劉金梅, 黃冰心, 丁蘭平, 王雪聰, 閆璟, 閆盼竹, 張瑤

天津師范大學生命科學學院, 天津動植物抗性重點實驗室, 天津 300387

那嶼藻屬(新擬名)YonaguniaKawaguchi et Masuda 隸屬于紅藻門 Rhodophyta 海膜科Halymeniaceae, 于 2004 年建立, 因其模式種YonaguniatenuifoliaKawaguchi et Masuda 采集于琉球群島的與那國島(Yonaguni Island)而得名。該屬最初的報道包括模式物種Y. tenuifoliaKawaguchi et Masuda 和臺灣那嶼藻( 新擬名)Y.formosana(Okamura) Kawaguchi et Masuda 兩個物種。那嶼藻屬的藻體一般扁平, 二叉式分枝或不規(guī)則分枝, 藻體表面或邊緣偶有或具有許多小育枝, 藻體內(nèi)部結(jié)構(gòu)為多軸型, 具有緊密的皮層, 髓部由密集交錯的髓絲組成, 髓絲為縱向排列; 果孢枝枝叢和輔助細胞枝枝叢具有幾個簡單的次生生殖枝叢; 輔助細胞與連絡(luò)絲融合后, 輔助細胞枝叢的原始生殖枝叢和次生生殖枝叢的大部分細胞同時分裂, 每個細胞形成一簇小的球形細胞, 這些小球形細胞隨后形成總生殖枝叢; 果孢子由松散的總生殖枝叢包圍, 嵌在髓部; 四分孢子囊由皮層細胞產(chǎn)生, 嵌于皮層內(nèi),十字形分裂(Kawaguchi et al, 2004)。

至今, 那嶼藻屬已報道了8 個種:Y.atimo-vataeManghisi, M. Morabito, G.H.Boo, S. M. Boo et Le Gall;Y.formosana(Okamura) Kawaguchi et Masuda;Y.ligulata(Harvey ex Kützing) Manghisi, M.Morabito, De Clerck et Le Gall;Y.tenuifoliaKawaguchi et Masuda;Y.zollingeri(Sonder) G. H.Boo, J. K. Park, G. S.Gerung et S. M. Boo;Y.maillardii(Montagne et Millardet) Showe M. Lin, Y.C. Chuang et De Clerck;Y.palmataS. M. Lin, Y. C.Chuang et De Clerck;Y.taiwani-borealisShowe M.Lin, Y. C. Chuang et De Clerck(Guiry, 2020; Lin et al,2020)。其中,Y.formosana、Y. ligulata、Y.maillardii和Y.zollingeri是分別由鋸齒藻屬PrionitisJ.Agardh、海柏屬PolyopesJ.Agardh 和盾果藻屬CarpopeltisF.Schmitz 等屬轉(zhuǎn)入該屬的物種。該屬物種主要分布于熱帶至亞熱帶地區(qū), 但它們的地理分布范圍有所不同。有些物種分布較廣泛, 如Y.maillardii廣泛分布于印度洋—太平洋地區(qū)(Lin et al, 2020), 臺灣那嶼藻Y.formosana在我國臺灣地區(qū)(Kawaguchi et al, 2004)和海南省(丁蘭平 等, 2015)、日本(Titlyanov et al, 2016)、越南(van Nguyen et al,2013; Titlyanov et al, 2015)、馬來西亞(Kawaguchi et al, 2004)、菲律賓(Ang et al, 2014)以及太平洋中部的波利尼西亞(Tsuda et al, 2013)等地均有報道; 而有些物種的分布范圍比較窄, 如Y. atimo-vatae、Y.tenuifolia和Y.zollingeri分別僅在馬達加斯加、日本(Manghisi et al, 2015)和印度尼西亞(Boo et al, 2013)有報道,Y.ligulata在馬達加斯加和斯里蘭卡有報道(Manghisi et al, 2015),Y. palmata和Y.taiwani-borealis僅在我國臺灣地區(qū)(Lin et al, 2020)等地有報道。根據(jù)分子進化分析, 該屬起源于始新世—漸新世, 物種多樣性則主要集中在中新世(Lin et al, 2020)。

