陳 虹，黃元禮，王 涵，連 環(huán)，韓倩倩，王春仁

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629）

近年來利用人源細(xì)胞系來檢測(cè)人體皮膚過敏源的體外試驗(yàn)方法日趨成熟，發(fā)展以人源細(xì)胞為基礎(chǔ)的體外檢測(cè)系統(tǒng)能最大化模擬人類皮膚致敏過程。皮膚中主要的免疫細(xì)胞是朗格漢斯細(xì)胞，但最先與應(yīng)用于局部皮膚的化合物接觸的是角質(zhì)細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞參與免疫反應(yīng)并產(chǎn)生許多細(xì)胞因子。角質(zhì)細(xì)胞衍生的腫瘤壞死因子α在朗格漢斯細(xì)胞遷移的起始過程起了重要作用；同樣，角質(zhì)細(xì)胞也是IL-18的重要來源，IL-18是朗格漢斯細(xì)胞遷移誘導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。某些皮膚致敏物并不能與蛋白質(zhì)直接反應(yīng)，而只能作為前抗原（通過代謝活化成抗原）參與致敏，由于角質(zhì)細(xì)胞具有內(nèi)部的代謝活化作用使得角質(zhì)細(xì)胞在致敏過程中成為一個(gè)重要的角色，因此基于人源角質(zhì)細(xì)胞的檢測(cè)方法——KeratinoSens試驗(yàn)被開發(fā)應(yīng)用。

KeratinoSens試驗(yàn)由Givaudan公司開發(fā)，已于2015年被經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）采納為TG 442D指南文件。其原理是利用化學(xué)致敏物固有親電性（或具備通過代謝將其轉(zhuǎn)化為親電性化學(xué)產(chǎn)品的能力），與皮膚中蛋白質(zhì)反應(yīng)后形成半抗原復(fù)合物，觸發(fā)Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路。構(gòu)建含熒光素酶報(bào)告基因的KeratinoSens細(xì)胞系，在ARE控制下受誘導(dǎo)表達(dá)，其誘導(dǎo)表達(dá)程度通過測(cè)量熒光素酶與熒光底物反應(yīng)得到的相對(duì)光輸出量來確定。

構(gòu)建細(xì)胞系的技術(shù)路線是首先合成人類

AKR1C2

基因ARE元件的兩條互補(bǔ)DNA單鏈，將兩條單鏈退火連接后接入載體pGL3的

Kpn

I和

Bgl

II兩位點(diǎn)之間。隨后將目標(biāo)片段連同啟動(dòng)子SV40一同從載體pGL3上使用限制性內(nèi)切酶切下，接入pGL4.17的

Kpn

I和

Hin

d III兩位點(diǎn)之間，篩選回收后得到目標(biāo)質(zhì)粒并記為pGL4.17-AKR1C2-ARE-SV40。將目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人永生化角質(zhì)細(xì)胞HaCaT細(xì)胞中，用G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系記為KeratinoSens細(xì)胞系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

HaCaT細(xì)胞，購(gòu)于北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；DH5α感受態(tài)細(xì)菌購(gòu)于Solarbio公司。載體pGL3、pGL4.17、Bright-Glo熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)于Promega公司，限制性內(nèi)切酶

Kpn

I、

Bgl

II、

Hin

d III購(gòu)于NEB公司，α-MEM、PBS購(gòu)于Hyclone公司，0.25%trypsin-EDTA、Opti-MEM購(gòu)于Gibco公司，Lipofectamine2000、G418購(gòu)于Invitrogen公司，凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于AXYGEN公司，小量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)于北京莊盟科技有限公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司，Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司。脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate，DOC）、三 氯 乙 酸（trichloroacetic acid，TCA）、磷鎢酸（phosphotungstic acid，PTA），強(qiáng)致敏物二硝基氯苯（dinitrochlorbenzene，DNCB）、4-硝基芐溴（4-nitrobenzyl bromide）、對(duì) 苯 醌（p-benzoquinone），中等強(qiáng)度致敏物2-巰基苯并噻唑（2-mercaptobenzothiazole）、肉桂醛（cinnamic aldehyde）、β-大馬酮（β-damascone）以 及 弱 致 敏 物α-己 基 肉 桂 醛（αhexylcinnamaldehyde）、對(duì) 氨 基 苯 甲 酸 乙 酯（ethyl 4-aminobenzoate），非致敏物十二烷基硫酸鈉（SDS）均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

