陳曉昊， 鄧益斌

1 廣西肝膽疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 廣西 百色 533000； 2 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗科， 廣西 百色 533000

肝細(xì)胞癌(以下簡稱肝癌)是世界范圍內(nèi)腫瘤致死的主要原因之一。根據(jù)《中國腫瘤登記年報》的數(shù)據(jù)，肝癌是我國第五大常見的癌癥，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)性死亡的第二大疾病。肝癌的發(fā)生是一個多步驟過程的結(jié)果，涉及多個基因表達(dá)譜和細(xì)胞內(nèi)信號通路改變，但其確切的發(fā)病機制尚不清楚[1]。盡管最近幾年在肝癌的臨床診斷和治療方面有了進展，但肝癌患者的總生存時間并未得到有效改善，其5年生存率仍然很低。這主要是由于手術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率高和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，不斷深入研究肝癌的詳細(xì)發(fā)病機制，尋找早期分子診斷標(biāo)志物，確定新的治療靶點對于預(yù)防和治療有重要意義，也是當(dāng)前肝癌領(lǐng)域研究熱點。

近年來，隨著二代測序技術(shù)的進一步發(fā)展和對腫瘤發(fā)病機制的深入研究，大量文獻(xiàn)報道了非編碼RNA參與腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)假說也在2011年被Salmena等[2]首次提出。ceRNA假說展現(xiàn)了一種RNA間互作的全新機制，是一種全新的基因表達(dá)調(diào)控模式，與微小RNA(miRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相比，ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更加精細(xì)和復(fù)雜，涉及了更多RNA分子，為科研人員提供了一個全新進行轉(zhuǎn)錄組研究的視角，有助于更全面、更深入地解釋一些生物學(xué)現(xiàn)象。本文綜述ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在肝癌中的研究進展。

1 ceRNA及其調(diào)控機制概述

1.1 ceRNA ceRNA不是一類全新的RNA分子，而是可以與其他RNA分子競爭性結(jié)合miRNA的一大類RNA的統(tǒng)稱。其主要包括，人工miRNA海綿(artificial miRNA sponges)、假基因(pseudogene RNAs)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA) 和信使RNA(mRNA)[3]。

1.2 ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制概述 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點是miRNA。miRNA是一類長度在19～25個核苷酸長度的非編碼RNA，在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中其主要作用是將miRNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合物引導(dǎo)至miRNA響應(yīng)元件，進而抑制翻譯過程或使mRNA降解從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。簡言之，miRNA可以通過結(jié)合mRNA使基因沉默，而ceRNA，包括lncRNA和circRNA等，可以通過競爭性地結(jié)合miRNA來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA響應(yīng)元件一般位于mRNA和非蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本(如假基因和lncRNA)的3′非翻譯區(qū)(UTR)，編碼序列和5′UTR上。由于一個miRNA具有許多RNA靶標(biāo)，而絕大多數(shù)RNA分子又帶有多個miRNA響應(yīng)元件，因此通過作用于不同的miRNA響應(yīng)元件，一個miRNA可以靶向調(diào)節(jié)成百上千個靶基因；同樣的，一個蛋白靶基因可以受到多個miRNA同時調(diào)控[4]。正是由于這種廣泛存在的靶標(biāo)多樣性，ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)假說在2011年被正式提出，即具有共享miRNA結(jié)合位點的非編碼轉(zhuǎn)錄本與mRNA競爭結(jié)合相關(guān)miRNA，進而轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)[5]。

2 ceRNA與肝癌

現(xiàn)有研究表明，多種RNA作為ceRNA參與肝癌增殖、轉(zhuǎn)移侵襲、血管生成等多種生物學(xué)活動。本文將從ceRNA分類的角度，綜述各類ceRNA在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的功能。

2.1 mRNA作為ceRNA在肝癌中的作用 mRNA是編碼基因轉(zhuǎn)錄加工的中間產(chǎn)物，由于多個mRNA可含有同種miRNA響應(yīng)元件，則有同種miRNA結(jié)合位點的mRNA間可以通過競爭性結(jié)合到miRNA而互為ceRNA。CD151作為一種已知的致癌蛋白，可參與多種癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的轉(zhuǎn)移、侵襲和腫瘤新生血管形成。此外，CD151在肝癌的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，其mRNA的3′UTR中含有miRNA響應(yīng)元件，受到腫瘤抑制性miR-124調(diào)控。PIK3C2 mRNA和LAMC1 mRNA可通過螯合miR-124促進CD151的表達(dá)，發(fā)揮ceRNA作用[6-7]。此外，F(xiàn)as是受到深入研究的可引起細(xì)胞凋亡的膜受體。Zhang等[8]研究報道了STARD13 mRNA可通過競爭性結(jié)合miR-340、miR-448、miR-374、miR-203、let-7、miR-216b、miR-316、miR-23、miR-153，作為Fas的ceRNA促進肝癌凋亡。

