呂文海，薛世斌，鄭濤

1.西安鳳城醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710000；2.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710000

星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，參與調(diào)控多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進(jìn)展[1]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)能夠激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，使其釋放大量的炎性因子毒害神經(jīng)細(xì)胞，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死，進(jìn)而引起一系列的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2]。而脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，能夠?qū)е滦切文z質(zhì)細(xì)胞炎癥損傷[3]。丹參川芎嗪是由丹參和川芎嗪構(gòu)成的復(fù)方制劑，兩者均具有神經(jīng)保護(hù)作用，臨床上常用于腦血栓的治療[4]。研究顯示，丹參川芎嗪可有效用于急性腦梗死的治療，還可抑制炎性反應(yīng)[5]。丹參川芎嗪聯(lián)合前列地爾對(duì)神經(jīng)功能缺損的改善作用顯著，且可改善患者的預(yù)后[6]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA與膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)相關(guān)[7]。研究報(bào)道，miR-214在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中具有促炎作用[8]。miR-214-3p可通過下調(diào)組織蛋白酶B(Cathepsin B，CTSB)的表達(dá)降低多巴胺能神經(jīng)元的活力[9]。然而miR-214-3p對(duì)炎癥因子的影響還尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過LPS刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞，旨在研究丹參川芎嗪對(duì)LPS引起星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放和神經(jīng)元凋亡的影響，及其是否通過調(diào)控miR-214-3p影響星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放和神經(jīng)元凋亡。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；丹參川芎嗪注射液購自貴州拜特制藥有限公司；脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、1%青霉素/鏈霉素購自美國Gibico公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA)購自美國ScienCell公司；二辛可寧酸(BCA)試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒購自上海碧云天公司；熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。miR-con、miR-214-3p、anti-miR-con、anti-miR-214-3p由上?；偕锟萍加邢薰緲?gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與分組 星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，用10μg/L的LPS處理HA1800細(xì)胞6 h作為LPS組，以正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照(NC)組；分別用5 mL/L、10 mL/L、20 mL/L丹參川芎嗪注射液(SML)處理24 h后再用10μg/L LPS處理3 h分別作為LPS+5 mL/L SML組、LPS+10 mL/L SML(LPS+SML)組、LPS+20 mL/L SML組；將miR-con、miR-214-3p轉(zhuǎn)染至HA1800中再用10μg/L LPS處理，分別記為LPS+miR-con組、LPS+miR-214-3p組；將anti-miR-con、anti-miR-214-3p轉(zhuǎn)染至HA1800中用10 ml/L丹參川芎嗪注射液處理24 h后再用10μg/L LPS處理3 h，分別記為LPS+SML+anti-miR-con組、LPS+SML+anti-miR-214-3p組。

1.2.2 MTT試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說明操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔吸光度(OD)值。以實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組OD值的比值作為細(xì)胞存活率(%)。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6水平 取各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h的上清液，然后嚴(yán)格按照試劑盒說明操作進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 Western Blot檢測(cè)裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)蛋白表達(dá)水平 提取細(xì)胞總蛋白，通過聚丙烯凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Cleaved-caspase-3的一抗4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育90 min，然后加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯影成像，最后分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集培養(yǎng)48 h細(xì)胞，漂洗后按試劑盒說明操作加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測(cè)miR-214-3p表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA后按試劑盒說明進(jìn)行PCR，以U6為內(nèi)參，用2-△△Ct法計(jì)算miR-214-3p的相對(duì)表達(dá)量。miR-214-3p上游引物序列：5'-CTATGTCCTCACCGAACGCAACC-3'，下游引物序列：5'-CAGCAGGCACAGACAGGC-3'；U6上游引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩兩間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度SML對(duì)LPS處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800活性的影響 與對(duì)照組比較，LPS組的細(xì)胞存活率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組比較，不同濃度SML和LPS共處理組的細(xì)胞存活率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度SML對(duì)LPS處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800活性的影響(±s，n=3)

表1 不同濃度SML對(duì)LPS處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800活性的影響(±s，n=3)

注：與NC比較，a P<0.05；與LPS比較，b P<0.05。

組別NC組LPS組LPS+5 ml/L SML組LPS+10 ml/L SML組LPS+20 ml/L SML組F值P值細(xì)胞存活率(%)100.00±10.10 151.26±15.10a 140.11±13.52b 125.02±12.01b 113.26±11.16b 24.130 0.000

2.2 SML對(duì)LPS處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800炎癥因子釋放和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，LPS組星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α和IL-6水平升高，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+SML組TNF-α和IL-6水平降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1和表2。

圖1 SML對(duì)LPS處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800炎癥因子釋放和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響

表2 SML對(duì)LPS處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800炎癥因子釋放和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=3)

表2 SML對(duì)LPS處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800炎癥因子釋放和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=3)

注：與NC比較，a P<0.05；與LPS比較，b P<0.05。

組別NC組LPS組LPS+SML組F值P值細(xì)胞凋亡率(%)8.01±0.80 28.63±2.88a 12.01±1.21b 310.462 0.000 TNF-α 1.00±0.10 2.35±0.24a 1.20±0.12b 174.787 0.000 IL-6 1.05±0.13 3.21±0.32a 1.42±0.14b 259.393 0.000 Cleaved-caspase-3 0.35±0.04 0.96±0.10a 0.48±0.05b 197.681 0.000

2.3 SML對(duì)miR-214-3p表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，LPS組的miR-214-3p表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LPS比較，LPS+SML組的miR-214-3p表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 SML對(duì)miR-214-3p表達(dá)的影響(±s，n=3)

表3 SML對(duì)miR-214-3p表達(dá)的影響(±s，n=3)