GloMax 96微孔板發(fā)光測(cè)試儀購(gòu)于Promega公司，自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)于Countstar公司，冷凍離心機(jī)、二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于Thermo Fisher公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)于Hitachi公司。

1.2 KeratinoSens細(xì)胞系的構(gòu)建和鑒定

1.2.1 KeratinoSens細(xì)胞系的構(gòu)建

合成含單個(gè)抗氧化元件（ARE）的兩條互補(bǔ)核苷酸單鏈（上游5′-CTGGTCGCAAGGTGTGCAAGCTGCTGAGTCACCCTGA CTGCATCAACCCCAGGAGCTA-3′；下游5′-GATCTA GCTCCTGGGGTTGATGCAGTCAGGGTGACTCAGCAGC TTGCACACCTTGCGACCAGGTAC-3′）。稀 釋 合 成 的DNA至20μL，使用上游引物、下游引物、10×NEBuffer 2各5μL，ddHO 10μL退火合成相應(yīng)雙鏈DNA。利用

Kpn

I和

Bgl

II對(duì)pGL3載體進(jìn)行雙酶切。雙酶切體系（30μL）包括：限制性內(nèi)切酶

Kpn

I和

Bgl

II各1.5μL、2μL載體pGL3、3μL NEBuffer 3.1、ddHO 22μL，于37℃反應(yīng)4 h后置于冰上保存。將酶切后pGL3載體進(jìn)行電泳及膠回收，按照凝膠DNA回收試劑盒（AXYGEN）說明回收DNA?；厥蘸蟮碾p酶切載體pGL3和退火的ARE片段進(jìn)行連接，反應(yīng)體系（10μL）包括：1μL酶切后載體pGL3、2μL退火產(chǎn)物、2μL T4 buffer、1μL T4 ligase、4μL ddHO，室溫下混勻，靜置過夜，得pGL3連接產(chǎn)物。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化篩選后，挑取單克隆按照小量質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒小提并進(jìn)行雙酶切電泳鑒定。雙酶切pGL3連接產(chǎn)物和載體pGL4.17，反應(yīng)體系30μL：限制性內(nèi)切酶

Kpn

I和

Hin

d III各1.5μL、pGL3連接產(chǎn)物和載體pGL4.17各2μL、ddHO 20μL，3μL NEBuffer 2.1，37℃反應(yīng)2 h后4℃保存，酶切后膠回收。將目標(biāo)ARE片段連同啟動(dòng)子SV40從pGL3-Promoter上使用限制性內(nèi)切酶切下后，接入pGL4.17的

Kpn

I和

Hin

d III兩位點(diǎn)之間，篩選回收后質(zhì)粒小提并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過PubMed比對(duì)工具BLAST與目的片段比對(duì)。將測(cè)序正確的小提質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化涂板并挑取單克隆菌落至100 mL LB培養(yǎng)基中，37℃條件下在180～200 r/min的搖床上振蕩過夜。按質(zhì)粒大提試劑盒說明進(jìn)行質(zhì)粒大提得到目標(biāo)質(zhì)粒pGL4.17-AKR1C2-ARE-SV40。

使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒pGL4.17-AKR1C2-ARE-SV40和對(duì)照載體pGL4.17轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞。使用G418篩選細(xì)胞，大約10 d后對(duì)照組轉(zhuǎn)染細(xì)胞全部死亡。得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆使用Promega Glomax光度計(jì)測(cè)量，挑取熒光誘導(dǎo)值比儀器上限低2～3個(gè)數(shù)量級(jí)的克隆株。該試驗(yàn)挑取熒光讀數(shù)6位且細(xì)胞狀態(tài)良好的1株細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，得到KeratinoSens細(xì)胞系。采用此細(xì)胞系檢測(cè)致敏性的方法稱為KeratinoSens試驗(yàn)。