2.2 lncRNA作為ceRNA在肝癌中的作用 lncRNA是長度超過200個核苷酸的非編碼RNA家族，有大量文獻(xiàn)報道其在人類各種疾病中具有重要作用。在肝癌相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中，lncRNA作為ceRNA的研究最多，lncRNA與肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，其作為ceRNA參與了肝癌發(fā)生發(fā)展的多種生物學(xué)過程[9]。

Lnc-SNHGs是長鏈非編碼小核RNA宿主基因家族，在多種癌癥中異常表達(dá)并發(fā)揮重要作用[10]。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)了lncRNA SNHG3作為ceRNA參與 miR-128調(diào)控CD151基因在肝癌中的分子作用。他們首先通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)miR-128為SNHG3的潛在靶點且其在CD151的3′UTR中有一個結(jié)合位點，并利用熒光素酶實驗進一步驗證miR-128可以抑制CD151基因的熒光素酶活性。最終研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG3通過與miR-128競爭性結(jié)合來抑制CD151 mRNA的降解，上調(diào) CD151 靶基因表達(dá)，參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。除SNHG3外，SNHG1、SNHG5、SNHG8、SNHG12等均與不同分子構(gòu)成ceRNA網(wǎng)絡(luò)參與到肝癌的發(fā)生發(fā)展過程[12-15]。

Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA TP73-AS1在肝癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，而其表達(dá)量降低時可抑制肝癌細(xì)胞的增殖以及HMGB1、RAGE和NF-κB的表達(dá)水平。HMGB1是參與調(diào)控細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因子。既往研究[17]表明，利用HMGB1 DNA增強內(nèi)源性HMGB1的表達(dá)，可增強肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。HMGB1在肝癌細(xì)胞系中激活RAGE信號通路，誘導(dǎo)NF-κB激活，促進細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。敲除TP73-AS1后，miR-200a的表達(dá)量升高，且miR-200a可以負(fù)調(diào)控肝癌細(xì)胞系中HMGB1、RAGE和NF-κB的表達(dá)，對肝臟起到保護作用。由此可見，lncRNA TP73-AS1通過與miR-200a相互作用調(diào)節(jié)HMGB1/RAGE來促進肝癌細(xì)胞的增殖。LncRNA TP73-AS1可能是調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵分子，并可以為肝癌的治療提供潛在的治療靶點。

YWHAZ是許多信號通路的中心樞紐蛋白，主要參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附和蛋白招募等生物學(xué)過程，在包括肝癌在內(nèi)的許多惡性腫瘤中起著癌基因的作用[18-19]。LncRNA MIR4435-2HG(即lncRNA-AWPPH，MIR4435-1HG，LINC00978，MORRBID和AGD2)可作為不同分子的ceRNA參與到結(jié)直腸癌、三陰性乳腺癌、骨肉瘤、肺癌、胃癌的產(chǎn)生和發(fā)展[20-24]。而近年來又發(fā)現(xiàn)MIR4435-2HG在肝癌中也可以發(fā)揮重要作用，其含有miR-22-3p的結(jié)合位點，可以通過使miR-22-3p海綿化而消除miR-22-3p對YWHAZ的作用，從而促進YWHAZ的表達(dá)。即MIR4435-2HG通過調(diào)節(jié)miR-22-3p/YWHAZ途徑在肝癌中發(fā)揮其促增殖和促轉(zhuǎn)移作用[25]。因此，MIR4435-2HG可作為肝癌新的特殊預(yù)后標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

lncRNA-miRNA-mRNA不僅通過形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)調(diào)控靶基因及下游信號通路，lncRNA亦可直接和蛋白質(zhì)相互作用而發(fā)揮作用，如，其在轉(zhuǎn)錄水平可通過影響特定轉(zhuǎn)錄因子及聚合酶活性調(diào)節(jié)mRNA的生成；也可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控mRNA，包括剪接、加工、轉(zhuǎn)運、翻譯以及降解等過程。lncRNA在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)，表明其在基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。

目前，lncRNA與肝癌的相關(guān)研究較多，且大多數(shù)已經(jīng)過實驗證實，但如何將其更好的應(yīng)用于臨床，作為肝癌治療及預(yù)后的指標(biāo)仍有待進一步探究。

