馮坤苗，吳思佳，陳文華，代 威，徐凌川，韓 婷 （. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院, 上海 004；. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 浙江 杭州 005；. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 山東 濟南 5099）

泰山白首烏來源于為蘿摩科（Asclepiadaceae）鵝絨藤屬（CynanchumLinn.）植物戟葉牛皮消Cynanchum bungeiDecne. 的干燥塊根，《本草備要》記載：“具有養(yǎng)血補血、補肝腎、強筋骨和潤腸通便的作用”，也被譽為泰山四大名藥之首[1-2]。研究表明，泰山白首烏的主要活性成分為苯乙酮和C21甾體皂苷[3-7]。泰山白首烏的主要藥理活性有抗腫瘤、保肝、抗炎、抗菌、抗病毒、抗抑郁、降血糖 等[5-7]。

植物內(nèi)生菌是一類廣泛存在于宿主植物體內(nèi)，且不引起宿主明顯病癥的真菌，是一類具有豐富多樣性的微生物類群。植物內(nèi)生菌通過“協(xié)同進化”作用，以促進宿主植物生長，增強抗逆性，促進藥用植物中有效成分的積累[8-9]，植物內(nèi)生菌已成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點。顧曉潔等[10]2018 年報道了濱海白首烏塊根中內(nèi)生細菌的分離鑒定。Li 等[11]從濱海白首烏中分離出的一株產(chǎn)紅色素具有抗氧化作用的內(nèi)生真菌Stemphylium lycopersici。Gu 等[12]從濱海白首烏中分離得到的內(nèi)生真菌Plectosphaerella cucumerinaYCTA2Z1 中分離鑒定得到13 種化合物，分離得到與宿主濱海白首烏相同的次級代謝產(chǎn)物單體告達庭（caudatin）、白首烏二苯酮、cynandione B 和 2',5'-二羥基苯乙酮[11-12]。但是，目前沒有關(guān)于泰山白首烏內(nèi)生真菌的傳統(tǒng)分離純化培養(yǎng)報道。同時，有研究表明，泰山白首烏的粗提物和單體化合物對多種腫瘤細胞株均具有顯著活性[6]，目前已有從植物中分離得到具有抗腫瘤活性的內(nèi)生真菌[13-14]的研究，但對泰山白首烏內(nèi)生真菌的相關(guān)分離鑒定、活性成分及抗腫瘤等生物活性的研究還未開展。

本實驗以泰山白首烏內(nèi)生真菌為研究對象，通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法，將分離鑒定得到的泰山白首烏內(nèi)生真菌進行液體發(fā)酵，并進行抗腫瘤活性菌株篩選。一方面探討泰山白首烏內(nèi)生真菌能否產(chǎn)生與宿主相似的次級代謝產(chǎn)物，另一方面為研發(fā)新的抗腫瘤活性藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥用植物

3 個產(chǎn)地的健康泰山白首烏植株各5 株，包含根、莖、葉。濟南的泰山白首烏葉（JTY）、泰山白首烏莖（JTJ）、泰山白首烏根（JTG），均采自山東中醫(yī)藥大學(xué)長清校區(qū)植物園內(nèi)（36°56′ N, 116°79′ E）；臨沂的泰山白首烏葉（LTY）、泰山白首烏莖（LTJ）、泰山白首烏根（LTG），均采自臨沂費縣御華景宸農(nóng)業(yè)生態(tài)園內(nèi)（35°27′ N, 117°97′ E）；泰安的泰山白首烏葉（TTY）、泰山白首烏莖（TTJ）、泰山白首烏根（TTG），均采自泰山（35°78′ N, 117°45′ E）。植物樣品經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室徐凌川教授鑒定為泰山白首烏C. bungeiDecne.。采集的樣品用無菌塑料袋包裝，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?8 h 內(nèi)進行樣品處理。

