方煜彤，張群琛，洪超群，陳春發(fā)，陳炯玉，張任棟，吳俊東，

（1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院乳腺中心，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗室，廣東 汕頭 515041；3．廣東省乳腺癌診治研究重點實驗室，廣東 汕頭 515041）

miR-221和miR-222（miR-221/222）均為小分子非編碼RNA，能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因mRNA的翻譯，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成，兩者均定位于X染色體，位點相差約1 kb，擁有相同的轉(zhuǎn)錄本和種子序列，具有高度同源性。最近的研究證實，miR-221/222的異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌中，miR-221/222在侵襲性較低的雌激素受體-α（estrogen receptor-α，ER-α）陽性乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，而在高侵襲性ER-α陰性的基底樣乳腺癌細(xì)胞呈高表達(dá)。GATA結(jié)合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）和叉頭框蛋白A1（fork head box protein A1，F(xiàn)OXA1）均為轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)與乳腺管腔上皮細(xì)胞的發(fā)生和維持分化，以及ER-α及孕激素受體（progesterone receptor，PR）的表達(dá)密切相關(guān)。乳腺癌中miR-221/222水平與GATA3及FOXA1表達(dá)的相關(guān)性及可能的作用機(jī)制鮮見報道，因此，本研究通過莖環(huán)引物實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）技術(shù)及免疫組化方法分別檢測了86例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中miR-221/222水平與GATA3和FOXA1蛋白的表達(dá)，分析它們的相關(guān)性及臨床意義；并在5種乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7、T47D、SKBR3、MDA-MB-231和BT-549）中轉(zhuǎn)染miR-221/222 mimics后，采用qPCR檢測各細(xì)胞中miR-221/222的表達(dá)水平；采用Western blot檢測轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞中GATA3、FOXA1、雌激素受體-α（ER-α）和鈣黏蛋白E（E-cadherin）的表達(dá)；用細(xì)胞劃痕和遷移侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞修復(fù)和遷移侵襲能力。從細(xì)胞水平探討miR-221/222對GATA3和FOXA1蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例和標(biāo)本

收集汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院2020年1月—2021年5月經(jīng)手術(shù)切除的86例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及其癌旁組織標(biāo)本，排除有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者。患者均為女性，臨床病理資料完整，年齡37～71歲，中位年齡53歲；其中16例患者接受新輔助治療后手術(shù)，70例患者初始手術(shù)治療；根據(jù)第8版《AJCC癌癥分期手冊》，TNM分期Ⅰ期21例、Ⅱ期57例、Ⅲ期8例。乳腺癌組織標(biāo)本取自癌灶中央組織，癌旁組織取距腫瘤邊緣2 cm以外的乳腺組織。PCR檢測組織采集后加入1 mL RNA later于-80℃保存；免疫組化檢測組織用福爾馬林固定、石蠟包埋，并切成4μm的切片組織。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組轉(zhuǎn)染

5種乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T47D、SKBR3、MDA-MB-231和BT-549均購自上海中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%恒溫箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況隔天更換培養(yǎng)基，3～4 d傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)MCF-7細(xì)胞生長至鋪滿50%孔底面積時按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（購自Invitrogen公司）說明書轉(zhuǎn)染miR-221/222模擬物（miR-221/222 mimics購自中國上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）作為實驗組，設(shè)未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞為陰性對照組。

1.3 RNA提取

細(xì)胞和組織RNA提取均按照RNA提取試劑盒（北京天根生化科技公司）說明書進(jìn)行。在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入1 mL的TRIzol試劑，用取樣器抽打若干次至溶液透明；組織標(biāo)本則為取-80℃保存的標(biāo)本加入1 mL的TRIzol試劑，通過冷凍型高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技公司）進(jìn)行研磨裂解處理。經(jīng)氯仿振蕩離心，異丙醇沉淀，75%乙醇充分漂洗，加入20μL DEPC水溶解。采用NANODROP 2000分光光度儀（賽默飛公司）測定RNA的濃度及純度，其中

D

（260）/

D

（280）在1.8～2.2為合格，可用于后續(xù)實驗。

1.4 qPCR檢測組織和細(xì)胞miR-221/222的相對表達(dá)

