劉宏韜，周 黎綜述，何 松，周智航審校

0 引 言

大腸癌(colorectal cancer，CRC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及死亡率逐年上升。據(jù)估算，2018 年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)約為184.95 萬例，位居腫瘤發(fā)病率第3位，死亡例數(shù)為88.08 萬例，位居腫瘤死亡率第2位[1]。目前大腸癌的篩查仍依賴于敏感性和特異性均不高的大便隱血及癌胚抗原(cancer embryonic antigen, CEA)等。此外，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是大腸癌治療失敗的主要原因，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。與獲取腫瘤組織樣本相比，通過患者血液樣本來檢測CTC更加容易，并可反復(fù)采集，是臨床上較為理想的標(biāo)本來源。研究表明，CTCs可應(yīng)用于大腸癌的預(yù)后、治療反應(yīng)以及腫瘤復(fù)發(fā)的檢測等重要環(huán)節(jié)，具有巨大的臨床應(yīng)用前景。需要注意的是，目前最常用的檢測CTC的方法是基于EpCAM等標(biāo)志物，存在檢出率較低、無法反映腫瘤異質(zhì)性等問題，亟需更加高效、便捷的檢測方法。本文結(jié)合近來國內(nèi)外研究進(jìn)展，對大腸癌CTC相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行綜述。

1 CTC的檢測技術(shù)

近年來全球已經(jīng)開發(fā)了大量的技術(shù)來檢測特定的CTC，但是由于這些細(xì)胞在血流中具有極端的異質(zhì)性和罕見性，所以CTC的檢測技術(shù)仍然具有挑戰(zhàn)性，需要有更高靈敏度和特異性的方法來鑒定。CTC的檢測方法可以基于其生物學(xué)特性(即細(xì)胞表面標(biāo)記物)或物理特性(即大小、密度、電荷)，通常會(huì)與檢測技術(shù)(如免疫熒光、免疫組化、FISH)相結(jié)合來檢測CTC[3]。CTC檢測的原理是依賴于分離腫瘤細(xì)胞中的正性富集或去除白細(xì)胞的負(fù)性富集?；诩?xì)胞表面標(biāo)志物的方法中，最經(jīng)典的是CellSearch系統(tǒng)，它是目前唯一被美國FDA批準(zhǔn)的檢測CTC的技術(shù)。 CellSearch系統(tǒng)通過EpCAM(上皮細(xì)胞黏附分子)包被的免疫磁珠在全血中捕獲CTC，然后使用抗細(xì)胞角蛋白(CK 8、CK 18、CK 19)、抗CD45(白細(xì)胞標(biāo)記物)和核染色(DAPI)進(jìn)行熒光檢測[4-8]。但這類方法還是遺漏了發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化或丟失EpCAM的細(xì)胞。

所以現(xiàn)在正在研究通過腫瘤細(xì)胞的物理特性來克服這種偏差。例如RosetteSep技術(shù)，去除血液中的白細(xì)胞后，在Ficoll-Paque PLUS密度梯度離心中分離得到CTC。ISET、ScreenCell以及我國的CanPatrol方法能夠使用微孔聚碳酸酯過濾器檢測CTC[9-10]，但是可能出現(xiàn)細(xì)胞堵塞等情況。近年來，基于微流控分離CTC成為新的熱點(diǎn)。微流控系統(tǒng)能夠根據(jù)細(xì)胞的大小、彈性等物理特性分離CTC，能夠有效反映CTC異質(zhì)性。例如CTC-iChip，它使用微流體去除紅細(xì)胞后，用EpCAM偶聯(lián)的微球正向富集CTC或用CD45抗體包被的微球負(fù)向富集CTC[11]。還有一些技術(shù)整合了多種方法，比如，DEPArray結(jié)合了微流系統(tǒng)和圖像分析系統(tǒng)選擇CTC[12-14]。上述每種方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和局限性，而研究人員則可以根據(jù)CTC表型研究的具體目的，來確定CTC的捕獲方法。

