曹彥強(qiáng)，張中峰，徐廣平，滕秋梅，蔣先軍

(1.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715；2.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西喀斯特植物保育與恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541006)

0 引言

細(xì)菌作為微生物的重要組成部分，其在有機(jī)質(zhì)分解、腐殖質(zhì)形成等諸多土壤生態(tài)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。目前，細(xì)菌的生態(tài)特性已逐漸成為評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，可用于指示土壤的肥力形成及其演變過(guò)程[1]。水稻土是我國(guó)重要的耕作土壤之一，也是耕地土壤中最為高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的類型，約占全國(guó)耕地面積的1/5。但是，水稻土的形成狀態(tài)深受人為活動(dòng)的影響[2]。例如，盡管化肥施入土壤帶來(lái)了作物的增產(chǎn)，但是會(huì)造成土壤板結(jié)、酸化和生物性狀下降等生態(tài)環(huán)境問(wèn)題[3，4]。土壤細(xì)菌對(duì)環(huán)境條件具有較高敏感性，其結(jié)構(gòu)和功能的改變能夠有效指示化肥施用下土壤環(huán)境或植被的變化。因此，近年來(lái)通過(guò)長(zhǎng)期定位試驗(yàn)來(lái)探究施肥對(duì)土壤細(xì)菌影響的研究受到人們的廣泛關(guān)注。陸海飛等[5]研究表明，與不施肥對(duì)照相比，有機(jī)/無(wú)機(jī)肥配施下土壤細(xì)菌的香農(nóng)指數(shù)和豐富度指數(shù)顯著增大；邢亞薇等[6]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time PCR)技術(shù)發(fā)現(xiàn)黃土旱塬農(nóng)田單施化肥處理的細(xì)菌數(shù)量較不施肥裸地增加21%，pH、全氮和有機(jī)碳含量是影響土壤微生物群落豐度的重要因子；劉佳等[7]以祁陽(yáng)紅壤實(shí)驗(yàn)站的冬小麥-夏玉米定位試驗(yàn)為研究對(duì)象，結(jié)果表明長(zhǎng)期不同施肥方式改變了旱地紅壤優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)豐度，長(zhǎng)期施肥后旱地紅壤細(xì)菌群落主要受土壤pH的影響。

由于獨(dú)特的水分管理措施，水稻土細(xì)菌群落組成與其他耕作土壤的相比表現(xiàn)出諸多差異，但目前關(guān)于長(zhǎng)期施肥下水稻土細(xì)菌群落變化的研究相對(duì)較少[8]。本研究依托1989年西南大學(xué)建立的中性紫色水稻土長(zhǎng)期定位試驗(yàn)站，針對(duì)不施肥(CK)和施用化肥(CF)兩種不同處理下的水稻土，通過(guò)MiSeq高通量測(cè)序，研究30年長(zhǎng)期施肥對(duì)水稻土壤細(xì)菌的影響規(guī)律。由于氮素是植物生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的養(yǎng)分元素，氮肥是最主要的化肥施用類型[9]，因此本研究特意設(shè)置為期56 d的室內(nèi)氮添加試驗(yàn)，探究短期高強(qiáng)度氮添加對(duì)水稻土細(xì)菌群落的影響，以便深入了解長(zhǎng)期施肥對(duì)水稻土細(xì)菌多樣性、群落結(jié)構(gòu)和組成的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土壤樣品采集地點(diǎn)位于國(guó)家紫色土長(zhǎng)期定位試驗(yàn)基地(106°26′E，30°26′N)，長(zhǎng)期定位試驗(yàn)始于1989年。于2019采集不施肥、施用化肥兩種水稻土樣品(分別用CK、CF表示)，其中年施肥量為尿素273.1 kg·hm-2，過(guò)磷酸鈣500.3 kg·hm-2，氯化鉀150.1 kg·hm-2。土壤樣品裝入無(wú)菌袋中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，篩出碎石等雜物后在4℃冰箱暫存，用于后續(xù)分析測(cè)定以及室內(nèi)氮添加試驗(yàn)。