采用莖環(huán)引物qPCR檢測5種乳腺癌細(xì)胞系、轉(zhuǎn)染miR-221/222 mimics的MCF-7細(xì)胞、乳腺癌組織及其配對癌旁組織中miR-221/222的表達(dá)水平。逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)均按照PrimeScript試劑盒（大連寶生物工程有限公司）說明書進(jìn)行，引物均由上海生工公司設(shè)計并合成，引物序列見表1。取500 ng總RNA以miR-221/222莖環(huán)RT引物1μL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為37℃、15 min，85℃、5 s，4℃保持，反應(yīng)結(jié)束后-20℃保存。使用CFX96熒光定量PCR儀（美國伯樂公司）進(jìn)行擴(kuò)增，每個樣品重復(fù)3次，反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)條件：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，40個循環(huán)，最后72℃延伸。以U6為內(nèi)參，采用相對定量法計算，以2法計算miR-221/222的相對表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.5 免疫組化及結(jié)果判定

取石蠟切片，置于60℃溫箱中孵育30 min，然后置于二甲苯中脫蠟，梯度乙醇復(fù)水。用EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后，用PBS漂洗切片，0.3%的HO孵育20 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后用羊血清封閉液處理30 min，分別加入GATA3、FOXA1一抗（美國Abcam公司，均按1∶1 000稀釋）后4℃孵育過夜。次日，待切片恢復(fù)室溫，用PBS漂洗，在37℃培養(yǎng)箱中孵化二抗酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物（中國上海基因科技公司）30 min。配制DAB顯色試劑，顯微鏡下控制顯影程度，用PBS漂洗，蘇木素染色細(xì)胞核。清水漂洗后，切片置于梯度酒精和二甲苯中脫水，自然風(fēng)干后用中性樹膠封片。

所有染色切片均由兩名資深病理科醫(yī)師用雙盲法獨(dú)立重復(fù)閱片，以PBS代替一抗作為陰性對照，相同條件下已知陽性片作為陽性對照。GATA3和FOXA1著色部位主要在細(xì)胞核，以細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，采用強(qiáng)度和數(shù)量積分相乘的方法進(jìn)行評價。強(qiáng)度評分為陰性（0分）；弱陽性，淺棕色（1分）；中度陽性，棕色（2分）；強(qiáng)陽性，深棕色（3分）。量化評分為陰性（0分）；＜25%（1分）；25%（含）～50%（2分）；50%（含）～75%（3分）；≥75%（4分）?？偡郑?分陰性（-）；1～4分弱陽性（+）；5～8分陽性（++）；≥9分強(qiáng)陽性（+++）。-和+為低表達(dá)，++和+++為高表達(dá)。

1.6 Western blot檢測蛋白的表達(dá)

采用Western blot檢測對照組和轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞中GATA3、FOXA1、ER-α、E-Cadherin的表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參。收集細(xì)胞樣品，加入預(yù)冷的裂解液于冰上充分裂解約30 min。將裂解液移至1.5 mL離心管中，4℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液于1.5 mL離心管-80℃保存，BCA試劑盒（大連寶生物工程有限公司）檢測蛋白濃度。經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，4℃下100 V恒壓轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉中封閉非特異性抗原 1 h，分別加入GATA3或FOXA1一抗（均為美國Abcam公司，1∶1 000稀釋）、ER-α一抗（北京GeneTeX公司，1∶1 500稀釋）、E-cadherin一抗（北京GeneTeX公司，1∶2 000稀釋）、GAPDH一抗（美國Abcam公司，1∶10 000稀釋）后4℃孵育過夜。次日，加入相應(yīng)二抗（美國CST公司，1∶2 000稀釋），室溫孵育1 h，ECL顯影，化學(xué)發(fā)光成像儀曝光。

1.7 劃痕實驗

實驗組和對照組處理同1.2，兩組MCF-7細(xì)胞分別用胰蛋白酶消化后重懸計數(shù)，鋪在6孔板中，每孔取2×10個細(xì)胞（孔板底部背面提前用marker筆和直尺劃線，每個孔均勻劃5條間隔相等的線）；等細(xì)胞生長到大約鋪滿90%孔底面積時，用100μL的槍頭沿著6孔板背面線垂直劃線，每次保持相同的力度，用PBS水輕輕洗3遍，去除劃下的漂浮細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，劃痕0、48 h后通過計算每個視野的劃痕面積來觀察細(xì)胞修復(fù)能力。