2 CTC的診斷價(jià)值

CTC能在病程早期進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。在CRC診斷過程中，通常需要檢測非特異性血清標(biāo)志物(CEA等)、內(nèi)鏡檢查和腹盆腔CT掃描。而這些非特異性血清腫瘤標(biāo)志物，如CEA、CA19-9和CA72-4，已被認(rèn)為是CRC患者診斷、預(yù)后、監(jiān)測復(fù)發(fā)和指導(dǎo)治療的候選生物標(biāo)志物[15]。在HAIJIAO YU的一項(xiàng)研究中，對59例CRC患者檢測上述3種血清腫瘤標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)CEA的診斷靈敏度最高(50.85%)，其次是CA72-4(28.81%)和CA19-9(23.73%)[16]。然而CTC的診斷靈敏度為83.05%，顯著高于各種傳統(tǒng)血清腫瘤標(biāo)志物和組合。聯(lián)合CTC和這3種生物標(biāo)志物時(shí)敏感性達(dá)到93.22%。其中CTC+CEA組合的敏感性(91.53%)僅略低于4種標(biāo)志物的聯(lián)合敏感性，結(jié)果表明CTC+CEA可能是CRC診斷和預(yù)后的血清腫瘤標(biāo)志物的有效組合。此外，作者觀察到腫瘤分期與CTC和腫瘤標(biāo)志物檢出率之間的相關(guān)性。作者在34.38%的Ⅰ～Ⅱ期CRC患者、53.33%的Ⅲ期患者和91.67%的Ⅳ期患者中檢出CTC，這些比率在所有病理分期均高于CA19-9和CA72-4的比例。此外，與正常個(gè)體相比，有78.13%的I-II期患者、86.67%的III期患者和91.67%的IV期的CRC患者觀察到CTC水平升高(≥2個(gè)/3.2 mL),這與癌癥不同分期的診斷敏感性升高相對應(yīng)。再者，聯(lián)合CTCs和CEA時(shí)，Ⅰ～Ⅱ期患者檢出率達(dá)到84.38%。

與其他生物標(biāo)志物例如ctDNA和外泌體相比，CTCs的診斷價(jià)值更有優(yōu)勢。首先，循環(huán)腫瘤細(xì)胞是從腫瘤中逃逸出來的具有活性的細(xì)胞，因此檢測其中突變，能夠大大降低人體細(xì)胞突變的背景噪音。其次，由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞在癌癥早期階段即存在，因此研究循環(huán)腫瘤細(xì)胞能夠更為有效的實(shí)現(xiàn)癌癥的早篩。最后，目前大量的研究證明循環(huán)腫瘤細(xì)胞是癌癥轉(zhuǎn)移的罪魁禍?zhǔn)?，識別循環(huán)腫瘤細(xì)胞上的標(biāo)靶進(jìn)行靶向治療，不僅能夠?qū)υ话?shí)現(xiàn)治療，也能大大減少癌癥轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。以上表明，CTCs是一種相對較好的疾病指標(biāo)，可用于CRC的早期診斷并判斷腫瘤分期，臨床上可將CTCs與 CEA相結(jié)合來提高特異性。

3 CTC與大腸癌預(yù)后的關(guān)系

由于剪切應(yīng)力和免疫監(jiān)視等生物和物理限制，絕大多數(shù)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞群都會(huì)死亡，小部分存活的CTCs(0.01%)卻能夠獲得成瘤能力[17-18]，形成轉(zhuǎn)移灶并重建腫瘤異質(zhì)性[19]。研究表明，CTCs對非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性CRC預(yù)后的評估均有很高的價(jià)值。在非轉(zhuǎn)移性CRC中，CTCs的存在可以預(yù)測患者未來的轉(zhuǎn)移和較差的疾病結(jié)局。在轉(zhuǎn)移性CRC(metastatic colorectal cancer,mCRC)患者樣本中鑒定出CTC可能表明轉(zhuǎn)移病灶轉(zhuǎn)移的重新播散[20]。臨床數(shù)據(jù)表明，約20%(I期和II期)和30%(III期)的CRC患者在根治性手術(shù)后的5年內(nèi)復(fù)發(fā)[21]。這些觀察結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞發(fā)生了術(shù)前或術(shù)中播散，隨后導(dǎo)致轉(zhuǎn)移形成[22]。非轉(zhuǎn)移性CRC患者血液中CTCs的存在可作為已經(jīng)存在的微轉(zhuǎn)移的替代標(biāo)志物，這些CTC具有較高的預(yù)后價(jià)值[23-24]。在CRC中使用CellSearh識別CTCs的研究表明，每7.5毫升血液中CTCs > 5的CRC患者預(yù)后更差，一年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)高8倍[25]。另一項(xiàng)使用CellSearh系統(tǒng)的前瞻性研究，每7.5毫升血液中CTCs > 1的CRC患者預(yù)后更差[26]。最近的一項(xiàng)Meta分析(包括20項(xiàng)研究和超過3100例患者[27])證明,CTCs是CRC的一種有價(jià)值的預(yù)后因素。值得注意的是，Rahbari等[20]研究表明，在伴有肝轉(zhuǎn)移的mCRC患者肝靜脈血中CTC比外周靜脈血中多。CTC陽性的mCRC患者(CTC > 3/7.5 mL血液)預(yù)后更差，無進(jìn)展生存期顯著降低，與非轉(zhuǎn)移性CRC的結(jié)果相似[28]。以上結(jié)果表明，CTC是一種預(yù)測CRC進(jìn)展和不良預(yù)后的有效手段，監(jiān)測治療前后CTC有助于預(yù)測預(yù)后，判斷術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)性。

