李 玉，徐永貴，董 蓉，郭佳欣，金寶丹，趙建國**

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)，環(huán)境污染治理與生態(tài)修復(fù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450001；2.河南省對外科技交流中心，河南鄭州 450001)

0 引言

氯酚類化合物作為前體或中間體被廣泛用于制藥、防腐和殺菌等工業(yè)生產(chǎn)過程，在一些工業(yè)廢水中氯酚類污染物含量高達(dá)幾十甚至上百毫克，而在受這些工業(yè)廢水污染的市政水體中也檢測出含量為微克至毫克級別的的氯酚類污染物[1-3]。氯酚類化合物由于具有顯著的生態(tài)毒性和可持續(xù)性，會通過食物鏈富集，被認(rèn)定為優(yōu)先控制的污染物。我國也將多種氯酚類化合物列為常規(guī)水質(zhì)監(jiān)測項目[3,4]。因此，如何有效處理氯酚廢水受到廣泛關(guān)注。

由于氯酚廢水中污染物成分和物理化學(xué)特性等較為復(fù)雜，物理和化學(xué)工藝通常難以充分去除該類污染物，且可能會產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[5]?；钚晕勰喙に嚦杀据^低，耐受污染物沖擊，在廢水處理過程中起重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氯酚類污染物馴化后，活性污泥中降解氯酚的優(yōu)勢菌屬富集；為避免氯酚類污染物對活性污泥的沖擊，可通過投加易降解碳源的方式實現(xiàn)廢水中氯酚的共代謝去除[3]。為抵抗氯酚類污染物對微生物的毒性作用，微生物代謝過程中分泌的胞外聚合物及蛋白質(zhì)含量顯著增加，而通過蛋白質(zhì)可實現(xiàn)廢水中污染物的降解[6]。微生物代謝過程中的脫氫酶(Dehydrogenase，DHA)活性可用于評估污染物的降解情況，過氧化氫酶(Catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)可清除自由基，避免其對微生物的損傷，故污泥性能可通過分析不同酶活性來評估[7]。但不同濃度的氯酚類污染物降解過程對污泥性能和菌群結(jié)構(gòu)的影響仍需深入分析?；诖耍狙芯恳约状紴楣泊x碳源，利用序批式生物反應(yīng)器(Sequencing Batch Reactor，SBR)處理2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)模擬廢水，通過逐步提高2,4,6-TCP濃度的方式馴化活性污泥，探討2,4,6-TCP廢水處理過程對污泥性能和菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期為氯酚廢水的處理提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器

試劑：磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、重鉻酸鉀、硫酸汞、硫酸銀、硫酸亞鐵銨、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、試亞鐵靈、硫酸亞鐵、蒽酮、高錳酸鉀、氯化三苯基四氮唑、鹽酸、硫酸、過氧化氫、冰醋酸等均為國產(chǎn)分析純。2,4,6-TCP為Tokyo化工有限公司生產(chǎn)的分析純。甲醇(純度≥99.9%)為國產(chǎn)色譜純。

儀器：電子分析天平(FA1104N型，上海雙旭電子有限公司)、高速冷凍離心機(jī)(TGL-20bR型，上海安亭科學(xué)儀器廠)、數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9030MBE型，上海博迅實業(yè)有限公司)、紫外可見分光光度計(UV1102型，上海天美科技有限公司)、超純水機(jī)(ELGA型，威立雅水處理技術(shù)上海有限公司)、高效液相色譜儀(LC-20ATVP型，日本島津公司)、恒溫振蕩器(SHZ-82型，金壇市城西天竟實驗儀器廠)、便攜式溶氧儀(YSI型，美國YSI公司)、超聲波處理器(FS-300型，上海生析超聲儀器有限公司)。