1.2 儀器與試劑

T100?梯度PCR 擴增儀（美國BIO-RAD 伯樂T100 梯度PCR 儀）；電泳儀（上海天能科技有限公司）；凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；Qubit? 2.0 熒光計（賽默飛Invitrogen）；SW-CJ-1D 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；E.Z.N.A.真菌DNA 提取試劑盒（美國Omega Bio-Tek）；Taq DNA Polymerase（ 賽默飛 Thermo） ； Agencourt AMPure XP（Beckman）；2×Trans Taq High Fidelity(HiFi) PCR SuperMix I（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；ddH2O（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；瓊脂糖（超純）（北京天根生物科技有限公司）；50×TAE 緩沖液（北京索萊寶科技有限公司Solarbio）；DNA Maker（日本TaKaRa）；Goldview 核酸染料（10 000×）；6×Loading buffer（日本TaKaRa）；XD-101 CO2細胞培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司）；奧林巴斯IX51 倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司OLYMPUS） ； ELX800 光吸收酶標儀（ 美國BioTek）；細胞培養(yǎng)瓶（美國FALCON）；青、鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；PBS（北京索萊寶科技有限公司）；RPMI-1 640（美國GIBCO）；DMEM（美國GIBCO）；L15（美國GIBCO）；FBS（美國ExCell Biology FBS500）；MTT（美國Amresco）；DMSO（溶解受試藥品）（美國SIGMA D2650）；土豆（沃爾瑪）；葡萄糖（源葉生物）；瓊脂粉（源葉生物）；無水乙醇，分析純（上海泰坦）；次氯酸鈉（分析純，國藥集團）。

1.3 供試腫瘤菌株

人肝癌細胞HEPG2、人胃癌細胞HGC27、人結(jié)腸癌細胞HT-29、人宮頸癌細胞HELA（中國科學(xué)院上海細胞庫）。

2 方法

2.1 分離鑒定

2.1.1 傳統(tǒng)分離培養(yǎng)

表面消毒：將采集新鮮濟南、臨沂和泰安產(chǎn)的戟葉牛皮消的根、莖和葉用自來水沖洗干凈，轉(zhuǎn)移至超凈臺，進行“75%乙醇-2.5%次氯酸鈉-75%乙醇”的3 步表面消毒處理。處理過后繼續(xù)用無菌水沖洗5 遍，滅菌濾紙將表面水分吸干。

組織塊培養(yǎng)：超凈臺中操作，用消毒的剪刀和鑷子分別將根、莖與葉剪切成小的組織塊（0.5 cm×0.5 cm），分別從3 個部位中各隨機挑取20 個組織塊，每組設(shè)置4～5 個組織塊，分組好的組織塊置于含有青霉素（50 mg/L）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）的平板中，于溫度25 ℃，濕度80%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進行內(nèi)生真菌菌絲的生長情況的定期觀察。挑取尖端菌絲轉(zhuǎn)移到新的PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至菌絲形態(tài)單一，即得到純化的菌株[15-16]。根據(jù)內(nèi)生真菌菌株的培養(yǎng)的形態(tài)特征初步劃分為不同的形態(tài)型，拍照留存。根據(jù)菌株群落的培養(yǎng)特征，劃分為不同的形態(tài)型，繼續(xù)將分離純化后的菌株接種至PDA 固體試管斜面培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，4 ℃冰箱保存。

2.1.2 內(nèi)生菌鑒定

觀察培養(yǎng)的內(nèi)生真菌菌落形態(tài)，對照《真菌鑒定手冊》進行形態(tài)學(xué)特征鑒定。將“2.1.1”項下形態(tài)一致的泰山白首烏內(nèi)生真菌菌株進行合并[16]，參考E.Z.N.A.真菌DNA 提取試劑盒說明書提取菌株DNA。以提取的DNA 為模板，采用真菌ITS 通用引物TIS4（5’-TCC TCC GCT TTA TTG ATA TGC-3’）和ITS5（5’-GGA AGT AAA GTC GTA ACA AGG-3’）對菌株的r DNA-ITS 區(qū)域進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系：2×Trans Taq Fidelity(HiFi) PCR SuperMix 15 μl，Primer（10 μmol/L）各1 μl，Genomic DNA 10 ng；補充雙蒸水至 30 μl。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性40 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。5 μl PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將合格的PCR 擴增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司進行測序。內(nèi)生真菌菌株測序得到的ITS 序列去除載體序列，利用NCBI 數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）BLAST 進行比對，根據(jù)所得分子鑒定結(jié)果并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定菌株。

2.2 代謝產(chǎn)物抗腫瘤活性

2.2.1 代謝產(chǎn)物的提取

按“2.1”項下方法分離得到的90 個形態(tài)型泰山白首烏內(nèi)生真菌菌株為供試菌株，PDA 固體培養(yǎng)基中接種活化。待菌絲覆蓋培養(yǎng)基表面時，用直徑5 mm 打孔器制備10 個菌餅，放入裝有100 ml的PDA 培養(yǎng)基的錐形瓶中，每個菌種接種6 瓶。接種后于25 °C、180 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d。發(fā)酵完成后，抽濾并收集發(fā)酵培養(yǎng)液，1∶1 乙酸乙酯萃取3 次，合并有機相，減壓濃縮，即得乙酸乙酯提取物[17]。干燥后于4 °C 冰箱中避光保存。