2.3 circRNA作為ceRNA在肝癌中的作用 circRNA是一類具有共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA,通常以套索循環(huán)或反向間隔的方式由mRNA的外顯子衍生而來[26]。circRNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，一些circRNA含有miRNA響應(yīng)元件，提示circRNA可能作為ceRNA競爭miRNA結(jié)合位點，影響miRNA的活性，從而發(fā)揮“海綿” 作用，進而參與一系列生物學(xué)過程[27]。越來越多的研究[28-29]表明，circRNA可通過競爭性結(jié)合miRNA調(diào)控靶基因和下游信號通路，參與到多種腫瘤的發(fā)生和進展。

Kong等[30]在肝癌發(fā)展機制的研究中發(fā)現(xiàn)，circRNA CircUGGT2含有miR-526b-5p的結(jié)合位點，可阻斷miR-526b-5p與RAB1A的3′UTR結(jié)合。RAB1A是Rab癌基因家族成員之一，是多種惡性腫瘤的致癌基因，其編碼產(chǎn)物介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體轉(zhuǎn)運系統(tǒng)之間的動態(tài)膜運輸。這一轉(zhuǎn)運系統(tǒng)涉及各種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，包括調(diào)控細(xì)胞生長、脂質(zhì)代謝和自噬。此外，有報道[31]稱RAB1A在肝癌中可以促進癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miR-526b-5p的過表達(dá)下調(diào)了肝癌細(xì)胞中RAB1A的水平，從而抑制肝癌的發(fā)展。當(dāng)過表達(dá)circUGGT2時，則可以拮抗miR-526b-5p的這種抗腫瘤效應(yīng)。該研究表明，circUGGT2在肝癌中起著致癌作用。通過調(diào)節(jié)miR-526b-5p/RAB1A軸，circUGGT2的下調(diào)可以抑制肝癌的發(fā)展，這表明circUGGT2可能是治療肝癌的潛在靶標(biāo)。

DAB2IP蛋白是一種GTP酶激活蛋白，可介導(dǎo)多種腫瘤相關(guān)信號通路, 如RAS-RAF-MAPK通路、PI3K/AKT通路等，在多種類型的癌癥中均顯著下調(diào)，其在肝癌中表達(dá)降低多預(yù)示著預(yù)后不良。DAB2IP在體外和體內(nèi)均具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的能力，是一種相當(dāng)理想的抗癌治療靶點。Liu等[32]關(guān)于人肝癌發(fā)病機理的研究提示，circRNA-5692與靶向DAB2IP mRNA的miR-328-5p相互作用，即circRNA-5692充當(dāng)ceRNA來抑制致癌的miR-328-5p發(fā)揮作用，以增強腫瘤抑制物DAB2IP的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞的惡性行為，同時抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。Hippo信號通路在正常細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用，YAPS是Hippo信號通路的主要效應(yīng)因子，在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。Zhang等[33]發(fā)現(xiàn)circ_104075作為ceRNA通過吸收miR-582-3p上調(diào)YAP表達(dá)，從而刺激肝癌的發(fā)生發(fā)展，進一步證明了circRNA作為ceRNA在肝癌細(xì)胞中的關(guān)鍵作用。

這些研究均表明circRNA可作為ceRNA在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。而與其他非編碼RNA相比，circRNA由于其共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的存在，不易被RNA外切酶所降解，并能穩(wěn)定存在于體液中。因此，circRNA是一種應(yīng)用前景良好的肝癌診斷標(biāo)志物。

2.4 假基因作為ceRNA在肝癌中的作用 假基因是古代蛋白質(zhì)編碼基因的殘體，在進化過程中失去了編碼能力。人類基因組中有超過14 000個假基因，假基因雖然廣泛存在，但曾被認(rèn)為是基因組的垃圾或遺跡，直到最近幾年才引起生物學(xué)家的足夠重視。隨著高通量實驗技術(shù)的廣泛應(yīng)用，越來越多的證據(jù)表明一些假基因具有特定的功能，包括調(diào)控親代基因的表達(dá)和參與調(diào)控多種生物學(xué)過程[34]。

