張 瑞， 蘇敬博， 張 健， 耿智敏

（西安交通大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西 西安 710061）

膽道惡性腫瘤(biliary tract carcinoma,BTC)是起源于膽管及膽囊的惡性腫瘤總稱。根據(jù)其解剖位置分為肝內膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA)、肝外膽管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma,eCCA)和膽囊癌 (gallbladder cancer,GBC)三類，其中eCCA又包括肝門部膽管癌(perihilar cholangiocarcinoma,pCCA)和遠端膽管癌(distal cholangiocarcinoma,dCCA)。BTC約占所有消化系統(tǒng)腫瘤的3%[1-2]。近年，BTC在全球發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢，以亞洲國家最為顯著[3-5]。由于起病隱匿，侵襲性強，BTC對常規(guī)放、化療不敏感，導致其預后極差，5年生存率僅5%～23%[6-8]。目前BTC常用的分期體系是美國癌癥聯(lián)合委員會 (American Joint Committee on Cancer，AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC) 聯(lián)合發(fā)布的第8版TNM分期系統(tǒng)。該分期全面評估腫瘤局部浸潤深度、腫瘤大小、淋巴結轉移及遠處轉移等臨床病理特征。盡管TNM分期有助于判斷病人的預后和轉歸，但由于BTC的高度異質性，對于同一分期的病人，其預后也存在很大差異。因此，目前的TNM分期不能滿足精準診斷和治療的需求，亟需新的分型體系助力BTC的診治[9]。

腫瘤分型是基于其生長模式和微觀特征，從形態(tài)學特征、生物學行為和分子機制對腫瘤進行分類。目前的分型方式主要包括臨床分型和分子分型。兩種分型分別依據(jù)腫瘤宏觀和微觀層面特征進行分類。腫瘤分型對于術前評估可切除性、制定治療方案、評估預后及指導術后輔助治療發(fā)揮著至關重要的作用。

近年來，對于腫瘤分子生物學機制的研究如火如荼，相關的基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等研究不斷深入，推動腫瘤從形態(tài)學分型逐漸向分子分型轉化。隨著國內、外臨床多中心研究的開展和高通量測序技術的不斷發(fā)展，對BTC的生物學特征和分子機制的認識亦不斷深入。筆者結合國內、外臨床和基礎研究進展，系統(tǒng)闡述BTC的臨床分型和分子分型，以期為BTC臨床精準診治提供思路與參考。

BTC的臨床分型

BTC存在多種臨床分型，其中AJCC制定的第8版TNM分期被廣泛應用于臨床實踐中。但該分期存在一定局限性，如未考慮GBC原發(fā)部位和生長侵犯方向，一些指標必須等待術中或術后病理診斷，無法在術前進行有效評估及指導治療方式。因此，亟需引入臨床分型系統(tǒng)聯(lián)合TNM分期來評估腫瘤的可切除性、指導臨床決策和評估病人預后。

BTC臨床分型應用較多的是pCCA。在pCCA的臨床分型中，較為經典的有Bismuth-Corlette分型(B-C分型)[10]和MSKCC T分期[11]。B-C分型是以腫瘤發(fā)生的解剖部位及在膽管內生長受累范圍為依據(jù)，將pCCA分為4型，為手術方式的選擇與設計提供重要參考。但該分型未涉及血管浸潤、淋巴結轉移和肝臟萎縮等影響預后的關鍵因素，對腫瘤可切除性的判斷不準確，對預后預測價值有限。1998年，紀念斯隆-凱特琳癌癥中心提出Jarnagin-Blumgart分型[11]。該分型依據(jù)術前影像學特征，將門靜脈受累和肝葉萎縮納入分型標準中，主要用于術前評估腫瘤的可切除性。2011年，國際膽管癌協(xié)會針對pCCA提出新的分期體系。該體系在綜合B-C分型、TNM分期和MSKCC T分期的基礎上，納入剩余肝體積、肝臟基礎疾病等因素，用于評估肝切除的安全性，指導手術方式的選擇[12]。該分期系統(tǒng)是目前pCCA最全面的評估方式，但其指標內容復雜，所以臨床實用性不強。還有基于病理學特征的分期系統(tǒng)，如日本膽道外科學會(Japanese Society of Biliary Surgery，JSBS)分期和Gazzaniga分期系統(tǒng)等。JSBS分期標準與TNM分期類似，但由于其分期標準復雜，限制了臨床應用[13]。Gazzaniga分期系統(tǒng)在B-C分型的基礎上，根據(jù)血管及膽管侵犯的程度進行分期，用于指導手術方案的制定，但尚需大樣本臨床資料驗證，其實用價值有待進一步驗證[14]。