1.2 短期氮添加試驗(yàn)

采用室內(nèi)培養(yǎng)的方法，根據(jù)土壤含水量稱取過(guò)2 mm篩的鮮土(以10.00 g干重計(jì))置于150 mL的玻璃廣口瓶。對(duì)不施肥水稻土和施肥水稻土每周分別添加氮濃度為50 mg·kg-1的CO(NH2)2。通過(guò)均勻添加無(wú)菌水調(diào)節(jié)土壤水分含量至田間持水量(WHC)的60%，并在培養(yǎng)過(guò)程中每隔7 d以稱重法補(bǔ)充蒸發(fā)損失的水分以保持土樣的水分含量恒定。將廣口瓶置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)56 d。培養(yǎng)結(jié)束后取樣，并與原始土壤樣品一起進(jìn)行高通量測(cè)序。使用CK+N和CF+N分別表示兩種水稻土加氮培養(yǎng)56 d后的土壤樣品。

1.3 土壤基本性質(zhì)分析

1.4 土壤DNA的提取、高通量測(cè)序

本試驗(yàn)所采用的DNA提取試劑盒為Fast DNA?SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals)，并使用微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000 UV-Vis)測(cè)定DNA濃度。使用引物F515 (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和R907(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V4-V5區(qū)域基因進(jìn)行擴(kuò)增；PCR反應(yīng)程序?yàn)?8℃預(yù)變性1 min，98℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)。應(yīng)用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，并委托上海美吉生物科技有限公司完成。測(cè)序原始序列上傳至NCBI的SRA (Sequence Read Archive)數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為SRP259259。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2010、SPSS 13、R software (Version 3.1.1)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin 8.5軟件作圖，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(ɑ=0.05)，用Spearman法進(jìn)行相關(guān)分析。利用Mothur軟件(version 1.31.2)分析α多樣性指數(shù)(Chao1和Shannon指數(shù))?；贐ray-Curtis距離矩陣的主坐標(biāo)分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)計(jì)算不同處理下土壤細(xì)菌組成的差異性(β多樣性)。使用冗余分析(Redundancy Analysis,RDA)闡明影響土壤細(xì)菌群落的關(guān)鍵環(huán)境因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下土壤化學(xué)性質(zhì)

表1 不同土壤理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of different soil

2.2 土壤細(xì)菌多樣性

水稻土樣品高通量測(cè)序共獲得313 581條優(yōu)質(zhì)序列，以97%相似性閾值進(jìn)行Operational Taxonomic Unit (OUT)聚類，在CK、CF、CK+N和CF+N處理中分別得到1 349，1 624，1 301，1 524個(gè)OUT (表2)。Chao1指數(shù)通常用來(lái)描述群落豐富度，CF處理下的Chao1指數(shù)顯著高于CK處理(P<0.05)。短期氮添加后Chao1指數(shù)與未加氮土樣相比并未產(chǎn)生顯著差異。對(duì)于Shannon指數(shù)，呈現(xiàn)出與Chao1指數(shù)類似的變化，CF處理相較于CK處理顯著提高了水稻土壤細(xì)菌群落多樣性(P<0.05)。

表2 細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)表(97%序列相似性)Table 2 Alpha diversity index table of bacterial community (97% sequence similarity)

不同處理間水稻土細(xì)菌群落組成差異的PCoA分析結(jié)果如圖1所示。在OTU水平上，PCoA1與PCoA2分別解釋變量方差為43.16%和11.42%，累計(jì)解釋度達(dá)54.58%，PCoA1可將CK和CK+N的細(xì)菌群落與CF、CF+N明顯區(qū)分開。56 d氮添加后的土壤樣品與原始土樣相比分離距離較小，未明顯分開，短期施氮對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響較小。

圖1 不同處理土壤細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析(PCoA)Fig.1 Principal co-ordinate analysis (PCoA) of soil bacterial community under different treatments

