邱宏聰，賴克道，梁 冰，王 麗，黃 艷,2，劉布鳴,2

(1.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西南寧 530022; 2.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530022)

0 引言

免疫系統(tǒng)最重要的核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)廣泛存在于多細(xì)胞有機(jī)體中，主要通過調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄參與免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞黏附等過程。NF-κB信號(hào)通路的異常激活通常會(huì)介導(dǎo)多種慢性炎癥的發(fā)生[1,2]，而通路相關(guān)蛋白的突變則會(huì)導(dǎo)致遺傳性疾病的出現(xiàn)或免疫病變，因此開展NF-κB信號(hào)通路的研究，在臨床炎癥的治療中具有深刻的應(yīng)用前景。

崗松富含槲皮素、楊梅素等黃酮組分[3-7]。崗松總黃酮(GSH)為本課題組開發(fā)的專利產(chǎn)品[8]，對(duì)體外培養(yǎng)的宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲具有明顯的抑制作用，并促進(jìn)其凋亡[9]，且能顯著抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中TNF-α及IL-6含量，下調(diào)iNOS、COX-2蛋白表達(dá)[10]。本研究將繼續(xù)深入考察GSH對(duì)炎癥因子IL-1β、IL-8、TGF-β，以及NF-κB信號(hào)通路中IκBα、NF-κB p65表達(dá)的影響，探討GSH抗炎活性可能的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)

小鼠RAW264.7單核巨噬細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，接種于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青/鏈霉素的dMEM培養(yǎng)基中，然后置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 藥品與試劑

崗松藥材采收于廣西北海市，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院姜平川研究員鑒定為崗松(BaeckeafrutescensL.)的干燥莖葉。MTT(SIGMA)，IL-1β、IL-8、TGF-β ELISA試劑盒(RB公司)，TRIZOL、TAQ、RNASE INHIB.、dNTP試劑(Life公司),β-actin抗體(江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司),RIPA細(xì)胞裂解液(Thermo公司),PBS、蛋白酶抑制劑(Solarbio公司),預(yù)染蛋白marker(Formentas公司)；IκBα抗體(CST公司),堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),堿性磷酸酶顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),超純水；其他試劑為分析純。

1.1.3 儀器

酶標(biāo)儀(Thermo 公司),QPCR(ROCHE公司),離心機(jī)(Eppendorf公司),Fastprep破碎儀(Mpbio公司),電泳儀(BIO-RAD公司),半干轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 GSH的制備[11,12]

將崗松莖葉用70%乙醇(固液比1∶16)進(jìn)行3次提取，每次提取時(shí)間為60 min，過濾合并濾液并濃縮，使崗松提取藥液的生藥含量為0.3 g·mL-1。用AB-8型大孔吸附樹脂填裝柱子，將崗松提取藥液上柱(1 BV·h-1流速、3 BV體積)，用50%乙醇洗脫(2 BV·h-1流速、5 BV用量)，濃縮，干燥，即得崗松總黃酮(GSH)。將GSH 用DMSO溶解，配制成50,100,200 μg·mL-1溶液，備用于細(xì)胞試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理

取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)0.25 g·L-1胰蛋白酶EDTA消化細(xì)胞后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106個(gè)·mL-1，并接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組分別為空白對(duì)照組(以無血清DMEM孵育)；LPS模型組(加入0.1 μg·mL-1LPS孵育24 h)；GSH組(設(shè)置GSH含量為50,100,200 μg·mL-13個(gè)劑量組，即GSH50、GSH100、GSH200)，先GSH預(yù)處理細(xì)胞2 h后，再加入0.1 μg·mL-1LPS孵育24 h，待測。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性

分組處理后的細(xì)胞，首先置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄上清液；接著向每孔加入終質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的MTT溶液100 μL，并將96孔板移至培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，吸棄上清液；然后，每孔加入200 μL DMSO溶液，置搖床上50 r/min震蕩10 min；最后，于酶標(biāo)儀上490 nm波長處測定各孔的吸光度。

1.2.4 ELISA法測定細(xì)胞中IL-1β、IL-8、TGF-β含量

取預(yù)處理后的細(xì)胞上清液，參照ELISA試劑盒說明書的要求操作，測定IL-1β、IL-8、TGF-β的含量。

1.2.5 WB法檢測細(xì)胞中IκBα蛋白的相對(duì)表達(dá)量

分組處理后的細(xì)胞用冰PBS洗滌，加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑并收集細(xì)胞，經(jīng)超聲破碎后離心處理15 min (12 000 r·min-1，4℃)，取上清液待用。采用電泳分離，每孔加25 μg上清液進(jìn)行上樣，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，脫脂牛奶封閉，分別用一抗(IκBα、β-actin)孵育過夜，洗膜后，接著用二抗孵育，再次洗膜，顯影。通過密度分析測定蛋白含量，目的蛋白的相對(duì)含量=目的蛋白密度/β-actin的密度。

1.2.6 QPCR檢測細(xì)胞中NF-κB p65的mRNA基因表達(dá)

分組處理后的細(xì)胞采用Trizol一步法抽提總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，其中，總RNA 5 μL、50 μmol·L-1Oligo(dT) 0.5 μL、10 μmol dNTP 1 μL、DEPC 水1 μL。β-actin引物序列：正向引物5′-CATTGTCACCAACTGGGACGATA-3′，反向引物5′-GGATGGCTACGTACATGGCTG-3′； NF-κB p65引物序列：正向引物5′-CACCAAGGATCCACCTCACC-3′，反向引物5′-AATGGCTTGCTCCAGGTCTC-3′。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，反應(yīng)條件為95℃ 30 s，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95℃ 10 s，60℃ 30 s，70℃ 45 s)，循環(huán)完成后測定NF-κB p65的mRNA表達(dá)水平。采用相對(duì)定量研究分析法，以2-△△Ct比較各組之間NF-κB p65 mRNA 表達(dá)的差異。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞增殖活性的檢測