日本學者依據(jù)iCCA的腫瘤生長模式將其分為3型：①導管內生長型，其表現(xiàn)為管腔內呈息肉狀或乳頭狀生長，較為少見；②導管周圍浸潤型，即腫瘤沿著膽管或周圍血管(如門靜脈)蔓延生長；③腫塊型，其表現(xiàn)為肝實質中質硬腫塊，該型最多見[15-16]。此3種分型可單獨出現(xiàn)，也可同時出現(xiàn)。有研究表明該臨床分型與TNM分期密切相關，有助于指導治療和判斷預后[17]。

GBC目前沒有確定的臨床分型。中華醫(yī)學會外科學分會膽道外科學組根據(jù)GBC腫瘤起源部位及侵犯方向，建議分為腹腔型、肝臟型、肝門型和混合型。初步研究發(fā)現(xiàn)該4種分型與TNM分期、惡性生物學行為及預后存在明顯相關性，對術前評估、手術方案制定及預后評估具有一定指導意義[18]。針對GBC臨床分型的一項前瞻性多中心研究目前正在進行，期待最終結果為GBC的臨床分型提供循證醫(yī)學證據(jù)。

準確的臨床分型，一方面有助于評估腫瘤的可切除性，指導合理選擇手術方式；另一方面可指導輔助治療方案的選擇和評估預后轉歸。近年來隨著國際和國內多中心臨床研究的開展，BTC臨床分型有望出現(xiàn)高級別循證醫(yī)學證據(jù)。研究者通過大樣本、高質量、廣維度、多層次的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)更精準的臨床分型，從而指導臨床治療。

BTC的分子分型

BTC因其解剖位置、組織學形態(tài)和生物學行為的差異，存在顯著的腫瘤異質性。甚至同一病理類型、同一臨床分期的病人，其預后及治療應答效果存在很大差異。因此亟需新的分型方法，準確地反映腫瘤在發(fā)生、發(fā)展各個階段的生物學特征，并準確預測其生物學行為，指導臨床實踐。分子分型是依據(jù)分子特征對腫瘤進行分類，部分腫瘤(乳腺癌和結腸癌)的相關研究已取得重大突破，為BTC分子分型提供可借鑒的模板。分子分型不僅可以了解腫瘤的發(fā)生機制，準確地評估預后，還可以指導研發(fā)新型靶向藥物，實現(xiàn)腫瘤的精準化和個體化治療。近年，隨著對腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制的研究日益深入，以及新一代的組學技術飛速發(fā)展，BTC的分子分型有望成為可能。