1.1.2 接種污泥與模擬廢水

實驗所用污泥取自當(dāng)?shù)厥姓鬯幚韽S的好氧池污泥，用自來水清洗3次后接種到圓柱形SBR，SBR的有效體積為5 L，直徑和高度分別為20和25 cm。調(diào)整SBR的初始混合液懸浮固體(Mixed Liquor Suspended Solids,MLSS)為(2 500±200)mg/L。模擬廢水中的碳源由甲醇提供，進(jìn)水化學(xué)需氧量(Chemical Oxygen Demand，COD)調(diào)整為350 mg/L左右。另外，補(bǔ)充廢水中微生物代謝所需的氮、磷和微量元素，其具體成分及濃度詳見表1。進(jìn)水pH值通過NaHCO3和稀HCl調(diào)整為7.2±0.4。

表1 模擬廢水中補(bǔ)充的氮、磷和微量元素Table 1 Supplied nitrogen,phosphorus,and microelements in the simulated wastwater

1.2 方法

1.2.1 SBR的運(yùn)行

控制SBR的水力停留時間(Hydraulic Retention Time,HRT)為8 h，包括進(jìn)水0.15 h，運(yùn)行7.00 h，靜置0.70 h和排水0.15 h。SBR運(yùn)行期間采用間歇曝氣模式，曝氣與不曝氣時間比為2 h∶2 h，曝氣期間通過便攜式溶氧儀控制廢水中溶解氧(Dissolved oxygen，DO)為(1.5±0.5) mg/L，并通過攪拌將DO與污泥充分接觸，不曝氣期間停止攪拌。通過定時排泥的方式控制MLSS在(2 500±300) mg/L左右。

當(dāng)采用未補(bǔ)充2,4,6-TCP的模擬廢水馴化活性污泥，且出水COD低于50 mg/L時，該模擬廢水中補(bǔ)充濃度為10 mg/L的2,4,6-TCP (1-56 d)。當(dāng)SBR經(jīng)過一段時間馴化，且運(yùn)行結(jié)束后出水COD趨于穩(wěn)定、水相和泥相中檢測不到2,4,6-TCP時，依次將廢水中的2,4,6-TCP濃度提高至30和50 mg/L，其運(yùn)行時間分別為57-98 d和99-147 d，同時降低廢水中甲醇濃度以維持進(jìn)水COD濃度在350 mg/L左右。在整個SBR運(yùn)行過程中，定期檢測出水COD、水相和泥相中2,4,6-TCP濃度的變化，以及分析污泥中多糖和蛋白質(zhì)含量、不同酶活性和微生物多樣性的變化，并與未投加2,4,6-TCP時的污泥絮體作對比。

1.2.2 測定項目

COD、MLSS和2,4,6-TCP的測定：SBR運(yùn)行周期末，取上清液離心，采用酸性重鉻酸鉀法測定獲得的上清液中COD含量，即為出水COD；MLSS通過重量法測定，具體測定方法詳見《水與廢水監(jiān)測分析方法》(第四版)[8]；2,4,6-TCP采用高效液相色譜儀測定，水相中2,4,6-TCP通過0.45 μm濾膜過濾后直接測定，泥相中2,4,6-TCP通過超聲萃取的方法提取，而后通過0.45 μm濾膜過濾后測定。

多糖和蛋白質(zhì)的測定：當(dāng)SBR處理不同濃度2,4,6-TCP進(jìn)水且處于穩(wěn)定運(yùn)行階段末期時，取混合均勻的泥水混合液在4 000 r/min條件下離心5 min,棄上清液，用磷酸緩沖液重懸至原體積后置于冰水浴中超聲10 min (功率240 W，超聲4 s，停4 s)，在12 000 r/min和4℃條件下離心10 min后取上清液。上清液中的多糖含量采用蒽酮比色法測定，蛋白質(zhì)含量采用Lowry法蛋白質(zhì)試劑盒測定，具體操作步驟按照說明書執(zhí)行。每個樣品重復(fù)3次。

