MS

表1 羅漢果發(fā)酵物及其對照的揮發(fā)性成分及含量?Table 1 Volatile components and contents of Siraitia grosvenorii fermentation and its control

續(xù)表1

續(xù)表1

由表2可知，羅漢果提取物的揮發(fā)性化學(xué)成分主要為酸類、酯類、羰基類、烷烴類、 醇類和酚類，相對含量分別為41.20%(6種)，38.07%(15種)，6.15%(13種)，2.81%(1種)，1.14%(5種)，0.54%(2種)。經(jīng)產(chǎn)香菌植生拉烏爾菌VP4-4生物轉(zhuǎn)化后的羅漢果發(fā)酵物的揮發(fā)性化學(xué)組分，主要為酸類、酯類、羰基類、烷烴類、醇類和酚類，相對含量分別為60.07%(11種)，30.72%(14種)，4.07%(21種)，0.81%(5種)，0.34%(4種)，0.29%(2種)。與生物轉(zhuǎn)化前相比，羅漢果發(fā)酵物的酸類物質(zhì)相對含量大幅增加，酯類、羰基類、烷烴類、醇類、酚類相對含量減少。

2.2 揮發(fā)性成分種類分析

2.2.1 酸類物質(zhì) 羅漢果發(fā)酵物揮發(fā)性成分中，酸類物質(zhì)含量占比最高，是羅漢果發(fā)酵物主要香氣成分或香味前體，對其風(fēng)味有重要貢獻。經(jīng)VP4-4生物轉(zhuǎn)化后的羅漢果發(fā)酵物揮發(fā)性成分中酸類物質(zhì)相對含量和種類變化較大，由6種增加到11種，相對含量由41.20%提高至60.07%。選取對羅漢果發(fā)酵物中幾種相對含量較高、對風(fēng)味影響較大的揮發(fā)性成分進行詳細分析：棕櫚酸(18.20%)、巖芹酸(17.04%)、十七烷酸(0.21%)，相對含量分別提高至19.67%，22.33%，0.30%；新增的揮發(fā)性成分有亞油酸(16.17%)、2-甲基丁酸(0.06%)、己酸(0.16%)和棕櫚油酸(0.76%)；相對含量降低的有肉豆蔻酸(從0.51%降至0.28%)和油酸(從0.83%降至0.21%)。有機酸在卷煙的加香加料過程中添加用以改善卷煙制品的吸味品質(zhì)[14]，長鏈脂肪酸如棕櫚酸、十七烷酸、亞油酸、肉豆蔻酸、油酸、棕櫚油酸等具有調(diào)節(jié)煙草酸堿度，增加煙氣濃度、甜味、蠟味和豐滿度的功效，并間接影響煙草香氣，在煙氣中起到平衡作用[15-16]；2-甲基丁酸可以增進水果、酒香和乳脂香味，添加到卷煙中使煙氣柔和滋潤，改善辛辣刺激[17]；己酸具有奶酪香氣[18]。

表2 羅漢果發(fā)酵物及其對照揮發(fā)性成分比例及種類數(shù)量

2.2.2 酯類物質(zhì) 羅漢果發(fā)酵物揮發(fā)性成分中酯類物質(zhì)共有14種，新產(chǎn)生了4種，消失了5種，6種含量減少，4種含量變化不明顯。鄰苯二甲酸二異丁酯(從8.15%降至5.33%)和鄰苯二甲酸二丁酯(從22.93%降至19.79%)作為大分子刺激性物質(zhì)相對含量減少，油酸乙酯(從4.59%降至2.50%)具有花香和果香[19]，亞油酸乙酯(從2.57%降至0.44%)具有降低血液中膽固醇和血脂的作用[20]，棕櫚酸乙酯(從4.86%降至0.40%)呈蜂蠟香、果香[21]，檸檬酸三丁酯(0.13%)有果香味，硬脂酸乙酯(0.09%)可增加卷煙煙氣的甜度，使煙香純正豐滿[22]。酯類物質(zhì)是由酸和醇在相關(guān)酶的催化下經(jīng)過酯化反應(yīng)生成的，主要呈果香和花香，對整個羅漢果發(fā)酵物香氣的結(jié)構(gòu)和特點產(chǎn)生重要影響。