1.2.2 KeratinoSens細(xì)胞系的鑒定

選取OECD 429附錄1和文獻(xiàn)[4]驗(yàn)證的強(qiáng)致敏物二硝基氯苯、4-硝基芐溴、對(duì)苯醌，中等致敏化合物2-巰基苯并噻唑、肉桂醛、β-大馬酮，弱致敏物α-己基肉桂醛、對(duì)氨基苯甲酸乙酯及非致敏物十二烷基硫酸鈉，使用Givaudan的KeratinoSens試驗(yàn)對(duì)待測(cè)物進(jìn)行測(cè)試。計(jì)算陰性對(duì)照組的變異度，測(cè)試細(xì)胞株的穩(wěn)定性；對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)中上述待測(cè)物的致敏性能，得到KeratinoSens試驗(yàn)的致敏預(yù)測(cè)性。

每組試驗(yàn)細(xì)胞鋪4塊96孔板，其中3塊白色板用于熒光素酶試驗(yàn)，1塊透明板用于MTT試驗(yàn)。陰性對(duì)照使用含1%FBS培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照使用濃度為8 mmol/L的DNCB，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。待測(cè)物溶于DMSO制成濃度為100 mmol/L的溶液。然后用DMSO連 續(xù)2倍 稀 釋得 到0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25、50、100 mmol/L共10個(gè)濃度的樣品。10個(gè)濃度樣品均用含1%胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋25倍。將濃度1×10/mL的KeratinoSens細(xì)胞，每孔100μL接種于白色96孔板。每孔再添加100μL不含G418的培養(yǎng)基。放置于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，使用150μL含1%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基置換。將50μL含1%胎牛血清培養(yǎng)基的不同濃度樣品添加到不同孔里，受試品終濃度從2～1 000μmol/L，DMSO終濃度1%。試驗(yàn)保持相同培養(yǎng)條件下，6孔陰性對(duì)照，6孔陽(yáng)性對(duì)照，4孔空白對(duì)照。樣品與細(xì)胞共孵育48 h后，使用PBS清洗細(xì)胞1～2遍。每孔添加50μL不含血清的培養(yǎng)基和50μL螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)液。室溫避光孵育5 min，隨后使用Promega Glomax光度計(jì)測(cè)試讀數(shù)。同時(shí)，MTT法測(cè)試細(xì)胞活力。

1.2.3 計(jì)算及判定標(biāo)準(zhǔn)

基因活性誘導(dǎo)倍數(shù)=最大誘導(dǎo)值平均值/陰性對(duì)照誘導(dǎo)平均值；細(xì)胞活力

V

=

A

/

A

×100%，其中

A

為樣品組吸光度平均值（扣除空白），

A

為對(duì)照組吸光度平均值（扣除空白）。

陽(yáng)性化合物判定標(biāo)準(zhǔn)：在細(xì)胞活力大于70%時(shí)，有基因活性誘導(dǎo)倍數(shù)大于1.5；3組重復(fù)樣品中，有2組以上樣品判斷為陽(yáng)性；3組樣品有相似的劑量反應(yīng)曲線（隨著濃度增加至細(xì)胞毒水平，基因活性誘導(dǎo)增加；與陰性對(duì)照比較，1.5倍基因誘導(dǎo)對(duì)應(yīng)的濃度值相差不超過濃度序列里相鄰兩個(gè)濃度），陽(yáng)性對(duì)照組有明顯基因活性誘導(dǎo)倍數(shù)大于1.5的情況發(fā)生。按下式計(jì)算變異度（coefficient of variation，CV）。

細(xì)胞系穩(wěn)定性判定標(biāo)準(zhǔn)：陰性對(duì)照組基因活性誘導(dǎo)值變異度小于20%；每個(gè)樣品的劑量反應(yīng)曲線有相似的趨勢(shì)；陽(yáng)性對(duì)照有明顯的基因活性誘導(dǎo)倍數(shù)大于1.5的情況發(fā)生。

1.3 醫(yī)用外科手套致敏性檢測(cè)