1.8 細(xì)胞遷移和侵襲實驗

分組同1.2，兩組MCF-7細(xì)胞在無血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓處理12 h后分別用胰蛋白酶消化后重懸計數(shù)，取500μL（約2×10個細(xì)胞）細(xì)胞懸液加至8μm的Transwell小室（購自美國BD公司），下室為含10%FBS的培養(yǎng)基。侵襲實驗則用含Matrigel的小室（購自美國BD公司）替代Transwell小室。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用甲醛固定后以0.1%結(jié)晶紫染色，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，計算5個高倍鏡視野（400倍）平均細(xì)胞數(shù)目。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-221/222在乳腺癌組織中的表達(dá)水平及其與GATA3、FOXA1等表達(dá)的相關(guān)性

miR-221/222在乳腺癌中的表達(dá)水平均明顯高于相應(yīng)癌旁乳腺組織，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

=0.00）；miR-221/222表 達(dá) 水 平 在FOXA1、GATA3、ER-α及PR陰性表達(dá)組均顯著高于陽性表達(dá)組（

P

＜0.01），見表2、圖1。

表2 乳腺癌組織中miR-221/222表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

圖1 GATA3和FOXA1在乳腺癌中的表達(dá)

2.2 miR-221/222、GATA3、FOXA1表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

miR-221/222的表達(dá)水平在高增殖指數(shù)組（Ki-67高表達(dá)）、Her-2陽性表達(dá)、三陰性分子亞型顯著高于低Ki-67、Her-2陰性表達(dá)、luminal A及l(fā)uminal B1型乳腺癌（

P

＜0.05）；miR-221/222的表達(dá)水平與患者的年齡、月經(jīng)狀況、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級及TNM分期無明顯相關(guān)關(guān)系（

P

＞0.05），而GATA3、FOXA1高表達(dá)與ER-α及PR陽性、luminal分子亞型相關(guān)（

P

＜0.05），見表2和表3。

表3 乳腺癌組織中GATA3和FOXA1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

2.3 乳腺癌細(xì)胞系中miR-221/222的表達(dá)及轉(zhuǎn)染模擬物后對相關(guān)蛋白的影響

5種乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T47D、SKBR3、MDA-MB-231、BT-549中miR-221/222的表達(dá)情況見圖2A，可見miR-221/222在MCF-7細(xì)胞中均低表達(dá)，故選擇MCF-7細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。在MCF-7細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染miR-221/222 mimics后miR-221/222表達(dá)較陰性對照組顯著升高（

P

＜0.05，圖2B），且內(nèi)源性的GATA3和FOXA1蛋白表達(dá)被抑制，上皮細(xì)胞相關(guān)的分子ER-α和E-cadherin表達(dá)也出現(xiàn)下降（圖2C）。

圖2 乳腺癌細(xì)胞系中miR-221/222的表達(dá)及其對相關(guān)蛋白的影響

2.4 轉(zhuǎn)染miR-221/222模擬物后對MCF-7細(xì)胞修復(fù)、遷徙和侵襲能力的影響

與陰性對照組相比，MCF-7轉(zhuǎn)染miR-221/222 mimics后，高表達(dá)miR-221/222的MCF-7細(xì)胞修復(fù)、遷移和侵襲能力均顯著增強(qiáng)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01，圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-221/222 mimics后MCF-7細(xì)胞修復(fù)、遷移和侵襲能力的變化

3 討論

近年的研究顯示miR-221和/或miR-222在眾多惡性腫瘤如肝細(xì)胞癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤等癌組織或癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁正常組織或正常細(xì)胞。在本研究中，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織的miR-221/222也顯著高于癌旁組織，與文獻(xiàn)[11-12]報道結(jié)果一致。miR-221/222在惡性腫瘤中水平的異常增高可能通過其與靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，通過信號激活、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管生成機(jī)制，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，以及侵襲遷移過程中起重要作用。