2.2.3 羰基類物質(zhì) 羅漢果發(fā)酵物揮發(fā)性成分中羰基類物質(zhì)由13種變?yōu)?1種，總相對含量由6.15%減少至4.07%。主要羰基類香氣成分中4-羥基-4-甲基-2-戊酮(二丙酮醇，從2.81%降至0.85%)有愉快香氣，可能來自于加熱濃縮過程中的美拉德反應(yīng)[23]，苯乙醛(從0.16%降至0.74%)呈花香、玫瑰花香和蜂蜜香[24]，新產(chǎn)生的香氣成分為5-甲基糠醛(0.14%)，具有持久的焦糖和水果香味，可使香氣豐滿、柔和、清潤、協(xié)調(diào)、綿長[25]，苯甲醛(0.10%)有苦杏仁味[25]，壬醛(0.07%)具有柑橘香氣[26]，4-羥基-3-甲氧基-苯甲醛(香蘭素0.10%)具有香草及濃郁的奶香[27]，羅漢果原料中含有豐富的阿魏酸，經(jīng)VP4-4生物轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)生香蘭素。這些酮類、醛類物質(zhì)對其整體香氣起到了豐富花香、果甜香及奶香作用。

2.2.4 烷烴類、醇類和酚類物質(zhì) 烷烴類、醇類和酚類物質(zhì)相對含量在羅漢果發(fā)酵物揮發(fā)性成分中占比為1.44%，種類由8種增加為11種，其中糠醇(從0.18%降至0.09%)具有花香味[28]，同時醇類物質(zhì)也是酯類物質(zhì)的前體物；新產(chǎn)生的對乙烯基愈瘡木酚(0.08%)具有辛香、木香[29]，在發(fā)酵過程中阿魏酸發(fā)生非酶脫羧反應(yīng)得到，也是加熱氧化生成香草醛的前體物[30]。這些物質(zhì)相對含量較低，但也為羅漢果發(fā)酵物提供了花香及香味前體物等修飾作用。

3 結(jié)論

通過產(chǎn)香蘭素菌株植生拉烏爾菌RaoultellaplanticolaVP4-4菌株轉(zhuǎn)化阿魏酸生成天然香蘭素的功能和豐富的酶體系，對羅漢果提取物中的阿魏酸、多糖、蛋白質(zhì)等進行生物轉(zhuǎn)化、酯化反應(yīng)、結(jié)合加熱過程中的美拉德增香反應(yīng)，生成香味物質(zhì)或香味前體物，通過同時蒸餾萃取和GC-MS技術(shù)進行分離鑒定，研究產(chǎn)香菌生物轉(zhuǎn)化前后揮發(fā)性成分的變化。結(jié)果表明：經(jīng)產(chǎn)香菌VP4-4生物轉(zhuǎn)化后，羅漢果發(fā)酵物揮發(fā)性成分中化合物種類增多，由羅漢果提取物的50種增加為羅漢果發(fā)酵物的64種，其中新產(chǎn)生的揮發(fā)性成分有39種，酸類物質(zhì)含量大幅增加，酯類種類和占比含量稍減少，羰基類、烷烴類的化合物種類增多，占比含量減少；主要香氣成分或香氣前體物為棕櫚酸、巖芹酸、亞麻酸、2-甲基丁酸、己酸、油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、檸檬酸三丁酯、硬脂酸乙酯、4-羥基-4-甲基-2-戊酮、苯乙醛、5-甲基糠醛、苯甲醛、壬醛、糠醇、對乙烯基愈瘡木酚香蘭素等，這些揮發(fā)性組分協(xié)同作用，賦予了羅漢果發(fā)酵物花香、果甜香、奶香等豐富的天然香氣，減少了大分子刺激性成分的種類和相對含量，起到了增香減雜的作用，對羅漢果的生物產(chǎn)香和生物香料利用開發(fā)有一定的指導(dǎo)作用。但發(fā)酵香氣成分變化的機理仍需進一步研究。