1.3.1 蛋白抽提及濃度測(cè)量

樣品1為一次性使用滅菌橡膠外科手套（高邦，桂林紫竹乳膠制品有限公司），樣品2為一次性使用醫(yī)用橡膠檢查手套（AMMEX，越南制造），樣品3為一次性使用橡膠檢查手套（瑞京，北京瑞京乳膠制品有限公司）。膠乳手套參照醫(yī)療器械國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 21870-2008天然膠乳醫(yī)用手套水抽提蛋白質(zhì)的測(cè)定》改進(jìn)的lowry法抽提手套中水溶性蛋白。抽提液使用PBS。于25℃的條件下，恒溫?fù)u床以低速振蕩抽提4 h。按照Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒說明書測(cè)試待測(cè)樣品，使用紫外分光光度計(jì)在562 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)蛋白濃度。

1.3.2 手套抽提蛋白KeratinoSens試驗(yàn)

超凈臺(tái)內(nèi)無菌條件取3個(gè)手套樣品的可溶蛋白抽提液。分別取抽提液20、40、60、80和100μL，依次按照本研究KeratinoSens試驗(yàn)加入96孔板相應(yīng)的試驗(yàn)孔中，并補(bǔ)充含F(xiàn)BS的MEM培養(yǎng)液至每孔200μL，每孔FBS終濃度均為1%。放置于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出測(cè)試。

1.4 金屬鎳致敏性檢測(cè)

1.4.1 鎳浸提及濃度測(cè)量

含鎳金屬參照醫(yī)療器械國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 16886.12-2017醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第12部分：樣品制備與參照樣品》進(jìn)行浸提，樣品1為正畸絲（3M，鎳含量40%～50%），樣品2為鎳鈦合金記憶合金棒（杭州啟明醫(yī)療器械有限公司，經(jīng)皮介入心臟瓣膜系統(tǒng)，鎳含量40%～50%），樣品3為鎳粉200目（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

將3種樣品各稱量2 g，樣品滅菌后用10 mL含2%雙抗的MEM培養(yǎng)基浸泡于15 mL離心管中。離心管滅菌密封后，置于37%恒溫水浴搖床浸提，鎳粉浸提3 d，其余兩種浸提90 d。

配制濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/mL的系列鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液。在232 nm波長(zhǎng)下使用火焰原子吸收分光光度計(jì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)量3份樣品鎳含量。

1.4.2 鎳浸提液KeratinoSens試驗(yàn)

超凈臺(tái)內(nèi)無菌條件取金屬鎳樣品浸提液上清。分別取鎳浸提液20、40、60、80和100μL，依次按照本研究KeratinoSens試驗(yàn)加入96孔板相應(yīng)的試驗(yàn)孔中，并補(bǔ)充含F(xiàn)BS的MEM培養(yǎng)液至每孔200μL，F(xiàn)BS終濃度均為1%。放置于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 KeratinoSens細(xì)胞系鑒定結(jié)果

2.1.1 不同能力致敏物檢測(cè)結(jié)果

高、中、低3種不同致敏力致敏物及1種非致敏物的KeratinoSens試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果見圖1。按照判定標(biāo)準(zhǔn)，基因活性誘導(dǎo)倍數(shù)大于1.5時(shí)，滿足細(xì)胞活性大于70%，可判定為陽(yáng)性；1種非致敏物，無基因活性誘導(dǎo)倍數(shù)大于1.5的情況發(fā)生，判定為陰性。與人類斑貼測(cè)試文獻(xiàn)相比，結(jié)果預(yù)測(cè)全部正確。

圖1 不同能力致敏物KeratinoSens試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 變異度計(jì)算結(jié)果

經(jīng)計(jì)算本試驗(yàn)9個(gè)樣品陰性對(duì)照組的平均變異度為18.6%，符合穩(wěn)定性的要求。

2.2 天然膠乳手套致敏性檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 天然乳膠手套水溶性蛋白抽提濃度

3份手套樣品水溶蛋白濃縮5倍后紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，經(jīng)換算得到原始濃度，手套樣品1濃度為0.008 mg/mL，樣品2為0.008 mg/mL，樣品3為0.004 mg/mL。

2.2.2 天然乳膠手套浸提液KeratinoSens試驗(yàn)結(jié)果

3份手套樣品KeratinoSens試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果見圖2，基因活性誘導(dǎo)均無大于1.5倍情況發(fā)生，判斷為陰性。