我國對那嶼藻屬的研究較少, 之前僅臺灣那嶼藻Y.formosana在我國臺灣地區(qū)和海南省有報道,今年又增加了3 個種, 即Y.maillardii、Y. palmata和Y.taiwani-borealis(Lin et al, 2020), 但目前國際數(shù)據(jù)庫中僅記錄了來自越南和馬來西亞的臺灣那嶼藻的分子數(shù)據(jù)(Kawaguchi et al, 2004), 而我國尚無對應的DNA 序列可供參考。因此, 我國那嶼藻屬在分子方面的研究對于補充該屬物種的基因多樣性具有一定意義。此外, 那嶼藻屬是一個較新的屬, 對其了解較少, 該屬大部分物種的地理分布范圍還有待研究?；诖? 本文主要對采集于海南省三亞市大東海和瓊海市博鰲地區(qū)的臺灣那嶼藻進行形態(tài)學研究, 生成了相應的rbcL 序列, 并結(jié)合已知的那嶼藻屬物種進行了系統(tǒng)發(fā)育分析, 為認知和豐富那嶼藻屬的多樣性提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品分別于2016 年12 月和2018 年4 月采集于海南省三亞市大東海和瓊海市博鰲地區(qū)。樣品處理分為三份, 即液浸標本(用濃度為4%的海水-福爾馬林溶液浸泡, 主要用于形態(tài)學研究)、臘葉標本(用作憑證標本和形態(tài)學研究)和干燥樣品(用于分子生物學的研究), 這三者的保存編號相同, 標本存放于天津師范大學生命科學學院藻類實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 形態(tài)學研究

觀察藻體的大體外觀、色澤、質(zhì)地、藻體主軸、分枝情況等(體式顯微鏡Nikon SMZ25); 再利用冷凍切片技術(shù)(生物冷凍切片機 LEICA CM 1860 UV)對樣品的特征部位進行切片, 顯微鏡下觀察藻體皮層細胞大小和層數(shù)、髓部細胞大小和排列情況、四分孢子囊著生位置和大小以及囊果的著生位置等(正置熒光顯微鏡LEICA DM5000 B); 最后對以上的各部分特征進行觀察、數(shù)據(jù)測量及拍照。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育學研究

1.3.1 DNA 樣品處理

選取干燥樣品進行DNA 提取, 通過選取引物rbcL(F-993 和R-rbcS start)(Freshwater et al, 1994)對所提取的DNA 進行PCR 擴增, 反應體系為25μL,包括12.5μL mix, 10μmol·L-1正向引物1μL, 反向引物1μL, ddH2O 9.5μL, 模板1μL。擴增程序: 95℃預變性4min, 94℃變性1min, 45℃退火2min, 72℃延伸3min, 35 個循環(huán), 72℃終延伸5min。PCR 產(chǎn)物檢測采取1%的瓊脂糖凝膠電泳, 后將產(chǎn)物送至金唯智公司進行純化及測序。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理

選取蜈蚣藻Grateloupia filicina和Carpopeltis phyllophora作為外群, 在Genbank 中下載相關(guān)那嶼藻屬物種以及外群物種的 DNA 序列, 使用MEGA7.0 軟件進行多序列比對(Clustal W), 遺傳距離的分析, 以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建, Bootstrap 重復1000 次, 其中最大似然樹的最適模型為T92+G, 最大簡約樹的方法選擇TBR。

2 研究結(jié)果

2.1 形態(tài)學

臺灣那嶼藻Yonaguniaformosana(Okamura)Kawaguchi et Masuda

基名:CarpopeltisformosanaOkamura

同型異名:Prionitis formosan(Okamura)Kawaguchi et Nguyen

生境: 著生于潮間帶中部巖石上。

特征描述: 藻體直立, 叢生, 暗紫紅色, 偶有藍灰色, 硬軟骨質(zhì)。藻體扁壓, 高2.8～8.5cm, 基部具有盤狀固著器; 二叉式分枝或不規(guī)則分枝(圖1a、b), 枝端形狀多樣(圖1c—g), 卵形或長圓形; 藻體表面和邊緣具有許多小育枝(圖1h、i), 約0.5～3mm。藻體干燥后變硬, 制成的臘葉標本不能附著于紙上。藻體內(nèi)部構(gòu)造由皮層和髓部組成(圖1j); 藻體橫切面皮層厚約16～83.5μm, 由3～9 層小的橢圓形細胞組成(圖1k、l); 髓部厚約260～475μm, 由豐富的縱向錯綜的髓絲組成(圖1n), 髓絲直徑5～14μm(圖1m)。

四分孢子囊著生于皮層內(nèi)(圖1p), 長卵形, 寬約7～9.4μm, 長約19～25.6μm, 十字形分裂或?qū)Π敕至?圖1q、r)。囊果著生于最末小枝或小育枝枝端, 微突。囊果切面觀, 位于髓部間, 呈球形或近球形; 果孢子囊為近圓形或不規(guī)則卵形, 周圍具有不育絲組成的囊果被(圖1s、t)。未見精子囊結(jié)構(gòu)。