2.2.2 抗腫瘤活性測試

二甲基亞砜(DMSO)溶解乙酸乙酯粗提物后，用PBS 分別稀釋至0.001、0.01、0.1、1.0、10.0、100.0 μg/ml。采用MTT 法測定樣品抗腫瘤活性[17]。以人肝癌細胞HEPG2，人胃癌細胞HGC27，人結(jié)腸癌細胞HT-29，人宮頸癌細胞HELA 為受試對象，陽性對照采用阿霉素。將細胞放置于含10%FBS、青霉素和鏈霉素各100 U/ml 的DMEM 細胞培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 換液傳代。消化傳代后顯微鏡下觀察細胞的生長情況。取對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化后，10%小牛血清的完全培養(yǎng)液洗滌、懸浮，將100 μl 懸浮細胞液（2～4×104個/ml）接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μl 含有不同藥物的完全培養(yǎng)基(含10%小牛血清，1%雙抗)，每種濃度設(shè)3 個平行孔，設(shè)空白對照組，培養(yǎng)72 h 后，每個孔加入5 mg/ml 的 MTT 10 μl，培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液后加入100 μl DMSO，振蕩至結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀在波長為570 nm 處測定A值，計算各濃度下的細胞抑制率，計算方法如下：

陰性對照孔相對A值=陰性對照孔絕對A值—空白對照孔絕對A值

藥敏孔相對A值=藥敏孔絕對A值—空白對照孔絕對A值

本研究采用SPSS 17.0 通過機率單位加權(quán)回歸法（Bliss 法）計算IC50。

3 結(jié)果與分析

3.1 內(nèi)生真菌的分離鑒定及種群組成

將分離到的869 株內(nèi)生真菌，根據(jù)培養(yǎng)特征劃分為90 個形態(tài)型，對不同形態(tài)型菌株ITS 基因與GenBank 中的參考序列進行分子系統(tǒng)學(xué)分析，結(jié)果見表1，有結(jié)果可知，鑒定得到的內(nèi)生真菌屬于3 門、12 綱、14 目、14 科、18 屬和30 種。

表1 根據(jù)BLAST 序列分離得到的泰山白首烏內(nèi)生真菌

(續(xù)表1)

3.1.1 組織類型對內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)的影響

組織因素在影響內(nèi)生真菌的多樣性和分布規(guī)律發(fā)揮著重要的作用[18]，在屬的水平上，其對泰山白首烏內(nèi)生真菌的組成影響也較為顯著，如圖1 所示。泰山白首烏根部內(nèi)生真菌主要分布于8 個屬，其中，優(yōu)勢菌屬為鐮刀菌屬Fusarium，占根中內(nèi)生真菌的64.29%；泰山白首烏莖部內(nèi)生真菌分布于9 個屬，優(yōu)勢菌屬為鏈格孢屬Alternaria，占莖中內(nèi)生真菌的60%；泰山白首烏葉部內(nèi)生真菌分布13 個屬，優(yōu)勢菌屬為鏈格孢屬Alternaria，占葉中內(nèi)生真菌的56.25%；泰山白首烏內(nèi)生真菌的葉豐度大于莖和根。3 個不同的組織部位中，鏈格孢屬Alternaria和炭疽菌屬Colletotrichum為三者共有屬，其他具有差異。結(jié)果表明，在不同組織部位中，泰山白首烏的內(nèi)生真菌的分布差異顯著。

圖1 泰山白首烏不同部位中內(nèi)生真菌組成及占百分比（%，屬）

3.1.2 產(chǎn)地對泰山白首烏內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)的影響

地理位置會影響內(nèi)生真菌的多樣性[19]。在90 個形態(tài)型內(nèi)生真菌菌株中，產(chǎn)地濟南的泰山白首烏分離39 個菌株，產(chǎn)地泰安分離得到26 個菌株，產(chǎn)地臨沂分離得到25 個。如圖2 結(jié)果所示，3 個產(chǎn)地的泰山白首烏優(yōu)勢菌屬為鏈格孢屬Alternaria和鐮刀菌屬Fusarium，產(chǎn)地濟南的泰山白首烏內(nèi)生真菌主要分布在12 個屬，優(yōu)勢菌屬鏈格孢屬占38.46%，鐮刀菌屬占28.21%；產(chǎn)地泰安的泰山白首烏內(nèi)生真菌主要分布在5 個屬，優(yōu)勢菌屬鏈格孢屬占61.54%，鐮刀菌屬占26.92%；產(chǎn)地臨沂的泰山白首烏內(nèi)生真菌主要分布在11 個屬，優(yōu)勢菌屬鏈格孢屬占48.00%，鐮刀菌屬占32.00%。由此可知，產(chǎn)地對泰山白首烏內(nèi)生真菌的群落組成和優(yōu)勢菌群均有影響，群落組成影響較大。

