高曉斌，武雪亮*，王勝杰，孫光源，王文靜，梁 峰，趙軼峰，劉振顯，張迎春

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，河北 張家口 075000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病亡率分別位于所有腫瘤的第3位和第4位，且發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢(shì)。近年來，隨著我國居民生活方式、飲食結(jié)構(gòu)和生存環(huán)境的改變，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，2014年我國居民結(jié)直腸癌發(fā)病例數(shù)位居所有腫瘤第3位。盡管結(jié)直腸癌的診斷與治療已經(jīng)取得了長足的進(jìn)步，但由于在早期篩查、早期診斷上的諸多困難，部分患者失去了最佳治療時(shí)期，其整體5年生存率并未明顯提高，較歐美國家仍有較大差距。因此，對(duì)它進(jìn)行深層次的研究，從分子生物學(xué)角度闡明結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋求敏感度高、特異性強(qiáng)的標(biāo)志物已成為結(jié)直腸癌的研究熱點(diǎn)。三結(jié)構(gòu)域蛋白家族（tripartite motif，TRIM）是一個(gè)結(jié)構(gòu)相對(duì)保守的蛋白家族，擁有E3泛素化連接酶活性，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。目前已有研究發(fā)現(xiàn)TRIM59在乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展，然而TRIM59的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的關(guān)系目前鮮有報(bào)道。因此，本研究擬檢測(cè)TRIM59在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性，旨在為結(jié)直腸癌診斷、分子治療的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2015年2月—2016年2月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科收治的86例結(jié)直腸癌患者的臨床資料，選取癌組織和相應(yīng)的癌旁正常組織手術(shù)切除標(biāo)本。86例結(jié)直腸癌患者中，男47例，女39例；年齡40～79歲，中位年齡64歲，小于65歲的38例；直腸癌45例，結(jié)腸癌41例。所有納入患者臨床資料均完整，本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①行CRC根治性手術(shù)并且術(shù)后病理明確診斷為結(jié)直腸癌；②臨床資料完整，術(shù)后留存組織學(xué)標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他惡性腫瘤者；②臨床資料不全或難以配合取材者；③伴有嚴(yán)重心、肝、腎功能異常者；④新輔助放化療患者。術(shù)后隨訪主要通過門診復(fù)診、電話及網(wǎng)絡(luò)等方式對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪調(diào)查，隨訪時(shí)間為60個(gè)月，了解患者術(shù)后死亡時(shí)間及原因，所有納入研究的患者均獲得隨訪數(shù)據(jù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑

TRIzol提取試劑購于Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；PCR引物由上海生物工程技術(shù)公司設(shè)計(jì)并合成；TRIM59多克隆抗體購自美國Abcam公司；SP法免疫組化試劑盒、蘇木素染料及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)TRIM59 mRNA表達(dá)

使用總RNA提取試劑抽提組織中的總RNA，測(cè)定總RNA濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒兩步法合成cDNA，反應(yīng)體系按說明書要求配制，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）擴(kuò)增。引物序列如下：TRIM59上游5′-ATGGCCGATGACGTAATC GCG-3′，下游5′-CGTGAGCTCACCATGGATCAG-3′；GAPDH上游5′-TCCCTCGTGCTAGATCATGAA-3′，下游5′-GGTCATGATCAGCCACTGTC-3′。PCR反應(yīng)條件為：95℃、10 min；95℃、15 s，60℃、35 s，72℃、30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；于72℃延伸7 min。mRNA表達(dá)量采用2計(jì)算。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TRIM59蛋白表達(dá)

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（streptavidinperosidase，SP）法檢測(cè)TRIM59蛋白的表達(dá)水平。石蠟塊使用二甲苯脫蠟，作3.5μm厚的連續(xù)切片，80℃烤箱烘烤30 min，脫水；抗原熱修復(fù)，3%過氧化氫孵育，血清封閉；滴加兔抗人TRIM59多克隆一抗孵育過夜；加入生物素標(biāo)記二抗孵育1 h。最后使用DAB顯色30 s，蘇木精復(fù)染，松節(jié)油透明和樹膠行封片處理，最后置于光鏡下觀察。

免疫組化的結(jié)果判讀是由兩名病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲讀片，根據(jù)陽性細(xì)胞比例評(píng)分與細(xì)胞染色強(qiáng)度分值乘積進(jìn)行半定量分析，鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無細(xì)胞染色為0分，淺黃色顆粒為1分，黃色顆粒為2分，褐色顆粒為3分。陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分：陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為0分，10%～25%（含）為1分，25%～50%（含）為2分，＞50%為3分。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分和比例評(píng)分的乘積≥4分判定為高表達(dá)，＜4分判定為低表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用GraphPad Prism 7軟件作圖，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料，組間比較采用配對(duì)樣本

t

檢驗(yàn)；用百分率（%）表示計(jì)數(shù)資料，采用

χ

檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier分析和Log-rank法檢驗(yàn)結(jié)直腸癌患者TRIM59表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系，

P

＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIM59 mRNA和蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)

采用qPCR檢測(cè)配對(duì)的結(jié)直腸癌及癌旁組織中的TRIM59 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明，TRIM59在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平較配對(duì)的癌旁組織明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=12.86，