4 CTC與大腸癌治療反應(yīng)的關(guān)系

CTC不僅作為診斷和預(yù)后標(biāo)志物，還可用作治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。Huang等[29]報(bào)道的一項(xiàng)Meta分析,發(fā)現(xiàn)CTC可用作預(yù)測CRC患者化療反應(yīng)的新型標(biāo)志物。在mCRC的臨床前試驗(yàn)中，CTC也可用作患者治療反應(yīng)的預(yù)測標(biāo)志物[30]。現(xiàn)在臨床上大多數(shù)CRC患者以5-氟尿嘧啶為基礎(chǔ)進(jìn)行化療。如果腫瘤為RAS野生型，則在這些方案中常規(guī)添加靶向藥物，如帕尼單抗和西妥昔單抗。然而，大多數(shù)腫瘤治療后會(huì)產(chǎn)生耐藥性。因此，轉(zhuǎn)移性CRC的治療決策取決于患者是否存在耐藥。據(jù)推測，與單獨(dú)的放射學(xué)監(jiān)測相比，CTC檢測可能會(huì)增加檢測靈敏度及早期檢測出治療耐藥性。一項(xiàng)研究表明，在III期CRC患者中輔助mFOLFOX后，CTC 持續(xù)陽性是一個(gè)不良預(yù)后因素[31]。綜上所述，CTC可用于評估治療反應(yīng)。值得注意的是，CTCs在治療過程中EpCam 和細(xì)胞角蛋白等上皮標(biāo)記物會(huì)下調(diào)，來逃避檢測。通過CellSearch系統(tǒng)檢測，發(fā)現(xiàn)在接受貝伐珠單抗治療的IV期乳腺癌患者中CTCs顯著下降，實(shí)際上這些患者出現(xiàn)了疾病進(jìn)展[32]。

5 結(jié) 語

近年的研究使CTCs在CRC患者中的臨床應(yīng)用取得了重大進(jìn)展，現(xiàn)在可應(yīng)用于CRC的預(yù)后、治療反應(yīng)以及腫瘤復(fù)發(fā)的檢測等重要環(huán)節(jié)，CTCs作為液體活檢的一種形式，在促進(jìn)CRC患者實(shí)施精準(zhǔn)醫(yī)療方面具有巨大的潛力[33]。如今CTC已被FDA批準(zhǔn)用于CRC患者的疾病監(jiān)測和預(yù)后判斷。然而，CTCs檢測仍然面臨著重大挑戰(zhàn)。①檢測過程中需要克服CTC的罕見性和異質(zhì)性。CTC檢測方法眾多，每種方法都有自己的樣本制備、富集和分析的方案，但是仍無法完全克服這個(gè)問題。②大多數(shù)研究是小型、單中心、病例對照研究，患者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)差異很大，這使得驗(yàn)證研究非常困難。③目前的大多數(shù)研究結(jié)果均是基于CellSearch系統(tǒng)，如上所述，該系統(tǒng)檢出率低，可能漏掉了間質(zhì)型或不表達(dá)EpCAM的細(xì)胞。因此我們還是需要去研發(fā)一種具有高靈敏度和高特異性的標(biāo)準(zhǔn)化檢測方案，用來捕獲全部的CTCs。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行更大樣本量的多中心、前瞻性研究明確CTC在大腸癌診療中的價(jià)值。此外，我們還需要通過測序、體外培養(yǎng)等方法明確CTC的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)特性，為開發(fā)新的診斷及治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。