圖2 不同產(chǎn)地泰山白首烏內(nèi)生真菌組成及所占百分比（%）

3.2 泰山白首烏內(nèi)生真菌的抗腫瘤活性

MTT 結(jié)果表明，有13 株內(nèi)生真菌菌株代謝產(chǎn)物對HEPG2、HGC27、HT-29、HeLa 腫瘤細胞株表現(xiàn)抗腫瘤活性，占總數(shù)的14.4%。如表2 所示，B.sorokinianaJTY6、A. alternateJTY10、A. brassicicolaJTJ11、B. ochroleucaJTJ18、Xylariaceaesp. LTJ1、A. tenuissimaLTJ2、C. acutatumLTJ3 和A. alternataLTJ6 抗腫瘤活性較明顯。鏈格孢屬Alternaria是泰山白首烏內(nèi)生真菌中篩選出抗腫瘤活性菌株的優(yōu)勢菌屬，其中，A. tenuissimaLTJ2 和A. alternataLTJ6 的抗腫瘤活性尤其顯著，能夠顯著抑制HEPG2、HGC27、HT-29 和HeLa 腫瘤細胞株。A.tenuissimaLTJ2 對HEPG2、HGC27、HT-29、HeLa 4 種腫瘤細胞株的 IC50值分別為（2.21±0.61）、（3.11±0.46）、（8.25±1.11）、（3.85±0.60） μg /ml；A.alternataLTJ6 為（1.58±0.38）、（1.46±0.39）、（3.63±1.23）、（6.24±0.49） μg /ml。以上結(jié)果表明，A.tenuissimaLTJ2 和A. alternataLTJ6 是泰山白首烏具有顯著抗腫瘤活性的內(nèi)生真菌株，可以進一步研究其產(chǎn)生抗腫瘤活性的單體成分。

表2 泰山白首烏內(nèi)生菌菌株的抗腫瘤活性

4 討論

泰山白首烏與“泰山黃精”、“泰山紫草”和“泰山四葉參”并稱為泰山四大名藥[2]，但因其自然繁殖率低等因素，導(dǎo)致資源匱乏，市場上供不應(yīng)求。植物內(nèi)生真菌與宿主長期協(xié)同進化，可以產(chǎn)生相同或相似的活性代謝產(chǎn)物[9]，通過對泰山白首烏內(nèi)生真菌的深入研究將有效的緩解其資源匱乏，而內(nèi)生真菌有可能成為開發(fā)泰山白首烏的新資源。

本研究表明泰山白首烏中內(nèi)生真菌資源豐富，具有較豐富的多樣性，泰山白首烏內(nèi)生真菌的分布在不同組織部位差異顯著，以豐度比較葉大于莖和根，具有明顯的組織特異性，產(chǎn)地對泰山白首烏的優(yōu)勢菌群和群落組成有影響。除優(yōu)勢屬、種外，分離得到的大豆疫霉、炭角菌和淡色赤殼菌等內(nèi)生真菌菌株，也具有良好生物活性[20-22]。

植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性成分及生物活性，本研究首次報道了篩選得到的13 株泰山白首烏內(nèi)生真菌具有抗腫瘤活性，占總數(shù)的14.4%，其中，從葉中篩選到4 株抗腫瘤活性菌株，莖中篩選得到9 株抗腫瘤活性菌株，根中無，同時，A. tenuissimaLTJ2 和A. alternataLTJ6 兩種抗腫瘤活性尤其顯著，值得深入研究。然而，泰山白首烏的藥用部位為塊根，由于內(nèi)生真菌在植物組織中的定殖不同，導(dǎo)致在不同組織部位的分布存在差異，具體原因還需要進一步深入研究。另外，從產(chǎn)地上來看，不同產(chǎn)地所篩選得到的抗腫瘤活性菌株數(shù)量及品種不同，濟南產(chǎn)泰山白首烏篩選到5 株抗腫瘤活性菌株，臨沂產(chǎn)泰山白首烏篩選到6 株活性菌株，泰安產(chǎn)泰山白首烏篩選到2 株活性菌株，綜上，泰山白首烏中內(nèi)生真菌的種群結(jié)構(gòu)的抗腫瘤活性是否存在與產(chǎn)地相關(guān)，需要進一步深入研究，而已經(jīng)分離得到的活性菌株的次生代謝產(chǎn)物及其作用機制的研究也是下一個重要目標。