圖1 臺灣那嶼藻的形態(tài)和結(jié)構(gòu)a—b. 藻體外觀; c—g.枝端形狀; h—i. 藻體小育枝(邊緣、表面); j. 藻體部分橫切面; k—l. 皮層細胞; m. 髓部橫切面; n. 髓部縱切面;o. 小育枝縱切面; p—r. 四分孢子囊; s—t. 果孢子Fig. 1 Yonagunia formosana: a-b. habit sketch of the frond; c-g. upper portion of the branchlets; h-i. proliferations (edge,surface); j. transection of part of a frond; k-l. cortical cells; m. transection of medulla; n. longitudinal section of medulla; o.longitudinal section of proliferations; p-r. tetrasporangia; s-t. carpospores

模式產(chǎn)地: 中國臺灣地區(qū)蘭島(Orchid Island);

標本采集地: 中國海南省三亞市大東海和瓊海市博鰲

國外分布: 越南、馬來西亞、菲律賓、日本;

國內(nèi)分布: 海南省、臺灣地區(qū)

研究編號: 161203005A(三亞)、201804180 09(博鰲)、180418009N(博鰲)

2.2 基于rbcL 序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

用于構(gòu)建rbcL 最大似然樹的序列共28 條, 其中25 條來自GenBank(23 條為那嶼藻屬序列, 2 條為外群), 3 條為新生成的序列, 序列的最終比對長度為335bp, 其中, 那嶼藻屬序列間相似度為93.41%,保守位點為300bp, 可變位點為35bp, 簡約信息位點為34bp。基于ML 法(Maximum Likelihood)、MP法(Maximum parsimony)和NJ 法(Neighbor-joining)分別構(gòu)建了該屬rbcL 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹, 鑒于這三種方法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結(jié)構(gòu)大致一樣,因此本文選擇了ML 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖2),其中節(jié)點上的數(shù)值表示為自展支持值, 從左到右或從上到下依次為ML、MP、NJ。結(jié)果顯示, 目前可參考的那嶼藻屬物種構(gòu)成了 6 個進化支(Y.maillardii、Y.palmata和Y.taiwani-borealis尚無可參考的序列), 其中本研究序列161203005A(三亞)、180418009N(博鰲)和2018041 8009(博鰲)與越南和馬來西亞的Y.formosana聚為一支, ML、MP 和NJ 的自展支持值為100%、99%和100%, 堿基差異為0, 遺傳距離為0, 表明采集于海南省三亞市大東海和瓊海市博鰲地區(qū)的樣品與Y.formosana為同一物種;Y.formosana進化支與馬達加斯加島和斯里蘭卡的Y.ligulata構(gòu)成的進化支互為姐妹分支, 堿基差異為8bp; 來自日本的Y.tenuifolia以及來自馬達加斯加島的Y. antimo-vatae分別進化為一個分支, 堿基差異為19bp; 而來自印度尼西亞的Y.zolligeri與Vranken(來自比利時根特大學, 采集于海洋水族館, 具體位置未知)鑒定的Y.zolligeri序列(LT969680、LT969695)分別單獨進化為一個分支, 堿基差異為5bp。

圖2 基于rbcL 序列構(gòu)建的最大似然樹Fig. 2 Maximum likelihood tree constructed based on rbcL sequence

3 討論

海膜科是由Bory 于1828 年建立的一個科, 目前總共報道了 38 個屬。該科曾被歸為隱絲藻科Cryptonemiaceae 和蜈蚣藻科Grateloupiaceae(夏邦美,2004), 但根據(jù)命名規(guī)則, Guiry(1978)將海膜科修訂為有效名稱。由于該科物種的形態(tài)變化較大, 關(guān)于該科完整的分類系統(tǒng)還未建立, 因此海膜科也被認為是最難分類的科之一(米偉男 等, 2009)。海膜科中的大多數(shù)屬以輔助細胞生殖枝叢的結(jié)構(gòu)特征進行區(qū)分, 包括了 5 個類型的輔助細胞生殖枝叢, 即Aeodes型、Cryptonemia型、Grateloupia型、Halymenia型和Thamnoclonium型(Chiang, 1970;Kawaguchi et al, 2002, 2004)。其中,Grateloupia型為該科內(nèi)最簡單的輔助細胞生殖枝叢類型, 屬于該類型的有Dermocorynus、Grateloupia、Kintokiocolax、Phyllymenia和Zymurgia等5 個屬。在 Kawaguchi 等(2004)對那嶼藻屬輔助細胞生殖枝叢開展研究后, 也將其歸入到Grateloupia型中,并根據(jù)其特有的輔助細胞生殖枝叢發(fā)育方式以及基于rbcL 的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果, 將其命名為新屬。目前, 那嶼藻屬在分類學上已被分類學者所接受(Boo et al, 2013; Manghisi et al, 2015; Lin et al,2020)。