一、基于基因組學的分子分型

以第二代測序為代表的測序技術發(fā)展，為全面描繪BTC基因突變圖譜提供有力工具，也極大地推動BTC分子生物學機制的研究。BTC發(fā)生、發(fā)展過程中存在多種突變類型，如腫瘤蛋白53(tumor protein 53,TP53)、富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的結構域1A/B、張力蛋白同源第10染色體丟失的磷酸酶基因失活突變，以及異檸檬酸脫氫酶1/2(isocitric acid dehydrogenase 1/2,IDH1/2)、鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)、鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1基因和磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α的功能增益突變[19]。已有多項研究證實，膽道系統(tǒng)中不同解剖部位腫瘤的基因突變譜存在明顯差異，為BTC的分子分型奠定一定的理論基礎[20-21]。Javle等[22]通過研究BTC(包括85例GBC、57例eCCA和412例iCCA)基因突變模式，評估基因突變與臨床特征間的相關性，發(fā)現(xiàn)TP53和KRAS突變的病人生存率較低，而成纖維生長因子受體2(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)融合的iCCA病人預后較好。這些結果提示依據(jù)基因突變類型對病人進行分子分型具有可行性。最近MSKIMPACT NGS平臺運用410個基因的panel對BTC進行測序，進一步驗證先前Javle的研究結果[22]，發(fā)現(xiàn)近一半病人具有潛在治療意義的突變位點。此項前瞻性研究為BTC的分子分型奠定了基礎，并證實通過分子分型來指導晚期BTC病人的靶向治療具有良好的發(fā)展前景。Nepal等[23]研究分析了496例iCCA的基因組數(shù)據(jù)，根據(jù)3個高頻突變基因(IDH、KRAS、TP53)的突變狀況對病人進行分層，發(fā)現(xiàn)每個亞組具有獨特的突變特征、共突變譜、富集通路和化療藥物敏感程度。該研究揭示單個基因突變誘導大量下游分子異質性的潛力，同時該分子分型有助于預測iCCA的治療敏感性。這些基于基因組的分子分型初步揭示BTC的分子特征，具有潛在的臨床指導意義。

二、基于轉錄組學的分子分型

轉錄組數(shù)據(jù)以轉錄序列為核心，彌補基因組由于數(shù)據(jù)量過大而完整信息對生物性質指導意義過小的缺點，可進一步提高研究的實用價值。根據(jù)腫瘤基因表達譜的差異實施分型，是目前分子分型研究的主體，如今已廣泛用于乳腺癌[24]、肝癌[25]、結腸直腸癌[26]和胰腺癌[27]的分子分型。在2013年，Sia等[28]根據(jù)表達差異將iCCA分為炎癥型和增殖型，兩組具有不同的激活基因和臨床特征。這種分組的可靠性在后續(xù)研究中也得到驗證[29]。此種分型有助于判斷病人預后，為BTC提供潛在的治療靶點。Ahn等[30]通過對iCCA的轉錄組和相應臨床病理信息整合分析，將病人分為A和B兩個亞類。A亞類(預后較好)具有豐富的肝臟相關特征，包含IDH1突變、FGFR2融合，且對吉西他濱敏感。B亞類(預后差)有豐富的炎癥相關通路，且TP53、KRAS突變頻率更高。該研究闡明分子分型與臨床特征的相關性，并評估不同分子亞型對于化療藥物的敏感性。一項國際多中心研究將eCCA分為4種亞型[31]，分別為代謝型(19%)、增殖型(23%)、間充質型(47%)和免疫型(11%)。代謝型主要表現(xiàn)為肝細胞表型，具有轉錄因子HNF4A和與膽汁酸代謝相關富集通路基因的激活。增殖型在dCCA中更常見，其特征是骨髓細胞瘤病毒癌基因 (myelocytomatosis viral oncogene,MYC)靶標豐富，人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)突變/擴增和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號激活。間充質型表現(xiàn)為上皮-間質轉化，同時存在異常的轉化生長因子 β (transforming growth factor-β,TGF-β) 信號轉導，該類型病人預后較差。免疫型具有更多的淋巴細胞浸潤，并伴有細胞程序性死亡受體1/細胞程序性死亡受體-配體1的過表達，提示此類病人對免疫治療敏感。該分子分型初步確定eCCA的不同分子亞類，為免疫治療決策和新型靶向藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