2.3 土壤細(xì)菌群落物種組成

如圖2所示，在門水平上統(tǒng)計(jì)各樣本物種豐度，水稻土中的優(yōu)勢(shì)菌門(>1%)包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、浮霉菌門(Planctomycetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。在CK處理中，上述優(yōu)勢(shì)菌門的平均相對(duì)豐度分別為27.26%、19.04%、17.01%、14.42%、6.06%、5.69%、3.09%、1.93%和1.25%。在CF處理中，Proteobacteria、Planctomycetes和Bacteroidetes的平均相對(duì)豐度顯著高于CK處理(P<0.05)；而Actinobacteria、Acidobacteria、Gemmatimonadetes和Firmicutes呈現(xiàn)出相反的情況。在所有樣品中，Proteobacteria、Acti-nobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi的總占比均超過(guò)70%，其中Proteobacteria的相對(duì)豐度均為最高。比較CK和CK+N可知，56 d的室內(nèi)氮添加明顯提高了不施肥水稻土中Proteobacteria和Bacteroidetes的相對(duì)豐度(P<0.05)；對(duì)比CF和CF+N，短期氮添加顯著提升了施肥水稻土中Nitrospirae的相對(duì)豐度(P<0.05)。

不同小寫字母代表處理間差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P<0.05)圖2 土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundances of the dominant bacterial species in soil

2.4 土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性

表3 土壤環(huán)境因子與細(xì)菌多樣性指數(shù)、優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度之間的相關(guān)性系數(shù)Table 3 Correlation coefficient between soil environmental factors and bacterial diversity indices and relative abundance of dominant phyla

圖3 土壤細(xì)菌群落組成與環(huán)境變量的RDA分析Fig.3 Redundancy analysis (RDA) of soil bacterial community composition and environmental variables

3 討論

在本研究中，水稻土細(xì)菌群落的α多樣性(Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù))在施肥處理下有所提高，而有研究報(bào)道稱長(zhǎng)期施肥導(dǎo)致土壤微生物多樣性降低[18，19]，這種差異可能源于施肥時(shí)間跨度的不同。另外，土壤細(xì)菌多樣性對(duì)肥料施用的響應(yīng)并不一致，它們會(huì)隨著施肥方式、輪作、土壤類型、土地利用方式和其他因素的變化而有所不同[20，21]。一項(xiàng)調(diào)查45年稻田試驗(yàn)中細(xì)菌群落演變的研究表明，長(zhǎng)期施肥并未對(duì)水稻土微生物結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響[22]。細(xì)菌多樣性由pH主導(dǎo)，化肥施用導(dǎo)致的土壤酸化使得細(xì)菌多樣性降低[23]。相較于其他研究，本研究中pH值的波動(dòng)較小，且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)水平明顯提高；Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)在氮添加前后并未產(chǎn)生顯著變化(表2)，表明短期氮添加對(duì)于土壤細(xì)菌α多樣性影響較小。

pH是決定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵生態(tài)因子[7]，而土壤養(yǎng)分作為微生物生存發(fā)展的必要營(yíng)養(yǎng)元素，在土壤中的有效性也成為影響或制約土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因子[26]。本研究中，pH、AP、AK等環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與組成產(chǎn)生重要影響，這與大多數(shù)研究結(jié)果吻合[23,27]。

4 結(jié)論

綜上所述，長(zhǎng)期施肥處理能夠影響水稻土壤pH、養(yǎng)分、土壤細(xì)菌多樣性、群落組成和結(jié)構(gòu)；短期氮添加對(duì)土壤細(xì)菌多樣性特征影響較小。Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi在此次試驗(yàn)水稻土中的占比超過(guò)70%。土壤pH和營(yíng)養(yǎng)狀況(例如AP、AK、TP和TN等)是影響重慶地區(qū)水稻土細(xì)菌群落形成的主要驅(qū)動(dòng)因子。在未來(lái)工作中，探究不同施肥處理間土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異及其原因，可為保持土壤微生物多樣性及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等提供重要的理論和實(shí)踐依據(jù)。