由表1可見，LPS組細(xì)胞存活率顯著低于空白對(duì)照組，表明LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞具有抑制作用。不同濃度的GSH對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，細(xì)胞存活率均有提高。

表1 GSH對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響Table 1 Effects of GSH on cell proliferation activity n=6)

2.2 IL-1β、IL-8、TGF-β含量的測定

由表2可見，正常RAW264.7細(xì)胞上清液的IL-1β、IL-8、TGF-β含量較低，給予0.1 μg·mL-1LPS刺激后，IL-1β、IL-8以及TGF-β含量均顯著增加，而用50-200 μg·mL-1崗松總黃酮預(yù)處理細(xì)胞后，IL-1β、IL-8以及TGF-β均受到明顯抑制(P<0.01)。

表2 GSH對(duì)IL-1β、IL-8、TGF-β的影響Table 2 Effects of GSH on IL-1β、IL-8、TGF-β

2.3 IκBα蛋白相對(duì)表達(dá)的檢測

空白R(shí)AW264.7細(xì)胞IκBα表達(dá)較高，給予0.1 μg·mL-1LPS刺激后，IκBα表達(dá)明顯降低，用不同濃度的GSH預(yù)處理細(xì)胞后，與LPS組比較，IκBα表達(dá)顯著回升(P<0.05或P<0.01)，表明GSH能有效上調(diào)炎癥細(xì)胞中IκBα的表達(dá)(圖1和圖2)。

M:預(yù)染蛋白Marker Pre-stained protein marker；1:空白對(duì)照組Blank control group；2:LPS組LPS group；3:GSH50;4:GSH100;5:GSH200圖1 GSH對(duì)IκBα蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of GSH on the expression of IκBα

與LPS組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01Compared with LPS group,*indicates P<0.05，**indicates P<0.01圖2 IκBα蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of IκBα

2.4 NF-κB p65擴(kuò)增曲線和溶解曲線

擴(kuò)增曲線和溶解曲線見圖3-6。從擴(kuò)增曲線可以看出，熒光強(qiáng)度和初始拷貝數(shù)呈良好的線性關(guān)系。溶解曲線峰值單一，沒有雜峰，表明QPCR產(chǎn)物純度較高，反應(yīng)具有良好的特異性。

圖3 β-actin擴(kuò)增曲線Fig.3 Amplification curve of β-actin

圖4 NF-κB p65擴(kuò)增曲線Fig.4 Amplification curve of NF-κB p65

圖5 β-actin溶解曲線Fig.5 Solubility curve of β-actin

圖6 NF-κB p65溶解曲線Fig.6 Solubility curve of NF-κB p65

2.5 NF-κB p65的mRNA表達(dá)水平的檢測

GSH對(duì)NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平的影響結(jié)果見表3及圖7。結(jié)果表明，空白R(shí)AW264.7細(xì)胞NF-κB p65表達(dá)較低，給予0.1 μg·mL-1LPS刺激后，表達(dá)明顯增強(qiáng);用不同濃度的GSH預(yù)處理細(xì)胞后，與LPS組比較，表達(dá)受到明顯的抑制(P<0.01)，表明GSH能有效抑制炎癥細(xì)胞中NF-κB p65的過度表達(dá)。

表3 GSH對(duì)NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平的影響 n=6)Table 3 Effects of GSH on NF-κB p65 mRNA expression

與LPS組比較，**表示P<0.01Compared with LPS group，**indicates P<0.01圖7 NF-κB p65的mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression of NF-κB p65 mRNA

3 討論

本課題組通過建立LPS刺激RAW264.7細(xì)胞體外模型[13-15]，評(píng)價(jià)GSH對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響，采用ELISA、Western bloting 等方法，分析GSH對(duì)相關(guān)炎癥因子(IL-1、IL-6、TGF-β、TNF-α等)和蛋白( iNOS和COX-2等)表達(dá)水平的影響。前期實(shí)驗(yàn)已證明GSH能顯著抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞中TNF-α及IL-6含量[10]，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證：50 μg·mL-1劑量的GSH已經(jīng)能顯著抑制IL-1β、IL-8、TGF-β等炎癥因子，并能夠顯著上調(diào)IκBα蛋白表達(dá)，表明GSH具有良好的抗炎活性。本實(shí)驗(yàn)β-actin和NF-κB p65溶解峰都為單峰，說明本實(shí)驗(yàn)的PCR擴(kuò)增為特異性擴(kuò)增；同時(shí)，定量檢測結(jié)果顯示，GSH能夠抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA表達(dá)。

綜上，GSH可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖(P<0.05)，抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-8、TGF-β含量，上調(diào)IκBα蛋白表達(dá)，抑制NF-κB p65 mRNA表達(dá)，表明GSH可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路，抑制下游炎癥因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎活性作用。因此，抑制NF-κB信號(hào)通路可能是GSH發(fā)揮抗炎活性的一個(gè)作用靶點(diǎn)。然而，其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。