三、基于蛋白質組學的分子分型

蛋白質組學可用于識別和量化腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮功能的蛋白質，有助于探索腫瘤生物學行為及癌變發(fā)生機制。在BTC中，腫瘤衍生蛋白質可通過腫瘤細胞的壞死和凋亡釋放到膽汁中，在癌變過程中實時提供有用信息。已有多項研究通過鑒定膽汁中的蛋白質組成分，挖掘出潛在的生物標志物，給基于蛋白質組學的分子分型提供重要依據(jù)[32-33]。除此之外，Darby等[34]應用熒光凝膠電泳和串聯(lián)質譜相結合的方法，比較BTC組織和癌旁組織的蛋白質組信息，發(fā)現(xiàn)約138種蛋白質的表達存在差異。這類差異蛋白質表達分型將有助于指導病人靶向治療。類似的研究還有許多。Yu等[35]通過挖掘蛋白質組學信息，發(fā)現(xiàn)丙糖磷酸異構酶1(triose-phosphate isomerase 1,TPI1)表達水平與iCCA復發(fā)率顯著相關，并據(jù)此建立相關列線圖預測模型，可準確預測iCCA切除后的復發(fā)。Chang等[36]研究分析iCCA病人血漿中5 320種蛋白質含量，最后確定25個候選生物標志物。該研究揭示在不同腫瘤發(fā)展階段的蛋白質組表達模式，并篩選出更有效的血清標志物，對于預測腫瘤復發(fā)和病人生存具有一定的臨床價值。盡管目前并沒有蛋白質組學系統(tǒng)用于BTC分型，但隨著蛋白質組學研究的不斷深入，基于蛋白質組學的BTC分子分型也將展示出良好的診斷及治療指導作用。

四、基于代謝組學的分子分型

膽道系統(tǒng)與膽汁的生成及排泄密切相關，在脂肪代謝、膽汁酸代謝和電解質代謝等過程中發(fā)揮關鍵作用。BTC病人常伴有梗阻性黃疸，出現(xiàn)腸肝循環(huán)的紊亂，以及不同程度的代謝功能紊亂。因此，對BTC病人癌組織、血清及膽汁進行代謝組學分析有助于BTC的診斷和預后評估。西班牙學者應用質譜和超高效液相色譜對惡性膽道狹窄病人的膽汁進行代謝組學研究[37]，同時利用神經網絡算法確定了由10種脂質和5種蛋白質組成的檢測組合，并以此來鑒別良性與惡性膽道狹窄。Liang等[38]綜合分析BTC病人與正常人血樣中的血清代謝物，鑒定出75種代謝物含量在兩類人群中存在明顯差異。與正常人組相比，BTC病人的21脫氧皮質醇和膽紅素水平顯著增加，而溶血磷脂酰膽堿水平顯著降低。該研究團隊還發(fā)現(xiàn)這3種代謝物水平不僅可辨別BTC，還可區(qū)分eCCA和iCCA。盡管基于代謝組學的鑒別診斷具有高準確性，但由于腫瘤相關代謝物種類繁雜，且代謝物檢測的成本高，基于代謝組學的分型尚處于起步階段，需進一步研究證實。

五、基于腫瘤微環(huán)境的分子分型

腫瘤微環(huán)境 (tumor microenvironment，TME)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關。近年，免疫檢測點抑制劑作為實體腫瘤的一線或二線治療方案，改變了傳統(tǒng)癌癥治療策略。但免疫療法在BTC的應用仍存在很多難題，如腫瘤異質性大、免疫應答率較低和缺乏有效的療效評價指標等[39]。因此，依據(jù)TME免疫特征對BTC分型有助于指導免疫治療決策。可通過分子分型篩選出免疫治療敏感型的病人，使這類病人從免疫治療中獲益。Job等[40]定量分析566例iCCA的TME中免疫細胞群體，根據(jù)免疫反應和信號特征 (肝臟活性、炎癥和免疫抵抗)，將iCCA分為4種免疫亞型：①免疫沙漠型；②免疫原性型，其特征是大量先天性和適應性免疫細胞，以及激活的炎癥和免疫檢測點途徑；③富含髓樣蛋白型，以單核細胞衍生的髓樣蛋白高表達為特征；④間充質型。其中免疫原性型病人作為潛在的免疫治療敏感人群，有望從免疫抑制劑治療中獲益。腫瘤免疫浸潤細胞在BTC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，對于預測腫瘤轉移有一定的臨床實用價值。有學者證明晚期局部進展型BTC病人腫瘤組織中CD8+淋巴細胞、CD4+淋巴細胞、巨噬細胞和肥大細胞的浸潤明顯多于遠處轉移型病人[41]。該研究提示，對微環(huán)境中免疫細胞的分析有助于判斷腫瘤的進展情況。

