左艷麗,竇 楠,李占濤,王娜琳,賈孟輝

(1.寧夏回族自治區(qū)銀川市第一人民醫(yī)院,寧夏 銀川 750001;2.寧夏醫(yī)科大學(xué),寧夏 銀川 750001)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是動脈內(nèi)膜發(fā)生脂質(zhì)、復(fù)合糖類積聚,纖維組織增生等形成斑塊,繼而動脈中層受累、出血或形成血栓,動脈管壁增厚變硬、失去彈性,管腔變窄[1]。目前,臨床多認(rèn)為與炎性反應(yīng)、內(nèi)膜受損、血流動力學(xué)改變等有關(guān),但仍無明確結(jié)論。因AS而導(dǎo)致的心腦血管疾病,如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦卒中等,已成為導(dǎo)致人類死亡的主要原因。西醫(yī)對于AS的藥物治療以調(diào)整血脂、抗血小板聚集、溶栓和抗凝及相應(yīng)的對癥治療藥物為主[2];外科以介入和手術(shù)治療為主,以期擴(kuò)張狹窄血管、恢復(fù)動脈血液供應(yīng)。

自噬是細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)、病理狀態(tài)等情況下,由自噬體與溶酶體結(jié)合后形成的自噬溶酶體,降解其包裹的老化、受損的蛋白質(zhì)成分,進(jìn)而完成細(xì)胞新陳代謝和自我更新,從而發(fā)揮抗AS的作用[3]。失荅剌知丸作為寧夏回族自治區(qū)少數(shù)民族醫(yī)藥的經(jīng)典復(fù)方,具有辛香溫通、截痰開結(jié)、逐水破瘀的療效,臨床上對缺血性疾病有一定療效[4-5],但是否對動脈粥樣硬化有效,仍不明確。因此,本研究復(fù)制動脈粥樣硬化大鼠模型,觀察失荅剌知丸對動脈粥樣硬化大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)表達(dá)的影響,探討其抗動脈粥樣硬化的作用和可能機(jī)制,現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與分組 SD大鼠,30只,雄性,SPF級,月齡2個月,體質(zhì)量(300±20)g,由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。30只大鼠隨機(jī)分為模型組、阿托伐他汀組、失荅剌知丸組,每組10只。

1.2 藥物與試劑 ①藥物:失荅剌知丸[柴胡31 g,黑訶子31 g,蘆薈62 g,延胡索(失荅剌知)6 g,石菖蒲6 g,番鹽6 g,藥西瓜(沙哈木罕荅里)9 g,松蕈(阿里公)9 g,安息香9 g,阿魏(撒額冰)9 g(后下),干姜9 g,蓽茇9 g,胡椒9 g,芥子9 g,蕓香9 g,巴豆霜9 g(先煎)]中除巴豆霜、安息香、阿魏外,其余藥物均在冷水中浸泡60 min,使用TC-15套式恒溫器加熱煎煮藥物;沸騰后調(diào)低功率,保持微沸狀態(tài)煎煮30 min,濾取煎液;藥渣再加入冷水浸泡30 min后煎煮,方法同前,濾取煎液;合并兩次煎液,將藥液于恒溫水浴鍋(100℃)內(nèi)濃縮至111.11 m L,濃度為2.088 g/m L,4℃保存?zhèn)溆谩＞S生素D3(DSM Nutritional Products Ltd.,注冊證號:H20171097)。阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司,生產(chǎn)批號:EY4677)。②試劑:BCA蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio PC0020);LC3-Ⅱ一抗(bioswamp,MAB37400);蛋白質(zhì) Marker(Thermo,26634);化學(xué)發(fā)光試劑(millipore,WBKLS0010)。

1.3 主要儀器 電泳儀(BIO-RAD,mini protean 3 cell);干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司,K30);高速冷凍離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司,iCEN-24R);石蠟切片機(jī)(Thermo);水浴鍋(Leica,HI1210);全自動化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能公司,Tanon-5200)。

1.4 造模與給藥 40只大鼠均飼喂高脂飼料(由2%膽固醇、5%豬油、10%蛋黃粉、83%基礎(chǔ)飼料組成)復(fù)制大鼠AS模型,腹腔注射維生素D3(按315萬U/kg),每日1次,共12周。造模開始第6、10、12周后隨機(jī)處死大鼠3只,檢驗造模情況,若主動脈彈性下降,內(nèi)膜增厚,肉眼可見脂質(zhì)斑塊,為造模成功。隨機(jī)分為3組,其中模型組10只,失荅剌知丸組10只,阿托伐他汀組10只。按上述分組灌胃給藥,給藥容積為100 g/m L(灌胃容積為100 g/m L,失荅剌知丸組每日給予2次灌胃,阿托伐他汀組給予每日1次灌胃),連續(xù)給藥8周。

2 觀察指標(biāo)

2.1 病理形態(tài)學(xué)觀察 取材:10%水合氯醛溶液(北京索萊寶科技有限公司,生產(chǎn)批號:EY4677,3 mL/kg)腹腔注射麻醉,分離主動脈,用10%多聚甲醛(中國雷葉生物公司,生產(chǎn)批號:0122A18)固定,經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋處理后按2μm切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察。