P

＜0.01），其中25對(duì)配對(duì)樣本的表達(dá)情況見圖1。免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明，TRIM59蛋白主要定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，染色呈棕黃色和黃褐色，而在癌旁組織中不表達(dá)或在正常黏膜細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈弱陽性表達(dá)，見圖2。TRIM59蛋白在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率為62.79%（54/86），在癌旁組織中的陽性表達(dá)率為32%（37/86），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=6.74，

P

＜0.01）。

圖1 TRIM59 mRNA在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)

圖2 免疫組化檢測(cè)TRIM59蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)（SP，×200）

2.2 TRIM59蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

TRIM59蛋白表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果見表1。結(jié)直腸癌組織中TRIM59蛋白表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的TNM分期（

χ

=8.515，

P

=0.003）、腫瘤浸潤深度（

χ

=7.167，

P

=0.007）以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（

χ

=5.511，

P

=0.018）相關(guān)，而其與患者的性別、年齡、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度均無顯著相關(guān)關(guān)系（

P

＞0.05）。

表1 TRIM59蛋白表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

2.3 TRIM59蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存期的關(guān)系

通過Kaplan-Meier分析TRIM59蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果見圖3?？梢奣RIM59高表達(dá)組患者的總生存期（overall survival，OS）和無病生存期（disease-free survival，DFS）較TRIM59低表達(dá)患者顯著縮短（

P

＜0.01或0.05），即TRIM59蛋白表達(dá)水平越高，結(jié)直腸癌患者預(yù)后越差。

圖3 TRIM59蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者術(shù)后預(yù)后的相關(guān)性分析

3 討論

TRIM59屬于TRIM蛋白超家族成員之一，其編碼基因位于人類第3號(hào)染色體上。TRIM59結(jié)構(gòu)包含高度保守的RBCC三段結(jié)構(gòu)域和涉及蛋白跨膜定位的TM結(jié)構(gòu)域，其主要功能是參與調(diào)控TRIM59細(xì)胞內(nèi)定位。TRIM59主要位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，通過介導(dǎo)蛋白與蛋白間的相互作用，調(diào)控蛋白穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的無序化增殖，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。較多研究表明，TRIM59在多種實(shí)體腫瘤中充當(dāng)癌基因，在惡性腫瘤的侵襲、遷移、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。最近研究報(bào)道，TRIM59在食管癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并且可通過多種信號(hào)通路或途徑參與腫瘤的惡性進(jìn)展。因此，進(jìn)一步提高對(duì)

TRIM59

基因研究的認(rèn)識(shí)，有望為腫瘤早期診斷和治療提供新靶點(diǎn)。

研究報(bào)道，TRIM59在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)明顯上調(diào)，其表達(dá)與NSCLC患者的年齡、性別、吸煙狀態(tài)、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期密切性相關(guān)。此外，Cox回歸分析結(jié)果表明TRIM59是NSCLC的獨(dú)立預(yù)后因子。以上表明TRIM59可作為非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn)。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，TRIM59在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著增加，并且其高表達(dá)與胰腺癌患者不良預(yù)后呈正相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TRIM59可能通過激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的糖酵解，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Zhou等采用qPCR和Western blot法檢測(cè)50例胃癌組織和配對(duì)胃正常組織中TRIM59 mRNA和蛋白水平，結(jié)果表明，胃癌組織中TRIM59 mRNA和蛋白水平較癌旁組織明顯升高，且其高表達(dá)與胃癌患者生存時(shí)間縮短相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)表明，干擾

TRIM59

基因表達(dá)后，胃癌細(xì)胞系的增殖、克隆形成和遷移能力明顯降低，而過表達(dá)TRIM59則反之。TRIM59與p53發(fā)生物理作用，增加其泛素化和降解。機(jī)制研究表明TRIM59可能通過促進(jìn)p53的泛素化和降解，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和生長。本研究首先采用qPCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及配對(duì)的癌旁組織中TRIM59 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明，與癌旁組織相比，TRIM59 mRNA在結(jié)直腸癌組織中顯著高表達(dá)。同時(shí)，本研究的免疫組化檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRIM59在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織。這些結(jié)果提示

TRIM59

可能是一個(gè)原癌基因，其與結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中TRIM59蛋白的表達(dá)與患者的TNM分期、腫瘤浸潤深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，生存分析表明TRIM59高表達(dá)組患者的OS和DFS明顯短于低表達(dá)組患者，說明TRIM59與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，TRIM59高表達(dá)提示結(jié)直腸癌高侵襲性及不良預(yù)后。結(jié)合上述結(jié)果表明，TRIM59在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要的角色，其在結(jié)直腸癌中高表達(dá)提示患者不良預(yù)后，可能對(duì)結(jié)直腸癌的臨床診療及預(yù)后評(píng)估具有一定的參考價(jià)值。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)TRIM59在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并與腫瘤惡性程度和不良預(yù)后密切相關(guān)，為深入研究結(jié)直腸癌的分子標(biāo)志物以及治療靶標(biāo)提供新思路，但本研究僅從mRNA和蛋白水平分析了TRIM59與結(jié)直腸癌的臨床相關(guān)性，TRIM59參與結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展的具體作用分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。