酶活性的測定：當(dāng)SBR處理不同濃度2,4,6-TCP進(jìn)水且處于穩(wěn)定運(yùn)行階段末期時，取混合均勻的泥水混合液在12 000 r/min和4℃條件下離心5 min，棄上清液，用磷酸緩沖液重復(fù)清洗3次后離心，所得污泥用于酶活性的測定。CAT活性通過高錳酸鉀滴定法測定[7]；DHA活性通過加入氯化三苯基四氮唑的方法測定[7]；SOD活性利用購自南京建成科技有限公司的試劑盒測定。每個樣品重復(fù)3次。

1.2.3 微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

（4）重砂異常標(biāo)志：礦區(qū)主要的鈮鉭礦脈與鈮鉭鈹重砂異常暈圈長軸方向基本吻合, 鈮鉭鈹?shù)认∮薪饘僦厣爱惓？梢宰鳛橹匾恼业V標(biāo)志。

當(dāng)處理不同濃度2,4,6-TCP進(jìn)水的SBR處于不同運(yùn)行條件時，利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取污泥中基因組DNA。細(xì)菌16s RNA擴(kuò)增上游引物(357-F)和下游引物(518r)序列(5′→3′)為357F：CCTACGGGAGGCAGCAG；518r：ATTACCGCGGCTGCTGG。依據(jù)BioLinker公司提供的說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過40%-60%的變形梯度凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后對凝膠染色，拍照。采用Quantity-One軟件對膠圖進(jìn)行分析，通過香農(nóng)指數(shù)和戴斯系數(shù)分別評估不同污泥樣品的微生物多樣性和相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 出水COD和2,4,6-TCP濃度的變化

運(yùn)行初期，10 mg/L的進(jìn)水2,4,6-TCP嚴(yán)重抑制污泥活性，出水COD急劇升高，在第13天時達(dá)到194.7 mg/L(圖1a)，前20 d的進(jìn)水2,4,6-TCP去除較慢，水相和泥相中殘留高濃度的2,4,6-TCP(圖1b)，這說明2,4,6-TCP的毒性作用顯著抑制微生物活性，降解2,4,6-TCP的功能菌屬未能充分富集。隨著運(yùn)行時間的延長，降解2,4,6-TCP的功能菌屬富集，污泥活性逐漸恢復(fù)，出水COD降低，在40-55 d趨于穩(wěn)定，平均為45 mg/L。進(jìn)水2,4,6-TCP也逐漸被降解去除，40 d后水相和泥相中基本無2,4,6-TCP的殘留。

圖1 出水COD及水相和泥相中2,4,6-TCP隨運(yùn)行時間的變化Fig.1 Variation of effluent COD and 2,4,6-TCP both in aqueous and sludge phases with operation time

此后，提高進(jìn)水2,4,6-TCP濃度為30和50 mg/L時，出水COD均在運(yùn)行初期有短暫的升高(51-78 d和99-110 d)，其濃度最高達(dá)到124 mg/L (71 d)，而后快速降低并趨于穩(wěn)定，在81-98 d和113-147 d的平均濃度分別為62和56 mg/L。相應(yīng)地，進(jìn)水2,4,6-TCP也被快速降解去除，水相和泥相中殘留的2,4,6-TCP隨運(yùn)行時間的延長而顯著降低。推斷低濃度的進(jìn)水2,4,6-TCP (10 mg/L)誘導(dǎo)降解2,4,6-TCP的功能菌屬富集，活性污泥耐受污染物沖擊的能力提高，故逐步提高進(jìn)水2,4,6-TCP濃度對污泥活性影響較小。已有的研究也證實，低濃度4-氯苯酚馴化的活性污泥耐受高濃度氯酚類污染物沖擊的能力更強(qiáng)[9]。因此，通過逐步提高進(jìn)水2,4,6-TCP濃度的方式馴化污泥可有效去除廢水中的2,4,6-TCP。