有充分的研究證實假基因可以在人體內(nèi)發(fā)揮ceRNA效應(yīng)。RACGAP1基因在多種癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá),與腫瘤的預(yù)后不良和侵襲性高度相關(guān)。Wang等[35]揭示了假基因RACGAP1P 3′UTR中有一個miR-15a-5p結(jié)合位點，其可作為靶基因RACGAP1的ceRNA競爭結(jié)合miR-15a-5p，以拮抗miR-15a-5p對內(nèi)源性靶蛋白RACGAP1的抑制作用，同時RhoA/ERK通路被激活，從而促進肝癌的惡性表型。這些發(fā)現(xiàn)為RACGAP1P在肝癌腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用提供了強有力的證據(jù)。絲氨酸蛋白激酶BUB1可通過形成復(fù)合物的形式參與到其他重要周期蛋白的調(diào)控，進而影響整個細(xì)胞周期的進程，其在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并與預(yù)后不良高度相關(guān)[36]。有研究人員[37]發(fā)現(xiàn)假基因DUXAP8在腫瘤樣本中表達(dá)上調(diào)，并在肝癌中作為一種致癌基因。Zhang等[38]進一步實驗證實敲除DUXAP8可顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。該研究表明在肝癌中，假基因DUXAP8作為miR-490-5p的海綿，促進BUB1的表達(dá)，調(diào)控肝癌的增殖。另有研究[39]顯示INTS6通過作用于Wnt/β-catenin通路，在肝癌中可作為抑癌基因參與腫瘤的生物進程, 其可參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的侵襲、增殖能力等。發(fā)現(xiàn)假基因INTS6P1在肝癌中被顯著下調(diào)，提示INTS6P1可作為一種新型的肝癌生物標(biāo)志物。進一步研究發(fā)現(xiàn)它通過與miR-17-5p競爭性結(jié)合其同源基因INTS6發(fā)揮重要的腫瘤抑制作用。miR-17-5p靶向INTS6，拮抗其腫瘤抑制作用并提高了肝癌細(xì)胞的致癌活性。INTS6P1的上調(diào)充當(dāng)miR-17-5p的海綿分子，并誘導(dǎo)肝癌組織的生長停滯和肝癌細(xì)胞的死亡。

目前關(guān)于lncRNA-miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)在肝癌中機制的研究很多。然而，較少有研究或報道肝癌中的假基因-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，因此假基因在肝癌發(fā)病機制，特別是肝癌早期復(fù)發(fā)中的作用仍不完全清楚。

3 小結(jié)與展望

本文回顧了一種可在肝癌發(fā)病機理中發(fā)揮重要作用的機制——ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在正常條件下，由于ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的微妙平衡，可以維持復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)。一旦打破這種平衡，各種非編碼和編碼RNA之間就會出現(xiàn)競爭，將細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橹掳顟B(tài)。但也正是這種ceRNA調(diào)控機制為癌癥的治療提供了更多選擇：通過表達(dá)所需的ceRNA或通過病毒載體敲除相應(yīng)miRNA來恢復(fù)細(xì)胞平衡的ceRNA治療擁有廣闊前景。

由于參與ceRNA網(wǎng)絡(luò)的lncRNA、circRNA、miRNA和miRNA的靶向mRNA多有異常表達(dá)，且相比傳統(tǒng)的肝癌診斷生物標(biāo)志物更具特異性，因此它們可以成為肝癌良好的潛在治療靶點和診斷標(biāo)志物。目前，經(jīng)典的生物標(biāo)志物(如甲胎蛋白)仍被臨床上用作檢測早期肝癌的金標(biāo)準(zhǔn)，所以尋找可以更好應(yīng)用于臨床的ceRNA肝癌診斷標(biāo)志物很有必要且前景廣闊。

此外，當(dāng)前研究多集中于尋找可以作為診斷肝癌的生物標(biāo)志物或治療靶點的ceRNA，對于其參與肝癌細(xì)胞化療耐藥性的探索較少。例如，索拉非尼作為一種新型多靶點抗腫瘤藥物，是目前治療晚期肝癌的有效藥物。但是，在肝癌治療期間經(jīng)?？梢杂^察到肝癌細(xì)胞的索拉非尼耐藥現(xiàn)象。有文獻(xiàn)[40]報道在耐索拉非尼的肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了circRNA的異常表達(dá)，這些異常表達(dá)的circRNA是否通過ceRNA調(diào)控機制參與到肝癌細(xì)胞的索拉非尼耐藥呢？ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與肝癌細(xì)胞放化療耐受機制的潛在的分子機制是怎樣的？這仍待進一步探究。

總之，目前ceRNA研究處于熱門階段，盡管ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已在生物信息學(xué)方面進行了廣泛的探究，但相應(yīng)“濕實驗”仍相對較少。對于肝癌中ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的理解仍然有限，許多與肝癌相關(guān)的miRNA和非編碼RNA尚未被識別。在今后研究中，一方面需要發(fā)現(xiàn)肝癌中更多的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，另一方面需要探索ceRNA調(diào)控機制在臨床實踐中的應(yīng)用，為肝癌診療提供新的途徑。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：陳曉昊負(fù)責(zé)擬定寫作思路，檢索文獻(xiàn)，撰寫論文；鄧益斌負(fù)責(zé)指導(dǎo)、修改論文并最終定稿。