六、基于多組學聯(lián)合的整合聚類

早期的聚類為單一聚類，其僅依靠基因組或轉錄組進行分型，而多組學聯(lián)合分析能全面地闡釋腫瘤分子特征。2015年，Nakamura等[21]對全外顯子和轉錄組數(shù)據(jù)進行無監(jiān)督聚類分析，將BTC分為4種亞型：1型 (大多數(shù)為eCCA)，主要特征是RAS和MAPK激活信號顯著下調；2型存在高頻率突變基因包括 TP53和KRAS；3型存在高頻率的 BAP1、IDH1、NRAS突變和FGFR2融合；4型表現(xiàn)為大量的高頻率突變腫瘤特異性抗原，免疫系統(tǒng)成分表達明顯升高，預后最差，提示4型病人為免疫治療的潛在人群。近期一項國際多中心研究分析GBC整合基因組、表觀遺傳組、轉錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與生存相關的3種分子亞型[42]。其中2型預后相對較好，1型和3型預后較差。這兩種預后較差的亞型與不良的臨床病理特征、免疫抑制微環(huán)境(髓源性抑制細胞積聚和廣泛的結締組織增生、缺氧)和T細胞功能障礙相關。該研究提示1型和3型病人有望從免疫治療中獲益。對于免疫耐受的2型病人，則推薦使用MAPK或TGF-β靶向藥物。這項研究表明，TME的特征在GBC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，對其突變特征進行評估，有利于預后判斷和指導靶向治療。Jusakul等[43]對來自10個國家的489例BTC的全基因組、靶向/外顯子組、拷貝數(shù)、轉錄組和DNA甲基化數(shù)據(jù)進行分析，綜合聚類將其分為4種亞型：①具有啟動子CpG島的甲基化，ARID1A和乳腺癌易感基因突變的富集以及高水平的非同義突變；②表現(xiàn)出β連接蛋白1、Wnt家族成員 5B(Wnt family member 5B，Wnt5B)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT serine/threonine kinase 1，AKT1)表達上調；③表現(xiàn)出與免疫檢測點抑制和T細胞信號轉導相關途徑的基因特異性上調；④存在IDH1/2突變，F(xiàn)GFR2融合和乳腺癌易感基因相關蛋白質1突變。值得注意的是，前兩類主要由eCCA組成；后兩類則由吸蟲非相關iCCA組成。在臨床上，與1、2型病人相比，3、4型病人的預后更好。該項研究確定了新的驅動基因、非編碼啟動子突變和結構變異?；谡暇垲惖姆肿觼喰筒粌H指出不同亞型之間的分子生物學差異，還提供不同亞型病人潛在的治療靶點信息，有助于實現(xiàn)精準治療。

結 語

目前腫瘤的治療模式，正向著規(guī)范化、個體化的循證醫(yī)學方向發(fā)展。新的分型體系不僅與臨床病理信息緊密結合，而且反映分子水平變化。精準的BTC分型不僅有助于指導手術方案的選擇，還可輔助預后轉歸的判斷，將極大加深臨床醫(yī)師對腫瘤生物學本質的理解，以便制定精準化、個體化的治療策略。目前關于BTC的臨床分型和分子分型暫無完全成熟的標準，不同分型方案各有側重。隨著高通量測序和醫(yī)學人工智能等技術的飛速發(fā)展，BTC的分型必將越來越接近腫瘤生物學特征的本質，從而準確地指導診斷與治療，最終提高病人生存率。相信在不遠的將來，基于臨床分型和分子分型，更安全、有效的BTC個體化精準治療模式將會越來越多地應用于臨床。