2.2 2,4,6-TCP對污泥中多糖和蛋白質(zhì)的影響

當(dāng)進(jìn)水2,4,6-TCP濃度為0，10，30和50 mg/L時，污泥中多糖含量分別為(23.3±1.82)，(34.2±1.34)，(31.5±3.15)和(42.9±0.54)mg/g(以污泥干重計，圖2)；蛋白質(zhì)含量分別為(47.2±1.6)，(67.8±0.97)，(100.4±1.27)和(104.4±2.43) mg/g (以污泥干重計,圖2)，即進(jìn)水中2,4,6-TCP濃度的提高致使污泥中多糖和蛋白質(zhì)含量增加，且蛋白質(zhì)含量顯著高于多糖，兩者的比值為1.98-3.19。這是因為微生物代謝過程中會分泌大量的多糖物質(zhì)包裹在污泥絮體表面，以抵抗2,4,6-TCP的毒性作用，蛋白質(zhì)在降解2,4,6-TCP和維持微生物活性方面等起到非常重要的作用[6]。下一步可考慮采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)深入分析廢水中不同濃度的2,4,6-TCP對污泥絮體中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和豐度的影響，以及不同類型蛋白質(zhì)在降解2,4,6-TCP過程中的功能。

圖2 不同進(jìn)水2,4,6-TCP濃度下的污泥絮體中多糖和蛋白質(zhì)含量Fig.2 Contents of polysaccharides and proteins in sludge flocs under different concentrations of influent 2,4,6-TCP

2.3 2.4.6-TCP對酶活性的影響

當(dāng)進(jìn)水2,4,6-TCP濃度為10，30和50 mg/L時，污泥中CAT的活性分別是未投加2,4,6-TCP時的1.58,1.87和2.50倍，DHA和SOD的活性則分別是未投加2,4,6-TCP時的1.32，1.71，1.82倍和1.16，1.37，1.75倍(圖3)，即進(jìn)水2,4,6-TCP濃度的提高誘導(dǎo)這3種酶的活性顯著提高。這是因為DHA活性的升高有助于降解去除2,4,6-TCP，而微生物在降解毒性有機(jī)物過程中會產(chǎn)生過量的氧自由基，CAT和SOD活性的升高則可清除自由基以達(dá)到維持微生物活性的作用[10]。已有的研究證實，CAT、SOD、過氧化物酶和還原型谷胱甘肽等共同構(gòu)成了生物體的保護(hù)酶系統(tǒng)，可避免廢水中有毒污染物引起生物體的蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過氧化、DNA損傷和質(zhì)膜系統(tǒng)破壞等現(xiàn)象的發(fā)生[10]。

圖3 不同進(jìn)水2,4,6-TCP濃度對酶活性的影響Fig.3 Effects of different concentrations of influent 2,4,6-TCP on enzyme activities

2.4 2,4,6-TCP對污泥中菌群結(jié)構(gòu)的影響

不同污泥中存在豐富的微生物菌屬，但菌群結(jié)構(gòu)和豐度顯著受到進(jìn)水2,4,6-TCP濃度的影響。當(dāng)活性污泥經(jīng)10 mg/L進(jìn)水2,4,6-TCP馴化且處于穩(wěn)定運(yùn)行階段末期時，部分菌屬顯著富集，即使進(jìn)水2,4,6-TCP濃度由10 mg/L提高至30和50 mg/L，優(yōu)勢菌屬的豐度無顯著降低(圖4)，這也再次證實經(jīng)低濃度進(jìn)水2,4,6-TCP馴化的活性污泥中降解2,4,6-TCP的功能菌屬顯著富集，2,4,6-TCP濃度的逐漸升高對菌群結(jié)構(gòu)影響較小，進(jìn)水2,4,6-TCP及其他有機(jī)物被快速降解去除(圖1)。