注：與NC比較，a P<0.05；與LPS比較，b P<0.05。

組別NC組LPS組LPS+SML組F值P值miR-214-3p 1.00±0.10 0.32±0.03a 0.92±0.09b 196.295 0.000

2.4 高表達(dá)miR-214-3p對(duì)LPS處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800炎癥因子釋放和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，LPS組的miR-214-3p表達(dá)水平降低，TNF-α和IL-6水平升高，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LPS+miR-con組相比，LPS+miR-214-3p組的miR-214-3p表達(dá)水平升高，TNF-α和IL-6水平降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2和表4。

表4 高表達(dá)miR-214-3p對(duì)LPS處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800炎癥因子釋放和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=3)

表4 高表達(dá)miR-214-3p對(duì)LPS處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800炎癥因子釋放和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=3)

注：與NC比較，a P<0.05；與LPS比較，b P<0.05。

組別NC組LPS組LPS+miR-con組LPS+miR-214-3p組F值P值TNF-α 1.00±0.11 2.42±0.24a 2.40±0.24 1.36±0.14b 128.896 0.000 miR-214-3p 1.00±0.13 0.35±0.04a 0.36±0.05 0.86±0.09b 140.402 0.000 Cleaved-caspase-3 0.35±0.04 0.95±0.10a 0.96±0.11 0.48±0.05b 137.450 0.000 IL-6 1.08±0.11 3.26±0.33a 3.31±0.33 1.42±0.15b 199.696 0.000細(xì)胞凋亡率8.15±0.82 26.38±2.65a 28.01±2.88 11.83±1.68b 193.993 0.000

圖2 Western Blot檢測(cè)Cleaved-caspase-3表達(dá)

2.5 低表達(dá)miR-214-3p可以逆轉(zhuǎn)SML對(duì)LPS處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800炎癥因子釋放和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響 與LPS組相比，LPS+SML組的miR-214-3p表達(dá)水平升高，TNF-α和IL-6水平降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LPS+SML+anti-miR-con組相比，LPS+SML+anti-miR-214-3p組的miR-214-3p表達(dá)水平降低，TNF-α和IL-6水平升高，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3和表5。

表5 低表達(dá)miR-214-3p可以逆轉(zhuǎn)SML對(duì)LPS處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800炎癥因子釋放和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=3)

表5 低表達(dá)miR-214-3p可以逆轉(zhuǎn)SML對(duì)LPS處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800炎癥因子釋放和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=3)

注：與NC比較，a P<0.05；與LPS比較，b P<0.05。

組別NC組LPS組LPS+miR-con組LPS+miR-214-3p組F值P值TNF-α 1.00±0.10 0.42±0.04a 0.40±0.05 0.89±0.10b 145.631 0.000 miR-214-3p 1.00±0.12 2.35±0.24a 2.40±0.25 1.35±0.14b 117.002 0.000 Cleaved-caspase-3 0.96±0.10 0.45±0.03a 0.46±0.04 0.85±0.09b 121.515 0.000 IL-6 1.05±0.12 0.35±0.04a 0.38±0.05 0.90±0.09b 173.143 0.000細(xì)胞凋亡率27.01±2.70 12.05±1.21a 12.11±1.25 23.31±2.43b 131.628 0.000

圖3 Western Blot檢測(cè)Cleaved-caspase-3表達(dá)

3 討論

以膠質(zhì)細(xì)胞激活為主要特征的炎癥反應(yīng)與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放有利于改善和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病[10-11]。有研究報(bào)道川芎嗪具有保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的功能[12]；丹參及其有效成分具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、改善腦缺血以及減輕腦梗死的作用[13]。有研究發(fā)現(xiàn)由丹參和川芎嗪構(gòu)成的丹參川芎嗪注射液能明顯降低急性顱腦損傷患者的TNF-α、IL-6、IL-8水平，對(duì)改善患者的臨床癥狀有良好療效，且安全性高[14]。丹參川芎嗪注射液還能抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，有效促進(jìn)患者的神經(jīng)功能、認(rèn)知功能能力[15]。丹參川芎嗪注射液可通過抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激等保護(hù)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷[16]。本實(shí)驗(yàn)用LPS處理星形膠質(zhì)細(xì)胞促使細(xì)胞凋亡和炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。丹參川芎嗪注射液預(yù)處理后，LPS作用的星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率降低，TNF-α和IL-6水平降低，細(xì)胞凋亡率降低；說明丹參川芎嗪注射液可抑制LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和炎性因子的釋放。

研究表明miRNA不僅參與細(xì)胞凋亡，還與炎癥反應(yīng)有關(guān)。有研究報(bào)道上調(diào)miR-214可抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[17]。miR-214可抑制異丙酚誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-214-3p表達(dá)下調(diào)。過表達(dá)miR-214-3p可降低TNF-α和IL-6水平，降低細(xì)胞凋亡率；說明過表達(dá)miR-214-3p可抑制LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和炎性因子的釋放。還有研究報(bào)道顯示，葛根素可通過上調(diào)miR-214減輕缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)干細(xì)胞損傷[19]。川芎嗪通過下調(diào)miR-214-3p減輕了受損脊髓的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹參川芎嗪注射液處理后，miR-214-3p表達(dá)水平升高；而抑制miR-214-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了丹參川芎嗪注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和炎性因子的抑制作用。表明丹參川芎嗪可能通過調(diào)控miR-214-3p的表達(dá)影響神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和炎性因子的釋放。

綜上所述，丹參川芎嗪可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800活性，抑制LPS引起的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和炎性因子TNF-α和IL-6的釋放。其機(jī)制可能與上調(diào)miR-214-3p的表達(dá)有關(guān)。