2.2 Western blot法檢測 自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ:大鼠麻醉后,冰上取主動脈,磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)沖洗,磨碎勻漿,裂解蛋白,離心取上清液,蛋白定量、變性,電泳分離,轉(zhuǎn)膜,室溫封閉,加入LC3-Ⅱ一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜,Western洗滌緩沖液(TBST)洗滌,加入二抗(bioeasy,BE0101),室溫孵育,TBST洗滌,用顯色觀察,計算灰度值。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,符合正態(tài)分布者采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)的最小顯差法檢驗;不符合正態(tài)分布者行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化后比較。檢驗標(biāo)準(zhǔn)取α＝0.05。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠主動脈病理形態(tài)學(xué)結(jié)果 模型組內(nèi)膜增厚,可見斑塊,斑塊的纖維帽破裂;阿托伐他汀組、失荅剌知丸組內(nèi)膜均稍有增厚,可見少量脂質(zhì)沉積,外膜基本完整。

3.2 Western blot法檢測結(jié)果 阿托伐他汀組、失荅剌知丸組LC3-Ⅱ表達(dá)均高于模型組,且失荅剌知丸組高于阿托伐他汀組,組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果見表1和圖1。

表1 3組動脈粥樣硬化模型大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ表達(dá)情況比較(±s)

表1 3組動脈粥樣硬化模型大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ表達(dá)情況比較(±s)

注:與模型組比較,△P＜0.05;與阿托伐他汀組比較,▲P＜0.05。

組別 只數(shù) LC3-Ⅱ相對表達(dá)量失荅剌知丸組 10 2.72±0.59△▲阿托伐他汀組 10 2.05±0.55△模型組 10 1.40±0.63

圖1 3組動脈粥樣硬化模型大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ表達(dá)情況比較

4 討論

AS的發(fā)生可能與肥胖、糖尿病、高血壓病、高脂血癥等有關(guān)[6],其可導(dǎo)致供血組織、器官缺血,而出現(xiàn)心絞痛、心肌梗死、腦梗死、腎功能損傷等疾病。斑塊中存在大量的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等,其中巨噬細(xì)胞可以通過自噬破壞斑塊。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過加工成為LC3-Ⅰ,當(dāng)自噬激活后,LC3-Ⅰ經(jīng)過加工、修飾,合成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ的相對表達(dá)量可反映自噬體的量,故LC3-Ⅱ是被廣泛用于檢測自噬體的分子標(biāo)記[7]。研究表明,自噬的發(fā)生可保護(hù)細(xì)胞,抗動脈粥樣硬化。在動脈粥樣硬化中巨噬細(xì)胞內(nèi)的溶酶體受損,而溶酶體具有抗動脈粥樣硬化的作用,自噬可以降低動脈平滑肌細(xì)胞的損傷,進(jìn)而產(chǎn)生抗動脈粥樣硬化的效能[8]。

中醫(yī)認(rèn)為,痰瘀阻絡(luò)、氣血不暢是AS發(fā)生的基本病因,寒、瘀為陰邪,易傷及陽氣,阻遏經(jīng)脈,痰瘀日久,固而不化,導(dǎo)致氣血陰陽運行不暢,輸布障礙,惡性循環(huán),則生疾病。心血不足,心脈瘀阻,氣血不暢,進(jìn)而導(dǎo)致心悸、胸痹諸癥;痰瘀阻滯,導(dǎo)致脈絡(luò)受損,氣機(jī)紊亂,氣血不能上榮頭面,而致眩暈、中風(fēng)等疾病發(fā)生?；刈遽t(yī)學(xué)認(rèn)為,在正常生理狀態(tài)下,白、紅、黃、黑4種體液處于動態(tài)平衡狀態(tài),當(dāng)某一種體液偏多或偏少時則發(fā)生疾病。如白液質(zhì)偏多,則寒濕偏重;黑液質(zhì)偏多,則干燥性寒,機(jī)體平衡、輸灌等活動受阻,淹腐為濁濕、黑血、痰飲等異常體液,以致形成病理產(chǎn)物停積于人體,進(jìn)而成為各種致病因素,外感內(nèi)傷誘發(fā)致病[9],故以辛香溫通、截痰開結(jié)、逐水破瘀為治則。方中石菖蒲、藥西瓜、松蕈、安息香、阿魏、干姜、蓽茇、胡椒、芥子性熱或溫,可助體內(nèi)之陽氣,以祛濕散寒;柴胡、延胡索理氣止痛,蘆薈、巴豆霜化瘀逐痰。全方共奏辛香溫通、截痰開結(jié)、逐水破瘀之功。研究表明,石菖蒲具有抗動脈硬化、降脂、抗炎的作用[10],安息香可行氣活血止痛[11];阿魏可治頭暈[12];蓽茇能顯著降低小鼠血清中總膽固醇含量,具有調(diào)血脂的作用[13];柴胡皂苷具有抗炎、抗氧化和降脂的作用[14];蘆薈凝膠對高脂肪飲食誘導(dǎo)的高血脂小鼠有顯著的降血脂作用[15]。

本研究觀察失荅剌知丸對動脈粥樣硬化模型大鼠自噬因子LC3-Ⅱ表達(dá)的影響,結(jié)果表明其能減小大鼠主動脈斑塊,減輕動脈粥樣硬化程度,提高LC3-Ⅱ表達(dá)水平,保護(hù)受損內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。綜上所述,失荅剌知丸可能成為抗動脈粥樣硬化的潛在治療藥物,誘導(dǎo)自噬發(fā)生可能成為動脈粥樣硬化的潛在靶點。