香農(nóng)指數(shù)可表征不同污泥中的微生物多樣性，香農(nóng)指數(shù)越大，其微生物多樣性越豐富[11]。條帶1-5的香農(nóng)指數(shù)分別為3.40，3.18，2.96，3.20和3.05。接種污泥取自市政廢水處理廠，污染物成分復(fù)雜，故污泥中不同類型微生物最豐富(條帶1)，而模擬廢水中污染物成分相對簡單，微生物多樣性出現(xiàn)明顯下降的現(xiàn)象(條帶2-4)。當(dāng)進(jìn)水2,4,6-TCP濃度由10 mg/L提高至30 mg/L且運(yùn)行至第4天時(條帶3)，微生物多樣性最低，推斷此階段耐受2,4,6-TCP毒性能力較差的菌屬死亡，而其他類型的功能菌屬還未充分富集所引起的。然而，當(dāng)處理進(jìn)水濃度為30 mg/L 2,4,6-TCP的SBR處于穩(wěn)定運(yùn)行階段末期時(條帶4)，其微生物多樣性比條帶3有明顯的升高。推斷進(jìn)水2,4,6-TCP誘使微生物分泌豐富的次級代謝產(chǎn)物，且2,4,6-TCP降解過程中產(chǎn)生多種代謝中間產(chǎn)物，此過程中降解次級代謝產(chǎn)物和氯酚類中間產(chǎn)物的菌屬富集，故微生物多樣性增加。當(dāng)進(jìn)水2,4,6-TCP濃度提高至50 mg/L且處于穩(wěn)定運(yùn)行階段末期時，微生物多樣性又出現(xiàn)下降(條帶5)，由圖4可以看出降解2,4,6-TCP的功能菌屬富集，所占的比例增加，而其他類型的菌屬豐度則因2,4,6-TCP的毒性作用降低直至消失。

條帶1：濃度10 mg/L，運(yùn)行4 d；條帶2：濃度10 mg/L，穩(wěn)定運(yùn)行階段末期；條帶3：濃度30 mg/L，運(yùn)行4 d；條帶4：濃度30 mg/L，穩(wěn)定運(yùn)行階段末期；條帶5：濃度50 mg/L，穩(wěn)定運(yùn)行階段末期Line 1:Concentration 10 mg/L,at the 4th d;line 2:Concentration 10 mg/L,at the end of stable operation;line 3:Concentration 30 mg/L,at the 4th d; line 4:Concentration 30 mg/L,at the end of stable operation; line 5:Concentration 50 mg/L,at the end of stable operation圖4 不同進(jìn)水2,4,6-TCP濃度下污泥中的菌群結(jié)構(gòu)變化Fig.4 Changes of microbial communities in sludge under different concentrations of influent 2,4,6-TCP

表2 不同進(jìn)水2,4,6-TCP濃度下的污泥戴斯相似性Table 2 Dice similarity of sludge under different concentrations of influent 2,4,6-TCP

3 結(jié)論

利用SBR工藝處理2,4,6-TCP濃度逐步提高的模擬廢水，探討2,4,6-TCP廢水處理過程對污泥性能和菌群結(jié)構(gòu)的影響，主要得到以下結(jié)論：

經(jīng)10 mg/L進(jìn)水2,4,6-TCP馴化的活性污泥能夠有效降解進(jìn)水COD和2,4,6-TCP。提高進(jìn)水2,4,6-TCP濃度為30和50 mg/L時，出水COD和2,4,6-TCP僅在SBR運(yùn)行初期有適當(dāng)提高，而后被快速降解，污泥性能基本不受影響。當(dāng)處理進(jìn)水濃度為10，30和50 mg/L 2,4,6-TCP的SBR處于穩(wěn)定運(yùn)行階段末期時，污泥絮體中的多糖和蛋白質(zhì)含量基本隨2,4,6-TCP濃度的增加而升高，蛋白質(zhì)含量顯著高于多糖。污泥中的酶活性(DHA、CAT和SOD)同樣隨2,4,6-TCP濃度的增加而升高。經(jīng)2,4,6-TCP馴化的活性污泥中降解2,4,6-TCP的功能菌屬顯著富集，雖然不同濃度的進(jìn)水2,4,6-TCP和不同的SBR運(yùn)行階段影響微生物多樣性，但不同污泥中的微生物菌屬均有一定的相似性。