GATA3是鋅指DNA結(jié)合蛋白GATA家族的成員，在乳腺癌中與ER-α的表達(dá)相關(guān)，特別是在腔內(nèi)亞型（luminal）中，GATA3是調(diào)節(jié)乳腺形態(tài)發(fā)生和腔內(nèi)細(xì)胞分化的必需因子。在本研究中，GATA3在ER-α/PR陽性的luminal亞型乳腺癌中的表達(dá)顯著高于ER-α/PR陰性乳腺癌，與文獻(xiàn)報道一致，GATA3蛋白的高表達(dá)與luminal亞型乳腺癌分化好、低侵襲和預(yù)后好相關(guān)。FOXA1是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，也已被確定為ER-α相關(guān)調(diào)控通路的關(guān)鍵元件，其高表達(dá)與ER-α陽性預(yù)后好的luminal亞型乳腺癌相關(guān)，本研究結(jié)果亦顯示FOXA1的高表達(dá)與ER-α/PR陽性的luminal亞型乳腺癌顯著相關(guān)。GATA3和FOXA1均與雌激素受體表達(dá)相關(guān)，GATA3/FOXA1/ER-α網(wǎng)絡(luò)是ER-α發(fā)揮功能的必需因子。而本研究在乳腺癌組織中的miR-221/222水平升高與GATA3、FOXA1的低表達(dá)以及ER-α/PR陰性表達(dá)顯著相關(guān)。另外本研究在細(xì)胞水平也顯示轉(zhuǎn)染miR-221/222模擬物后引起GATA3、FOXA1和ERα的表達(dá)下降，提示miR-221/222對GATA3、FOXA1以及ER-α表達(dá)可能有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。而最近的研究也發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中miR-221/222的過表達(dá)可下調(diào)ER-α的表達(dá)，而下調(diào)miR-221/222可以部分恢復(fù)ER-α的表達(dá)和對他莫昔芬的敏感性，抑制miR-221/222可以增加ER-α陽性的MCF-7細(xì)胞對他莫昔芬的敏感性。miR-221/222對GATA3、FOXA1、ER-α以及PR表達(dá)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實，抑制miR-221/222的表達(dá)有可能成為逆轉(zhuǎn)臨床上內(nèi)分泌耐藥的潛在治療靶點。

本研究結(jié)果還表明miR-221/222的表達(dá)水平在高增殖指數(shù)組（Ki-67高表達(dá)）、三陰性和Her-2陽性表達(dá)分子亞型乳腺癌組織中顯著高于低Ki-67、luminal A及l(fā)uminal B1型乳腺癌。文獻(xiàn)[22-23]報道m(xù)iR-221/222在高侵襲性三陰性乳腺癌中顯著高表達(dá)，其通過下調(diào)細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1和周期蛋白依賴性激酶抑制因子1B促進(jìn)癌細(xì)胞進(jìn)入S期，并通過靶向磷酸酶和張力蛋白同源物/蛋白激酶B（PTEN/Akt）通路促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞的自我更新，從而增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲能力。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了miR-221/222模擬物的MCF-7乳腺癌細(xì)胞，其劃痕修復(fù)能力和遷移侵襲能力均顯著增強(qiáng)。另本研究結(jié)果顯示，miR-221/222的表達(dá)水平在Her-2陽性表達(dá)分子亞型乳腺癌中顯著升高，這與Miller等研究結(jié)果一致。在Her-2陽性乳腺癌細(xì)胞中，miR-221/222高表達(dá)水平可通過多種途徑促進(jìn)乳腺癌的侵襲性，Her-2還通過miR-221/222誘導(dǎo)ESR1下調(diào)，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞對內(nèi)分泌治療的耐藥性。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-221/222表達(dá)水平較癌旁正常乳腺組織表達(dá)明顯上調(diào)，與Her-2陽性表達(dá)、三陰性乳腺癌亞型和Ki-67高表達(dá)顯著相關(guān)。乳腺癌細(xì)胞中miR-221/222高表達(dá)則GATA3和FOXA1蛋白表達(dá)被抑制，且ER-α和E-cadherin表達(dá)明顯下降，劃痕修復(fù)能力和遷移侵襲能力均明顯增強(qiáng)。miR-221/222可能通過下調(diào)GATA3、FOXA1、ER-α的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌的生長、遷移和侵襲，miR-221/222可能成為乳腺癌預(yù)后判斷的潛在標(biāo)志物和抑制侵襲轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點。