本文的研究樣品(161203005A、180418009N、20180418009)符合那嶼藻屬物種的特征(Kawaguchi et al, 2004)。在形態(tài)上, 這3 個樣品的藻體均扁平,表面和邊緣著生有許多小育枝, 這與該屬內(nèi)的Y.formosana和Y. ligulata比較相似, 然而這三者的大部分測量數(shù)據(jù)與Y.formosana和Y. ligulata存在一定的差異, 但總體來說與Y.formosana比較接近(表1)。從地理分布范圍看,Y.formosana主要報道于太平洋地區(qū)(我國臺灣地區(qū)和海南省, 以及日本、越南、馬來西亞、菲律賓和波利尼西亞), 而Y.ligulata則主要報道于印度洋地區(qū)(馬達加斯加、 斯里蘭卡)?；趓bcL 序列的系統(tǒng)發(fā)育分析, 樣品161203005A(三亞)、180418009N(博鰲)和20180418009(博鰲)與越南和馬來西亞的Y.formosana聚為一支, 且基于不同方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的自展支持值均較高。因此,結(jié)合形態(tài)學、地理分布以及分子序列的分析結(jié)果,采集于海南省的這3 個那嶼藻屬樣品可鑒定為臺灣那嶼藻Yonaguniaformosana。

表1 臺灣那嶼藻、Y. ligulata 和樣品的比較Tab. 1 Comparison of Y. formosana, Y. ligulata and the sample

臺灣那嶼藻最早被命名為Carpopeltis formosana(Okamura, 1931), Kawaguchi 等(1998)將其轉(zhuǎn)移至鋸齒藻屬Prionitis中, 命名為Prionitis formosana; Kawaguchi 等(2004)又因建立那嶼藻屬Yonagunia而將P.formosana修訂為Y.formosana。目前Y.formosana的命名在分類學上得到確認。但由于上述拉丁種名以及近些年來國際屬種名稱的快速變化, 在一定程度上導致了其中文名稱的使用問題。在我國, 該種的中文名稱分別出現(xiàn)過如下變化:臺灣盾果藻Carpopeltisformosana(黃淑芳, 2000)、臺灣鋸齒藻Prionitisformosana(夏邦美, 2004)、臺灣盾果藻Carpopeltisformosana和臺灣鋸齒藻Prionitisformosana(曾呈奎 等, 2005)、臺灣鋸齒藻Yonaguniaformosana(丁蘭平 等, 2015)。根據(jù)我們的文獻記錄, 到2014 年, 鋸齒藻屬Prionitis因物種轉(zhuǎn)出等原因而沒有確定的記錄物種, 可被視為廢棄的或同物異名屬, 因此我們在2015 年繼續(xù)采用了鋸齒藻屬和臺灣鋸齒藻為Yonagunia和Y.formosana的中文名。然而, 近年來, 原Prionitis中的一些物種又得到確認, 導致該屬廢而又立, 其中文屬名“鋸齒藻屬”應該繼續(xù)保留。近年的一篇文獻又將Yonagunia的中文名稱命名為“與那國藻屬”(趙樹雨, 2016)。然而, 有評閱人認為“與那國藻屬”不太符合中文的取名式樣。因此本文結(jié)合評閱人的建議, 將Yonagunia和Y.formosana的中文名稱分別修改為那嶼藻屬和臺灣那嶼藻。

臺灣那嶼藻Y.formosana的模式產(chǎn)地為中國臺灣, Lin 等(2020)對中國臺灣地區(qū)的Y.formosana進行了分子系統(tǒng)發(fā)育研究, 但其分子序列在數(shù)據(jù)庫中尚不可查閱。其與本文分子序列是否存在差異還有待探討。海南省東南部地區(qū)的Y.formosana與目前國內(nèi)外所報道的Y.formosana在形態(tài)上比較相似,但本文樣品的枝端形狀比文獻報道的更加多樣化,藻體主要特征(分枝形式、小育枝、藻體皮層等)的大小也與Kawaguchi 等(2004)所報道的存在一定的差異, 是否為形態(tài)多樣化仍有待研究。

4 結(jié)論

本研究通過對2016—2018 年采集于海南省東南部地區(qū)的那嶼藻屬的種類樣本的形態(tài)學研究, 并結(jié)合rbcL 序列的系統(tǒng)發(fā)育分析, 共鑒定臺灣那嶼藻一個物種, 研究結(jié)果對那嶼藻屬的分類學研究具有一定的參考意義, 豐富了那嶼藻屬種類分布的地域信息, 也豐富了我國沿海大型藻類的物種多樣性。