圖2 3種天然膠乳手套KeratinoSens試驗(yàn)結(jié)果

2.3 含鎳金屬致敏性檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 金屬鎳離子濃度結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)鎳粉浸提液鎳離子濃度較高，正畸絲和瓣膜材料合金鎳離子濃度近似且較低。鎳離子濃度檢測(cè)結(jié)果分別為鎳粉156.7mg/L、正畸絲0.984 mg/L、瓣膜材料合金小于標(biāo)線最低濃度點(diǎn)。

2.3.2 金屬鎳KeratinoSens試驗(yàn)結(jié)果

3份不同鎳離子濃度浸提液KeratinoSens試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（圖3）近似，基因活性誘導(dǎo)均無大于1.5倍情況發(fā)生，判斷為陰性。

圖3 3種含鎳金屬浸提液KeratinoSens試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究采用致敏物通過基因活性誘導(dǎo)1.5倍值做定性判斷，在定量判斷區(qū)分致敏物的強(qiáng)弱時(shí)，有文獻(xiàn)提到強(qiáng)致敏物基因誘導(dǎo)1.5倍對(duì)應(yīng)的化合物濃度一般小于10μmol/L；弱致敏物對(duì)應(yīng)濃度一般大于50 μmol/L。如果以上可以作為一種定量標(biāo)準(zhǔn)，強(qiáng)致敏物4-nitrobenzyl bromide的基因活性誘導(dǎo)1.5倍對(duì)應(yīng)濃度約為16 mmol/L，應(yīng)被判定為中等致敏物；而中等致敏物β-damascone的基因活性誘導(dǎo)1.5倍對(duì)應(yīng)濃度小于2 mmol/L，應(yīng)被判定為強(qiáng)致敏物，其余化合物的判定與其致敏力基本相符。

KeratinoSens試驗(yàn)使用水相系統(tǒng)，對(duì)于無法溶解在適當(dāng)溶劑的脂溶性化學(xué)物質(zhì)很難正確評(píng)價(jià)。樣品不溶或無法形成穩(wěn)定的分散液會(huì)使得化學(xué)品難于在最高濃度測(cè)試。所以使用該系統(tǒng)評(píng)價(jià)的陽(yáng)性結(jié)果可被識(shí)別為致敏劑，但陰性結(jié)果不能作為準(zhǔn)確結(jié)論。OECD 442D也指出，選擇性與賴氨酸殘基反應(yīng)的致敏物使用該方法也可產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

一項(xiàng)由2 738例樣本對(duì)天然膠乳IV型超敏反應(yīng)的多中心研究結(jié)果顯示，天然乳膠手套可引起IV型超敏反應(yīng)。天然膠乳中水溶性蛋白質(zhì)的總殘留量與過敏反應(yīng)出現(xiàn)的頻率及嚴(yán)重性成正相關(guān)關(guān)系，其含有的水溶性蛋白質(zhì)是引起過敏的主要因素。手套樣品結(jié)果測(cè)試為陰性，尚需進(jìn)一步研究。

有研究顯示，在金屬鎳導(dǎo)致皮膚致敏的過程中，伴隨活性氧離子將低價(jià)態(tài)二價(jià)的鎳離子（Ni）氧化為Ni和Ni。說明鎳的化學(xué)價(jià)態(tài)和微環(huán)境也是鎳金屬致敏的影響因素，推測(cè)鎳反應(yīng)陰性可能由于模擬金屬鎳致敏微環(huán)境不充分，導(dǎo)致結(jié)果為陰性。

由于致敏機(jī)制復(fù)雜，涉及樹突狀細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞相互作用，單獨(dú)的體外測(cè)試無法覆蓋致敏的全部步驟，也可能是導(dǎo)致天然膠乳和金屬鎳反應(yīng)呈陰性的原因。已有文獻(xiàn)使用包含Keratino Sens試驗(yàn)的組合策略對(duì)213種化合物進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示與人類斑貼試驗(yàn)數(shù)據(jù)比較，準(zhǔn)確率高達(dá)90%。綜上所述，我們認(rèn)為可進(jìn)一步使用組合策略對(duì)此兩種醫(yī)療器械進(jìn)行測(cè)試以觀察效果，為KeratinoSens試驗(yàn)應(yīng)用于醫(yī)療器械的致敏性檢測(cè)提供經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)。